李 佳，齊祥明,

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266404；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266237；3.中國輕工業(yè)水產(chǎn)品生物加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266404）

蝦青素作為一種重要的類胡蘿卜素，具有強(qiáng)抗氧化性，因此作為功能性成分在保健食品的開發(fā)中應(yīng)用已久，商業(yè)價值很大[1-3]。然而，只在有限數(shù)量的生物材料中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)，其中蝦蟹殼內(nèi)的蝦青素含量往往過低（35～153 μg/g 濕重），且難以提取[4]。對比而言，雨生紅球藻具有的極高蝦青素積累能力（可高達(dá)細(xì)胞干重的4%～5%）更具備產(chǎn)業(yè)化前景[5]，因此該微藻近年來正逐漸成為天然蝦青素提取的主要原料[6]。

天然蝦青素比合成蝦青素更活躍、更安全，市場認(rèn)可度更高[6]?；谇拔乃鲈?，近年從雨生紅球藻中提取蝦青素的各種技術(shù)正不斷被開發(fā)[4,7-10]。這些技術(shù)的關(guān)鍵在于，通過各種物理（高壓均質(zhì)、超聲波、微波）、化學(xué)（水熱液化、酸處理、離子液體處理）或生物（酶裂解）手段，首先實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻的細(xì)胞破碎[7-8]，進(jìn)而提取得到純度較高的天然蝦青素產(chǎn)品。其中，物理方法因其工業(yè)可操作性更強(qiáng)而受到更多的關(guān)注[7]。從細(xì)胞破碎的機(jī)理來看，三種常見的物理方法中，微波是基于細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)對微波能的吸收，而達(dá)到破胞效果，在該過程中會產(chǎn)生大量的熱能，并致使胞內(nèi)溫度迅速升高，因此不適用于提取蝦青素等熱敏性物質(zhì)[7]。而超聲和高壓均質(zhì)的熱效應(yīng)相對較小，且試驗(yàn)操作簡單，更適合于雨生紅球藻中蝦青素的提取。

然而，各種形式的蝦青素（天然的或合成的；單體、單酯或雙酯）均表現(xiàn)出較差的水溶性和穩(wěn)定性，這大幅降低了其生物可利用性；且這些蝦青素容易被環(huán)境中的光和熱降解[11-12]。為提高蝦青素的水溶性、穩(wěn)定性和生物可利用性等應(yīng)用性能，研究者們通常會對合成的或提取自天然產(chǎn)物的蝦青素進(jìn)一步進(jìn)行物理或化學(xué)的改性[13-14]。其中，物理包封技術(shù)相對簡單、對活性物質(zhì)的保護(hù)良好，所獲得納米顆粒水分散效果好且生物可及性較高，因而具有更高的關(guān)注度[13]。

從以上內(nèi)容可以看出，目前具有較好利用性能的天然蝦青素產(chǎn)品往往需要以雨生紅球藻為原料，然后經(jīng)過提取和改性兩步制得[15]，過程繁瑣復(fù)雜、有機(jī)試劑殘留且成本較高。齊祥明等[16]和Zhang 等[17]率先報(bào)道在超聲協(xié)助下，以有機(jī)酸緩沖溶液通過一步法工藝制得水分散蝦青素，但其單次蝦青素釋放率僅為37.45%；多次釋放、分散后也僅達(dá)到68.05%，未能充分提取出雨生紅球藻原料中的天然蝦青素。有文獻(xiàn)表明，吐溫-20 可以較好地實(shí)現(xiàn)對純蝦青素的分散[18]。但利用超聲和吐溫-20 協(xié)同作用直接一步從雨生紅球藻獲得水分散蝦青素產(chǎn)品的工藝研究尚未見報(bào)道。

本研究以雨生紅球藻為原料，通過超聲輔助乳化劑（吐溫-20）進(jìn)行水分散蝦青素的一步法制備工藝的探索；并基于工藝探索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（乳化劑添加比例、超聲功率、料液比等對蝦青素分散效果的影響），探討了該工藝可能的過程機(jī)理；同時對所得的水分散蝦青素納米乳液進(jìn)行了基本化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的表征以及性能的簡單調(diào)查，為蝦青素的同步綠色、簡易、高效提取和性質(zhì)改良提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻（濕藻）云南綠A 生物有限公司提供，置于-20 ℃貯藏；吐溫-20 分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲基叔丁基醚 色譜純，德國Meker 公司；甲醇 色譜純，美國Tedia 公司。

