王強(qiáng)州， 潘詩雨， 方夢雅， 李微， 王佳興， 劉茵茵， 陳世豪*

（1.揚(yáng)州大學(xué)表觀遺傳學(xué)與表觀基因組學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 3.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125）

甲基胞嘧啶雙加氧酶2 (tet methylcytosine dioxygenase 2，TET2)是雙加氧酶家族的成員之一，作為細(xì)胞中重要的DNA 去甲基化酶，催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），在細(xì)胞基因組表觀遺傳學(xué)中起著重要調(diào)控作用[1-2]。近年來，TET2在免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)控中的作用逐漸被認(rèn)識，成為免疫學(xué)研究熱點(diǎn)之一。TET2 對于T 細(xì)胞和B 細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)的維持以及相關(guān)免疫因子的激活具有重要的調(diào)控作用[3-5]。TET2作為啟動天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中被CXXC5 招募至TLR7/9 啟動子并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，啟動一系列免疫級聯(lián)反應(yīng)，激活天然免疫應(yīng)答[6]。小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞中敲除TET2 蛋白，其Toll-like 受體信號傳遞受阻[7]，表明TET2與Toll-like受體信號通路密切相關(guān)。本團(tuán)隊前期研究證實，DNA 甲基化參與調(diào)控雞的抗病毒天然免疫反應(yīng)[8]，而雞TET2 作為去甲基化過程的關(guān)鍵蛋白，對天然免疫的調(diào)節(jié)作用很大程度上未知。雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1 是自發(fā)永生化形成的細(xì)胞系[9]，是研究雞天然免疫調(diào)控機(jī)制的理想細(xì)胞系。因此，構(gòu)建穩(wěn)定的TET2敲除的雞胚成纖維細(xì)胞系，可為進(jìn)一步研究雞TET2在天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用提供可靠的體外細(xì)胞模型。

CRISPR-Cas9 是新一代基因編輯技術(shù)，通過人工設(shè)計的向?qū)gRNA，引導(dǎo)Cas9 核酸酶在基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向編輯，包括基因敲除（knockout）、敲入（knockin）[10-11]。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞敲除、基因篩選、基因治療、分子育種等領(lǐng)域，尤其在構(gòu)建敲除細(xì)胞或敲除動物模型方面具有不可替代的作用，也為動植物的分子育種提供了新的技術(shù)與思路[12-13]。本研究利用CRISPRCas9 技術(shù)構(gòu)建敲除TET2基因的雞胚成纖維細(xì)胞系，通過靶向干預(yù)TET2基因的表達(dá)，為進(jìn)一步探索雞TET2在天然免疫激活和消退中的功能及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1細(xì)胞和質(zhì)粒 雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1 源于美國ATCC，由本課題組傳代保存。非病毒載體Cas9-T2A-GFP 由本課題組通過MLM3613 Cas9質(zhì)粒（Addgene，#42251)改造而來，攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 標(biāo)簽[11]。pEX-A-U6-sgRNA購自Addgene（#65626)。

1.1.2試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；DL2000 DNA Marker、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit 購自諾唯贊生物科技股份有限公司（南京）；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，ExpressCast PAGE 彩色凝膠快速試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自新賽美生物科技有限公司；Triton X-100 和Proteinase K（20 mg·mL-1）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；亞甲基藍(lán)染色液(0.2%)購自北京索萊寶科技有限公司，用ddH2O 稀釋至0.02%；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo Free Plasmid Midi Kit 購自O(shè)MEGA 公司；BbsI限制性內(nèi)切酶、T7核酸內(nèi)切酶I (T7E I)購自NEB 公司；T4 連接酶購自Thermo Scientific 公司；HighGene 轉(zhuǎn)染試劑購自ABclonal公司；尼龍膜（正電荷）購自Whatman 生物公司；兔源TET2 多克隆抗體購自CST 公司；兔源Actin多克隆抗體購自ABclonal公司；兔源5hmC多克隆抗體購自Active Motif 生物公司；HRP 標(biāo)記親和純化羊抗兔IgG購自Abcam公司。

1.2 試驗方法

1.2.1靶向雞TET2 基因的sgRNA 設(shè)計 通過NCBI 在線數(shù)據(jù)庫檢索雞TET2基因組序列，NCBI登錄號為NM_001277794.3，其另一個剪切變體登錄號為XM_015276223.3。在2 個mRNA 的共有序列設(shè)計sgRNA，即把NM_001277794.3序列的第2 個外顯子，XM_015276223.3 序列的第3 個外顯子作為靶標(biāo)設(shè)計區(qū)域。利用sgRNA 在線設(shè)計工具（https://chopchop.cbu.uib.no/），按照CRISPRCas9靶點(diǎn)設(shè)計原則，設(shè)計4對針對TET2CDS 序列的sgRNA，且預(yù)測其在基因組內(nèi)無其他靶點(diǎn)。在靶序列正義鏈的5’端前部添加caccg，同時合成sgRNA互補(bǔ)的寡核苷酸，并在5’端添加aaac，3’端添加c，合成的正反向oligo DNA序列見表1。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 Sequences of sgRNA oligonucleotide