JY92-II DN 超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JK-MSH-Pro-6B 磁力攪拌器上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀 日本Shimadzu 公司；FV1000 激光共聚焦電鏡 日本Olympus 公司；JSM-840 掃描電子顯微鏡日本電子株式會社；CGJB 均質(zhì)機(jī) 鄭州玉祥食品機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水分散蝦青素乳液的制備 如圖1 所示，稱取1 g 雨生紅球藻泥（水分含量為52.21%±0.92%）與20 mL 超純水、一定量吐溫-20 后充分混合，在超聲環(huán)境下處理30 min。樣品在4oC 以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，然后收集上清液，即得到水分散蝦青素乳液。

圖1 水分散蝦青素乳液制備流程圖Fig.1 Flow chart for preparation of water-dispersible astaxanthin emulsion

1.2.2 蝦青素含量的測定 所得水分散蝦青素乳液中蝦青素含量的測定參照Zhang 等[17]的方法，使用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行。

雨生紅球藻中的全部蝦青素含量測定：取1 g 雨生紅球藻藻泥與20 mL 超純水充分混合后超聲環(huán)境下處理30 min，用甲醇:三氯甲烷為3:1（v/v）萃取其中的蝦青素至樣品無色。使用高效液相色譜法測定有機(jī)試劑中的蝦青素含量。基于水分散蝦青素乳液中蝦青素含量和雨生紅球藻中全部蝦青素的含量可求得分散率：

其中，m1為水分散蝦青素乳液中的蝦青素含量，mg；m2為雨生紅球藻中的全部蝦青素含量，mg。由此可知，本工藝中的分散率同時也是藻內(nèi)蝦青素釋放到胞外的釋放率，等同于蝦青素提取工藝中的提取率。

參照Tofani 等[19]的方法，通過ABTS+自由基清除率測定水分散蝦青素乳液的抗氧化能力。水分散蝦青素對ABTS+自由基的清除率按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中，A1是樣品與ABTS+自由基反應(yīng)后的吸光值；A2是樣品本身的吸光值；A0：空白組的吸光值。

參照袁巧月等[20]的方法測定乳液中顆粒的平均粒徑和Zeta 電位。

1.2.3 水分散蝦青素制備工藝探索

1.2.3.1 吐溫-20 添加量的影響 參照圖1 的步驟，在600 W 超聲功率下，料液比（雨生紅球藻與超純水的比例）1:20 g/mL 時，考察乳化劑不同添加量（0、100、150、200、400、600、800 和1000 μL）對工藝過程的影響。

1.2.3.2 超聲功率的影響 在吐溫-20 添加量為200 μL，料液比1:20 g/mL 時，考察不同超聲功率（200、300、400、500 和600 W）對工藝過程的影響。

1.2.3.3 料液比的影響 在吐溫-20 添加量為200 μL，超聲功率600 W 時，考察不同料液比（1:10、1:20、1:30 和1:40 g/mL）對工藝過程的影響。

1.2.4 水分散蝦青素乳液的形成原理探究

1.2.4.1 超聲處理和高壓均質(zhì)處理對雨生紅球藻破胞效果的影響 將1 g 藻泥與20 mL 超純水充分混合，分別作600 W 超聲處理30 min 和60 MPa 高壓均質(zhì)處理一次，用甲醇-三氯甲烷（1:2，v/v）提取其中的蝦青素。在蝦青素提取前后分別取混勻的樣品稀釋10 倍，在400 倍放大倍數(shù)下進(jìn)行對比觀察，并參考Thunyaporn 等[21]的方法，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行破胞率的計(jì)數(shù)。其中，未處理的雨生紅球藻作為對照。

使用掃描電子顯微鏡對未處理和接受30 min 600 W 超聲處理后的雨生紅球藻進(jìn)行形態(tài)分析。在檢測之前，樣品先經(jīng)真空冷凍干燥處理36 h（冷阱溫度-60oC，真空壓強(qiáng)1 Pa）。

1.2.4.2 不同處理方式對蝦青素分散效果的影響為了研究提高蝦青素分散率的方法，采用單純超聲、單純高壓均質(zhì)、超聲后加吐溫-20、超聲協(xié)助吐溫-20 和高壓均質(zhì)協(xié)助吐溫-20 分別處理雨生紅球藻。稱取1 g 雨生紅球藻泥與20 mL 超純水充分混合，分別經(jīng)過上述處理后，以4oC，8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min，然后收集上清液，并測定其中蝦青素含量。其中，超聲處理?xiàng)l件為：在600 W 超聲環(huán)境下處理30 min；高壓均質(zhì)處理：在60 MPa 環(huán)境下處理；超聲后加吐溫-20：在600 W 超聲環(huán)境下處理30 min破胞，然后加入200 μL 吐溫-20 混勻；超聲協(xié)助吐溫-20 處理：藻液加入200 μL 吐溫-20 充分混合后在600 W 超聲環(huán)境下處理30 min；高壓均質(zhì)協(xié)助吐溫-20 處理：藻液加入200 μL 吐溫-20 充分混合后在60 MPa 環(huán)境下處理。

1.2.5 水分散蝦青素的表征

1.2.5.1 化學(xué)成分分析 水分散蝦青素溶液中的多糖含量采用以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的蒽酮-硫酸法進(jìn)行測定[22]。將1 mL 水分散蝦青素溶液和4 mL 蒽酮-硫酸溶液（3.3 mg/mL）劇烈混合，在95 ℃下反應(yīng)7 min。然后在580 nm 處測量吸光度。水分散蝦青素的蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測定[23]。水分散蝦青素中的脂類含量是用氯仿和甲醇通過重量法來測定的[24]。核酸含量參照齊祥明等[16]的方法，使用定磷法測定。

1.2.5.2 脂肪酸組成成分分析 參照Damiani 等[25]報(bào)道的方法并做了部分修改，在脂肪提取吹干后進(jìn)行脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，連接回流冷凝器，80 ℃水浴上回流，直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7 mL 5%三氟化硼甲醇溶液，在8±1 ℃水浴中繼續(xù)回流2 min。用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱，從水浴上取下燒瓶。迅速冷卻至室溫。加入10 mL 正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液大約5 mL，至25 mL 試管中，加入大約3～5 g 無水硫酸鈉，振搖后靜置5 min，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待測。使用配備了SP-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）柱的氣相色譜儀在260 ℃的溫度下進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)利用GC 軟件進(jìn)行積分，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量計(jì)算。

1.2.5.3 激光共聚焦掃描顯微鏡分析 使用配備10 倍目鏡和60 倍油浸物鏡的激光共聚焦掃描顯微鏡在激發(fā)波長為488 nm 的熒光模式下對乳劑的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。乳液中的油相用尼羅紅溶液（1 mg/mL 乙醇）染色。

1.2.5.4 差示掃描量熱分析 參照Liu 等[26]報(bào)道的方法，使用熱分析儀進(jìn)行差示掃描量熱（Differential scanning calorimetry，DSC）分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Origin 2018 軟件繪制圖形，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。采用SPSS 19.0 軟件對組間差異性進(jìn)行分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步法制備水分散蝦青素乳液工藝探索

直接從雨生紅球藻中提取并一步制備水分散蝦青素乳液的工藝探索結(jié)果如圖2 所示。圖2A、圖2D 和圖2G 的結(jié)果顯示在吐溫-20 體積為200 μL、超聲功率為600 W、料液比為1:20 g/mL 時，蝦青素的分散率最高，可達(dá)98.41%。

圖2 不同乳化劑添加量、超聲功率和料液比對蝦青素分散率、自由基清除率以及蝦青素乳液的平均粒徑和Zeta 電位的影響Fig.2 Effects of different emulsifier addition,ultrasonic power and material-to-liquid ratio on astaxanthin dispersion rate,free radical scavenging,and average particle size and Zeta potential of astaxanthin emulsions