同時依據(jù)目的基因的序列，利用NCBI引物設(shè)計工具設(shè)計CRISPR-Cas9 敲除鑒定引物，并由蘇州金唯智生物科技公司合成。鑒定引物序列如下：TET2-ck1-F：CAATCTGCTATCCTGAGTGA和TET2-ck1-R：ATTGGAGATGCTTGGTGTT，用于檢測sgRNA-1 和sgRNA-2 位點(diǎn)；TET2-ck2-F：GCAGCACCCAGAAGAAAT和TET2-ck2-R：AGCAGGGAATCCATCTTTG 用于檢測sgRNA-3和sgRNA-4位點(diǎn)。

1.2.2靶向雞TET2 的sgRNA 載體的構(gòu)建 將合成的4 對反向互補(bǔ)的sgRNA oligo DNA 單鏈退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA。退火步驟如下，將正反向sgRNA 序列以100 mmol·L-1溶于ddH2O，配制以下體系：1 μL Forward oligo，1 μL Reverse oligo，2 μL 10× NEB buffer 2，16 μL ddH2O，置于100 ℃水，自然降溫至25 ℃左右即可。

將短雙鏈DNA 與經(jīng)BbsI 酶切后的質(zhì)粒pEXA-U6-sgRNA 連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂菌板后置于37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落，送蘇州金唯智生物科技公司測序鑒定，顯示4 對sgRNA 序列均正確插入sgRNA 表達(dá)質(zhì)粒，提示載體構(gòu)建成功，提取質(zhì)粒備用。

1.2.3sgRNA 切割效率的測定 DF-1 細(xì)胞鋪于6 孔板，待生長至80%密度，每個孔分別轉(zhuǎn)染4 μg的sgRNA 和Cas9-T2A-GFP 2 μg，不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照，轉(zhuǎn)染6 h 后換成含10% FBS 的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基，48 h 后收獲細(xì)胞，利用FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit 提取基因組DNA。

分別以TET2-ck1 和TET2-ck2 上下游引物，PCR擴(kuò)增sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3、sgRNA-4靶位點(diǎn)附近的DNA 片段。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：5× SF Buffer 10 μL，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1each) 1 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，無酶水32 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，30 個循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min 后，進(jìn)行退火。退火條件：95 ℃變性5 min，以0.1 ℃·s-1的速率降溫至25 ℃。將退火后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，用T7E1 酶37 ℃酶切2 h，其產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳，分析不同位點(diǎn)的sgRNA 引導(dǎo)Cas9 蛋白的切割效率。

1.2.4微量DNA 提取 待96 孔細(xì)胞長至80%~90%融合度，用胰酶消化并重懸細(xì)胞，一半繼續(xù)傳代培養(yǎng)，另一半用于DNA 提取，鑒定4 條sgRNA的切割效率。配制微量DNA 提取液：0.01 mol·L-1Tris pH 8，0.002 mol·L-1EDTA，0.2% Triton X-100，200 μg·mL-1蛋白酶K。

2 500 r·min-1離心收集微量細(xì)胞（>1 000個），加入50 μL 微量DNA 提取液，充分渦旋后置于56 ℃孵育3 h。孵育結(jié)束后，將樣本煮沸10 min用于滅活蛋白酶K。短暫離心，將樣本收集至管底，凍存至-20 ℃。在50 μL PCR 體系中，取10 μL 作為DNA模板。

1.2.5單克隆敲除細(xì)胞株篩選 選用Cas9 蛋白切割活性較高的靶點(diǎn)的sgRNA，用于制備TET2敲除的雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1。將DF-1 細(xì)胞鋪于6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞生長至70%融合度，按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在滅菌EP 管中加入sgRNA 質(zhì)粒4 μg 和Cas9-T2A-GFP 質(zhì)粒2 μg，與轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，室溫孵育10 min。將混合液逐滴加至培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基換成含10% FBS 的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h 后的DF-1 細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞分選，以獲得高表達(dá)GFP 基因的細(xì)胞。將獲得的GFP 陽性細(xì)胞通過有限稀釋法，在96 孔板中培養(yǎng)單細(xì)胞克隆，待亞克隆的細(xì)胞密度生長至80%時，將一半細(xì)胞用于提取DNA，另一半細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。采用微量DNA 提取法，通過PCR 擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列，送至蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行DNA 測序鑒定。