如前言所述，之前文獻(xiàn)可見的由雨生紅球藻經(jīng)一步法制備水分散性蝦青素的報(bào)道里，單次蝦青素釋放率僅為37.45%[16]（如1.2.2 所述，該研究和本文中的蝦青素釋放率即分散率，等同于單純蝦青素提取工藝中的提取率）。本研究采用超聲協(xié)助吐溫-20 的方法，蝦青素分散率得到了實(shí)質(zhì)性提高（98.41%），已達(dá)到甚至超過了大多數(shù)單純的蝦青素提取工藝的提取率（2%～99%）[4,9-10]。

系列探索性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，乳化劑添加量（圖2A、圖2B）對這一工藝過程中蝦青素的分散率有顯著的影響（P<0.05）。當(dāng)在20 mL 溶液體系中加入200 μL 吐溫-20 時，分散到乳液體系中的蝦青素量最高（98.41%）。在更高或更低的吐溫-20 添加量下，蝦青素的分散度均不夠理想。圖2B 中ABTS+自由基清除率結(jié)果的變化趨勢和圖2A 大致相似，也在吐溫-20 添加量為200 μL 時達(dá)到了最高。這一方面進(jìn)一步證明了200 μL 吐溫-20 添加量對蝦青素的充分分散最適宜；另一方面顯示，吐溫-20 添加量的不同對所制備水分散蝦青素的抗氧化活性影響較小。

不同功率的超聲處理具有不同的細(xì)胞破壞作用[10]，圖2D、圖2E 也顯示了這一規(guī)律：隨超聲功率的增加，蝦青素分散率顯著增加（P<0.05）。在600 W超聲功率的處理下，分散到乳液體系中的蝦青素量已接近理論最高值100%。因此，基于降低能耗和熱效應(yīng)的目的，未再考察更高的超聲功率。與蝦青素分散趨勢不盡相同的是，圖2E 顯示的自由基清除率增加幅度較小。這可能是由于包封處理使得蝦青素的抗氧化活性具有一定的緩釋效應(yīng)[27]，導(dǎo)致在較短時的測試中，蝦青素的抗氧化性未完全釋放。

和梁康琳[9]的研究相似，在本實(shí)驗(yàn)中，料液比同樣是影響一步法制備水分散性蝦青素的顯著因素。圖2G 和圖2H 顯示，當(dāng)料液比為1:20 g/mL 時，蝦青素的分散率最高。當(dāng)料液比低于或高于該比例時，蝦青素分散效果都會顯著降低（P<0.05）。

此外，在最佳乳化劑添加量和超聲功率下，本實(shí)驗(yàn)得到的水分散蝦青素顆粒平均粒徑為115.55 nm，而其他條件下顆粒往往更大；Zeta 電位在此條件下為-23.35 mV，而其他條件下則基本在-16.85～-28.05 mV 內(nèi)波動。與Shen 等[28]研究（通過超聲協(xié)助吐溫-20 在水中包封溶于中鏈三?；视偷奈r青素，其粒徑為193.87±3.84 nm，Zeta 電位-7.10 mV）相比，本研究用一步法獲得的水分散蝦青素的粒徑更小，Zeta 電位絕對值更高，這表明該乳液具有高穩(wěn)定性[28]。

2.2 水分散蝦青素一步法制備工藝過程機(jī)理探究

基于上述探索性實(shí)驗(yàn)，研究組認(rèn)為，超聲協(xié)助和吐溫-20 的添加是一步法制備水分散性蝦青素不可缺少的兩個條件。在這類研究中，通常認(rèn)為超聲的主要作用是破碎[10,28]，而吐溫則用來具體實(shí)現(xiàn)蝦青素的包封[18,28]。因此，下文將對比研究破胞效果更好的高壓均質(zhì)手段能否替代超聲，并進(jìn)一步揭示超聲輔助吐溫-20 一步法制備水分散蝦青素的工藝過程機(jī)理。

2.2.1 超聲與高壓均質(zhì)破胞作用差異分析 圖3 顯示了超聲和高壓均質(zhì)處理對雨生紅球藻細(xì)胞破壞作用的差異。

圖3 光鏡觀察雨生紅球藻的狀態(tài)圖（400×）Fig.3 Light microscopic observation of the state graphs of Haematococcus pluvialis (400×)

對比圖3b 和圖3e 可以發(fā)現(xiàn)，超聲的破胞效率明顯不如高壓均質(zhì)。然而進(jìn)一步對兩樣品中蝦青素采用有機(jī)溶劑提取，結(jié)果顯示，破胞率僅為51.35%（血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)結(jié)果）的超聲處理樣品也和破胞率97.3%的高壓均質(zhì)樣品一樣，其中蝦青素都會被完全提?。▓D3c、圖3f）。進(jìn)一步以高壓均質(zhì)的蝦青素提取率為參照，測定得超聲處理的蝦青素提取率為101.05%。

據(jù)此推測，在超聲處理下，很多保持相對完整形態(tài)的細(xì)胞可能已經(jīng)出現(xiàn)了漏洞，因?yàn)槌暰哂幸鹜牧骱图羟袘?yīng)力進(jìn)而推動細(xì)胞內(nèi)含物外流的作用[29]。圖4 給出的掃描電鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步支撐了這一推測：經(jīng)超聲處理后的雨生紅球藻細(xì)胞表面開始出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞內(nèi)含物釋放痕跡明顯，且超聲功率越大，釋放物越多。

圖4 掃描電鏡觀察到的雨生紅球藻的細(xì)胞狀態(tài)圖Fig.4 Scanning electron microscopy images of the cellular state of Haematococcus pluvialis

對于破胞率更高的高壓均質(zhì)是否可以替代超聲完成一步法制備水分散蝦青素，研究組首先對未加乳化劑的高壓均質(zhì)樣品也進(jìn)行了離心分離的嘗試，結(jié)果顯示，經(jīng)同樣的離心條件后，上清液呈渾濁狀態(tài)，很難實(shí)現(xiàn)分離。估計(jì)這和細(xì)胞碎片過小有關(guān)（圖3e、圖3f）。文獻(xiàn)顯示，該均質(zhì)條件下獲得的顆粒往往在百納米到微米級別[30]，與圖3e、圖3f 所示結(jié)果吻合。而吐溫-20 形成的包封物粒徑往往也是在百納米范圍內(nèi)[31]。因此，從這一方面來說，預(yù)計(jì)高壓均質(zhì)替代超聲實(shí)現(xiàn)一步法制備水分散性蝦青素將不可避免含有很多難分離的細(xì)胞碎片等。

2.2.2 超聲、高壓均質(zhì)對蝦青素分散的作用 圖5的結(jié)果顯示單純的高壓均質(zhì)處理后，蝦青素的分散率為4.76%，單純的超聲處理后蝦青素的分散率為9.21%。這說明，單純高壓均質(zhì)和超聲等物理作用很難實(shí)現(xiàn)蝦青素的分散。進(jìn)一步在超聲之后加入吐溫-20，結(jié)果顯示，水分散蝦青素的獲得量有一定提高（21.49%），但仍處于較低水平。這說明超聲在協(xié)助吐溫形成水分散蝦青素方面，同樣有著重要作用。數(shù)據(jù)顯示，高壓均質(zhì)協(xié)助吐溫-20 同樣可以獲得較高的分散率（89.82%），但仍顯著低于超聲協(xié)助吐溫-20 獲得的蝦青素分散率（P<0.05）。且因高壓均質(zhì)協(xié)助吐溫-20 分散的樣品中存在大量難分離細(xì)胞碎片，很難獲得超聲處理后相似的半透明溶液（均勻納米乳液的特征）。因此，超聲協(xié)助吐溫-20 分散蝦青素工藝更具有工業(yè)化前景。

圖5 高壓均質(zhì)、超聲、超聲+吐溫-20、高壓均質(zhì)協(xié)助吐溫-20 和超聲協(xié)助吐溫-20 處理與蝦青素分散率的關(guān)系Fig.5 Relationship between high pressure homogenization,ultrasonication,ultrasonication+Tween-20,high pressure homogenization-assisted Tween-20 and ultrasound-assisted Tween-20 treatments and astaxanthin dispersion rate