1.2.6Western blot 分析蛋白水平 將雞TET2敲除的DF-1細(xì)胞系與野生型DF-1細(xì)胞系分別鋪至6孔細(xì)胞板，待細(xì)胞密度長至90%左右時收獲細(xì)胞，裂解獲得蛋白，進(jìn)行Western blot 分析。簡要步驟如下：用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，冰上孵育30 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min。吸上清，通過BCA法測定蛋白含量。然后加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，99 ℃金屬浴加熱5 min，充分變性蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。230 mA 恒流條件下轉(zhuǎn)膜2.5 h。將膜用5%脫脂牛奶封閉緩沖液室溫封閉30 min。稀釋TET2（1∶1 000）和ACTIN (1∶2 000) 抗體，4 ℃孵育過夜。第2天，洗膜3 次后，用HRP 標(biāo)記親和純化羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育1 h 后，用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。最后置于蛋白印跡成像系統(tǒng)下觀察條帶。

1.2.7Dot blot分析方法 將雞TET2敲除的DF-1細(xì)胞系與野生型DF-1 細(xì)胞系分別鋪至6 孔細(xì)胞板，待細(xì)胞密度長至90 %左右時，收獲細(xì)胞，提取基因組DNA，進(jìn)行Dot blot 分析。基因組DNA 提取方法按照諾維贊FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit說明書進(jìn)行。

將DNA 梯度稀釋到200、100、50 μg·μL-1，99 ℃變性5 min后置于冰上迅速冷卻，放置10 min。然后，將不同含量水平的DNA各上樣2 μL到尼龍膜上，室溫干燥15 min后，置于80 ℃烘箱加熱固定1 h。將固定后的尼龍膜用5 %脫脂牛奶封閉緩沖液室溫封閉30 min。稀釋5 hmC（1∶1 000）抗體，置于4 ℃孵育過夜。第2 天，用TBST 緩沖液洗膜3 次后，室溫下用HRP 標(biāo)記親和純化羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，每次5 min。最后置于蛋白印跡成像系統(tǒng)拍照。拍照完成后，尼龍膜用TBST 緩沖液洗滌2 次后，置于0.02%亞甲基藍(lán)染色液染色K，用水漂洗后通過普通相機(jī)進(jìn)行拍照，獲得DNA上樣內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向雞TET2的sgRNA切割效率的測定

瓊脂糖凝膠電泳觀察目的基因片段被T7E1酶切割情況（圖1），結(jié)果可知sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3 出現(xiàn)被T7E1 酶切割的小片段，說明轉(zhuǎn)染這些sgRNA 后細(xì)胞基因組DNA 發(fā)生了編輯事件。其中，設(shè)計的sgRNA-2 引導(dǎo)Cas9 蛋白對靶標(biāo)序列表現(xiàn)出較高切割活性，經(jīng)T7E1酶切后的全長擴(kuò)增片段（520 bp）產(chǎn)生329和191 bp的片段，大小符合預(yù)期。由此，后續(xù)篩選單克隆細(xì)胞選取sgRNA-2進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 篩選單克隆敲除細(xì)胞株和測序鑒定結(jié)果分析

將篩選的單克隆細(xì)胞株提取基因組DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger 測序，測序結(jié)果與原始基因組序列進(jìn)行比對，確定具體突變位置及其突變序列（圖2），發(fā)現(xiàn)有1 株細(xì)胞（命名為DT-6）發(fā)生了堿基的缺失突變。TET2-sgRNA-2 切割位點(diǎn)如圖2 所示，DNA 雙鏈分別發(fā)生了2 和28 bp 的缺失，導(dǎo)致雞TET2基因移碼突變，轉(zhuǎn)錄提前終止，推測該DT-6細(xì)胞中TET2蛋白將失活。

2.3 TET2敲除細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化分析

由圖3 可知，與正常DF-1 細(xì)胞相比，TET2基因敲除的DT-6 細(xì)胞在形態(tài)上呈現(xiàn)較為明顯的差別，表現(xiàn)為形態(tài)多樣，較為飽滿，呈現(xiàn)無規(guī)則的菱形或雙錐形，原因可能是TET2敲除導(dǎo)致某些骨架蛋白或黏附蛋白等的表達(dá)受到影響。

2.4 敲除細(xì)胞TET2 蛋白水平分析

敲除細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行Western blot 驗證。結(jié)果如圖4 所示，相對于DF-1 細(xì)胞，敲除細(xì)胞系DT-6 中TET2 蛋白幾乎不表達(dá)，說明敲除TET2 的DF-1 細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.5 敲除細(xì)胞羥甲基化水平分析