2.2.3 一步法制備水分散蝦青素中超聲協(xié)同吐溫-20 的作用分析 基于以上內(nèi)容，本研究組推測，在協(xié)助吐溫-20 從雨生紅球藻原料中一步法獲得蝦青素的工藝中，超聲首先通過對細(xì)胞內(nèi)容物的作用實(shí)現(xiàn)了對藻細(xì)胞的有限破壞（參見文獻(xiàn)[10]和圖3b、圖3c；圖4b、圖4c）；然后吐溫-20 在超聲的作用下分別對仍在胞內(nèi)和釋放到胞外的蝦青素進(jìn)行包封。此時超聲在微觀尺度層面所具有的促進(jìn)傳質(zhì)能力[7]對協(xié)助吐溫-20 實(shí)現(xiàn)蝦青素的包封具有重要意義，超聲處理后再加吐溫-20 的蝦青素分散結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該推測。相比于高壓均質(zhì)處理，超聲處理對藻細(xì)胞的有限破壞給后續(xù)的水分散蝦青素乳液與藻渣、甚至殘余藻油的分離帶來方便。

2.3 水分散蝦青素的表征

2.3.1 主要成分分析 如表1 所示，本研究所得水分散蝦青素中蝦青素含量高達(dá)43.82%，遠(yuǎn)高于齊祥明等[16]獲得的一步法制備產(chǎn)品；而且，這一數(shù)值也遠(yuǎn)高于使用純蝦青素封裝的蝦青素含量（約3.0%）[32-33]。這充分展示了這一工藝和產(chǎn)品的優(yōu)越性。

表1 水分散蝦青素乳液的主要成分Table 1 Main compositions of water-dispersion astaxanthin emulsions

進(jìn)一步分析表1 結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，在本文和梁康琳等[9,15]的一步法工藝中，實(shí)現(xiàn)包埋蝦青素的同時均包埋了一定量的脂類物質(zhì)。兩種樣品中蝦青素占脂類物質(zhì)總量的比例接近，分別為57.91%和65.24%。結(jié)合文獻(xiàn)中雨生紅球藻蝦青素和脂質(zhì)含量的數(shù)據(jù)[34]，不難發(fā)現(xiàn)，兩個工藝過程中，溶于脂滴的蝦青素均被選擇性地富集包封了。而本研究所開發(fā)工藝中，殘余藻渣已不再能提取出蝦青素，這保留了其余藻油的再提取可能性。

此外，本研究所得樣品中雖然也含有一定量的蛋白質(zhì)和多糖，但明顯遠(yuǎn)低于齊祥明等[16]的樣品。這說明，在本工藝中，吐溫-20 替代了齊祥明等工藝中蛋白質(zhì)、多糖乃至核酸的包封作用。這可能也是本工藝中蝦青素釋放率大大增加的原因所在。另外，圖2C、圖2F 和圖2I 的數(shù)據(jù)顯示，本研究所獲水分散蝦青素顆粒的Zeta 電位絕對值明顯高于文獻(xiàn)中單純的吐溫-20 包封[28]，可能也和其中含有一定量蛋白質(zhì)、多糖等荷電物質(zhì)有關(guān)。

2.3.2 脂肪酸分析 從表1 數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻中的脂質(zhì)并未被完全包封到水分散蝦青素的納米顆粒中，表2 進(jìn)一步顯示了被包封的脂質(zhì)與雨生紅球藻中原脂質(zhì)在脂肪酸組成上的不同。表2 中數(shù)據(jù)顯示，水分散蝦青素中脂肪酸組成的不同在于飽和脂肪酸C12:0 異常的大幅度增高。結(jié)合吐溫-20 具有12 碳的脂肪鏈結(jié)構(gòu)，研究組認(rèn)為，這些被選擇性包封的飽和脂肪酸C12:0 將可能因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)的相似性而與吐溫-20 有序地排列于脂滴表面，降低被包封脂滴的表面張力[35-36]。圖2C、圖2F 和圖2I 的數(shù)據(jù)顯示，本研究所獲水分散蝦青素顆粒粒徑明顯低于文獻(xiàn)中純吐溫-20 包封純蝦青素的顆粒粒徑[28]，可能也與此有關(guān)，這比文獻(xiàn)中單純借助吐溫-20 來降低脂滴表面張力明顯效果更好[35-36]。

表2 水分散蝦青素乳液中的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of water-dispersed astaxanthin emulsions

此外，表2 結(jié)果顯示，被包封的不飽和脂肪酸量明顯偏低，這可能與它們的結(jié)構(gòu)有序性較低有關(guān)（與吐溫-20 結(jié)構(gòu)相似性低，將不利于降低表面張力[36]）。另一方面，這意味著殘存的未被包封的藻油中將含有更高比例的不飽和脂肪酸，利于殘余藻油的再提取。

2.3.3 激光共聚焦電鏡分析 圖6 顯示了添加與不添加吐溫-20 所獲得水分散蝦青素的微觀狀態(tài)。從圖中可以看出，添加吐溫-20 后獲得的含油顆粒大而且多。吐溫-20 會使分散顆粒有能力包封更多的脂質(zhì)[36]，這可能是形成顆粒粒徑更大的原因所在。相較而言，梁康琳等[9]、齊祥明等[16]未加吐溫-20 所獲得的顆粒粒徑更小（40～100 nm）。

圖6 激光共聚焦電鏡觀察無乳化劑的蝦青素分散液（a）和水分散蝦青素乳液（b）（600×）Fig.6 CLSM observation of astaxanthin dispersion without emulsifier (a) and water-dispersible astaxanthin emulsion (b) (600×)

2.3.4 DSC 分析 圖7 給出的游離蝦青素和本研究制備水分散蝦青素DSC 曲線對比顯示，游離蝦青素在229 ℃附近有晶體的降解特征熱吸收峰[37]（圖6a）；而本研究中所得樣品不具備此熱吸收峰（圖6b）。這表明，該樣品中的蝦青素完全為非晶態(tài)[26]。文獻(xiàn)表明[38]，無定形非晶態(tài)蝦青素將更利于溶解，從而顯著改善難溶性藥物的口服生物利用度。

圖7 游離蝦青素（a）和水分散蝦青素（b）的DSC 曲線Fig.7 DSC curves of free astaxanthin (a) and water-dispersed astaxanthin (b)

綜合以上水分散蝦青素樣品的表征數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，本研究所得樣品較純蝦青素包封樣品具有更合理和高效的包封機(jī)制，因而將具有更高的穩(wěn)定性（粒徑更小、Zeta 電位絕對值更高）和生物利用度（所包封的全為非晶型蝦青素）。

3 結(jié)論

本文研究了超聲輔助吐溫-20 從雨生紅球藻中分散、釋放蝦青素從而一步制備水分散蝦青素乳液的方法，所得結(jié)論如下：乳化劑添加量、超聲功率、料液比均對該過程有極顯著影響。在料液比1:20 g/mL、乳化劑添加量200 μL、超聲功率600 W 的條件下，雨生紅球藻中蝦青素分散、釋放的比率可達(dá)98.41%。其中，在該一步法制備過程中超聲處理具有破胞和協(xié)助吐溫-20 分散的雙重作用。超聲對細(xì)胞的有限破碎作用保證了蝦青素的釋放，同時為后續(xù)水分散蝦青素的獲取提供了方便，明顯比高壓均質(zhì)更具工業(yè)化潛力。

水分散蝦青素成分分析結(jié)果顯示：其中富集有43.82%的蝦青素；被選擇性包封的脂質(zhì)里飽和脂肪酸（尤其是C12:0）偏高。其他表征數(shù)據(jù)顯示：乳液顆粒平均粒徑為115.55 nm；Zeta 電位為-23.35 mV；被包封蝦青素為無定形非晶態(tài)，表明所得樣品具有較高的水溶穩(wěn)定性和生物利用度。

綜上，本文開發(fā)的超聲輔助吐溫-20 一步法制備水分散蝦青素乳液工藝為直接從雨生紅球藻中獲得蝦青素產(chǎn)品提供了一種綠色可行方案。該方案簡便、高效；所得產(chǎn)品部分性能優(yōu)于純蝦青素包封的產(chǎn)品，同時該工藝保留了進(jìn)一步提取殘余藻油的可行性，具有較高的工業(yè)化利用前景。