TET2 維持細(xì)胞的羥甲基化（5hmC）水平，可以通過調(diào)控基因的羥甲基化水平控制相關(guān)基因的表達(dá)。本研究利用Dot blot 分析穩(wěn)定敲除細(xì)胞的羥甲基化水平，結(jié)果如圖5 所示，相對于正常DF-1 細(xì)胞，敲除細(xì)胞系DT-6 中5hmC 水平顯著下降。由此可見，TET2 是維持DF-1 細(xì)胞全基因組5hmC 水平的關(guān)鍵蛋白。

圖5 Dot blot檢測野生型和TET2敲除細(xì)胞的羥甲基化水平Fig. 5 Dot blot detected levels of hydroxymethylation（5hmC） in wild type and TET2 knockout cells

3 討論

已有研究表明，DNA甲基化抑制劑顯著增強(qiáng)雞胚成纖維細(xì)胞的抗病毒天然免疫反應(yīng)[9]，表明DNA甲基化修飾參與調(diào)控雞天然免疫反應(yīng)的激活。而羥甲基化酶TET2 是一種內(nèi)源性的DNA 去甲基化酶，對于調(diào)控DNA甲基化的平衡具有重要作用[14-15]。但TET2基因及其介導(dǎo)的羥甲基化修飾在雞抗病毒天然免疫反應(yīng)中的功能及其作用機(jī)制尚未明確。

CRISPR-Cas9 是新一代基因編輯技術(shù)，通過人工設(shè)計的sgRNA 來識別目的基因組序列，并引導(dǎo)Cas9 蛋白酶在原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif, PAM）區(qū)上游的3~8 堿基處切割目的DNA，形成雙鏈斷裂，從而啟動細(xì)胞內(nèi)的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制，造成基因敲除或敲入，最終達(dá)到對基因組DNA 進(jìn)行編輯的目的[16-17]。與上一代基因編輯技術(shù)，如鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)分子核酸酶（transcriptionactivation-like effector nucleases，TALEN）相比，CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)因操作簡單、編輯效率高、試驗周期短等特點(diǎn)被廣泛用于構(gòu)建各種細(xì)胞系和各種用途的動物疾病模型[17-18]。應(yīng)用CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建基因敲除的細(xì)胞也是禽類基因功能研究的重要手段之一。例如通過構(gòu)建雞TBK1 敲除的DF-1 細(xì)胞，分析了雞TBK1在抗病毒信號通路中的功能[19]。

雞TET2基因位于4號染色體，由11個外顯子和10 個內(nèi)含子組成，該基因也存在另一種剪接變體，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成。sgRNA的設(shè)計普遍共識是選擇靶基因的第1、第2外顯子區(qū)域，為保證能夠?qū)㈦uTET2蛋白徹底敲除失活，本研究選擇在雞TET2 基因的CDS 區(qū)的共有序列進(jìn)行sgRNA 靶點(diǎn)設(shè)計，與預(yù)期結(jié)果一致，該位點(diǎn)sgRNA可以完全敲除TET2基因。本研究還發(fā)現(xiàn)，TET2敲除后雞成纖維細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)變化。研究表明，TET2調(diào)控諸多發(fā)育相關(guān)的基因[20-21]，雞TET2還通過DNA去甲基化作用方式調(diào)節(jié)成肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)雞成肌細(xì)胞的分化[22]。本研究中，TET2敲除是否影響雞胚成纖維細(xì)胞骨架蛋白等基因表達(dá)造成細(xì)胞形態(tài)的變化，還有待進(jìn)一步驗證。

已有研究指出，TET2 對于T 細(xì)胞和B 細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)的維持以及相關(guān)免疫因子的激活具有重要的調(diào)控作用[3-6]，也是樹突狀細(xì)胞啟動天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，且與Toll-like 受體信號通路密切相關(guān)[7]。上述研究表明，TET2 與免疫細(xì)胞功能密切相關(guān)，且依賴其DNA 去甲基化的方式來發(fā)揮免疫調(diào)控作用。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除TET2基因后，DF-1 細(xì)胞全基因組5hmC 水平顯著下調(diào)，表明雞TET2對于維持細(xì)胞基因組羥甲基化水平具有重要作用。鑒于TET2 對免疫反應(yīng)的激活具有重要的作用，推斷TET2敲除后將顯著影響雞胚成纖維細(xì)胞天然免疫反應(yīng)的激活。

綜上所述，本研究在未引入抗性篩選基因的條件下獲得了TET2基因敲除的單克隆細(xì)胞株，不必考慮抗性基因的插入對目標(biāo)基因功能的影響，為其他類型細(xì)胞的篩選提供了適合的方法。本研究應(yīng)用CRISPR- Cas9 技術(shù)成功篩選獲得TET2基因敲除的雞胚成纖維細(xì)胞系（DT-6），為研究雞TET2的生物學(xué)功能提供可靠的體外模型，同時為在其他雞細(xì)胞系TET2的敲除提供了有效靶點(diǎn)。