◎ 鄒曉花，方瑞雪

（西部第三方檢測集團(tuán)（寧夏）有限公司，寧夏 銀川 750021）

本文旨在試析PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)在食品微生物檢測中的運(yùn)用策略。通過系統(tǒng)研究PCR 技術(shù)的原理、步驟和應(yīng)用案例，探討了如何選擇合適的微生物目標(biāo)、優(yōu)化前處理步驟、設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件，以提高食品微生物檢測的準(zhǔn)確性和效率。

1 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)

1.1 優(yōu)勢

①PCR 技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性，可以檢測微生物目標(biāo)的低濃度。由于PCR 反應(yīng)能夠擴(kuò)增目標(biāo)DNA 序列，即使微生物目標(biāo)在食品樣品中的濃度非常低，也能夠通過PCR 放大到足夠的數(shù)量進(jìn)行檢測。同時(shí)，通過正確設(shè)計(jì)引物和探針，可以確保PCR 反應(yīng)的特異性，只檢測特定的微生物目標(biāo)，避免誤報(bào)和交叉反應(yīng)。②PCR 能夠在短時(shí)間內(nèi)完成目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增和檢測。PCR 反應(yīng)的周期時(shí)間可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，有效提升食品微生物檢測速度，提供及時(shí)的結(jié)果。③PCR 技術(shù)可以通過前處理步驟去除樣品中的抑制物質(zhì)，并通過擴(kuò)增目標(biāo)DNA 的方法，克服復(fù)雜樣品的困難，提供更可靠的檢測結(jié)果[1]。

1.2 挑戰(zhàn)

①食品樣品的復(fù)雜性和多樣性，是PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中面臨的挑戰(zhàn)之一。不同食品樣品的成分和特性各不相同，可能導(dǎo)致樣品前處理和DNA 提取過程困難。②樣品中的抑制物質(zhì)和基質(zhì)干擾可能影響PCR 反應(yīng)的效果，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。因此，在PCR 技術(shù)中，檢測人員需要考慮抑制物質(zhì)的存在，并采取相應(yīng)措施減輕其影響，如優(yōu)化DNA 提取方法和使用特殊試劑來消除抑制物質(zhì)。③PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)要求，包括溫控設(shè)備、PCR儀器、核酸提取設(shè)備和引物設(shè)計(jì)軟件等。④PCR 技術(shù)需要熟練的試驗(yàn)操作和技術(shù)知識(shí)，以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和重復(fù)性[2]。

2 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的戰(zhàn)略應(yīng)用

PCR 技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具，已經(jīng)在食品微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。其在食品安全保障中的戰(zhàn)略性應(yīng)用，不僅可以提高檢測的靈敏度和特異性，還可以加速檢測過程，從而更好地滿足快速鑒定和檢測的需求。

2.1 靶標(biāo)選擇與設(shè)計(jì)策略

2.1.1 靶標(biāo)基因的重要性與選擇原則

在食品微生物檢測中運(yùn)用PCR 技術(shù)時(shí)，靶標(biāo)基因的選擇是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵因素。具體而言，靶標(biāo)基因作為PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)，在決定檢測靈敏度和特異性的同時(shí)，也影響著分析的可行性和實(shí)用性。合理選擇靶標(biāo)基因可以使PCR 技術(shù)更好地適應(yīng)不同食品樣品的微生物檢測需求。通常情況下，選擇在目標(biāo)微生物中具有高度保守性和特異性的基因片段作為靶標(biāo)是必要的。其中，保守性指的是基因在不同菌株中的序列保持相對穩(wěn)定，以確保在多樣的微生物群體中同樣能被擴(kuò)增；特異性是確保引物和探針僅與目標(biāo)微生物的基因序列匹配，避免與其他非目標(biāo)微生物的DNA 片段發(fā)生交叉反應(yīng)。作為一個(gè)成功的靶標(biāo)基因，16S rRNA 基因在大多數(shù)細(xì)菌中具有高度保守性，因此被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定。這一基因區(qū)段在細(xì)菌中扮演重要的生物學(xué)功能，其序列在不同菌株之間的變異性相對較小，使其成為微生物分類學(xué)和鑒定的理想選擇。

2.1.2 引物與探針設(shè)計(jì)的考慮因素

靶標(biāo)基因片段的交叉反應(yīng)，是在PCR 技術(shù)中需要謹(jǐn)慎考慮的重要問題之一。在食品微生物檢測中，可能存在多種微生物種類，其基因組中的某些片段可能相似，導(dǎo)致引物與非目標(biāo)微生物的DNA 產(chǎn)生交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，從而誤導(dǎo)檢測結(jié)果。因此，在選擇引物時(shí)，檢測人員需要特別關(guān)注其獨(dú)特性和特異性。其中，引物的獨(dú)特性和特異性可以通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行預(yù)測和分析。在引物設(shè)計(jì)的初期，檢測人員可以使用多序列比對分析，比較目標(biāo)微生物和非目標(biāo)微生物的基因序列，找到具有較高特異性的區(qū)域作為引物的擴(kuò)增目標(biāo)。探針設(shè)計(jì)應(yīng)考慮以下因素。①特異性結(jié)合：探針的序列應(yīng)該與引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特定區(qū)域相匹配，從而實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。這可以通過確保探針序列僅與目標(biāo)基因序列的特異性部分匹配來實(shí)現(xiàn)。②獨(dú)特性：與引物一樣，探針的序列應(yīng)該在目標(biāo)微生物和非目標(biāo)微生物中具有足夠的獨(dú)特性，以避免交叉反應(yīng)。生物信息學(xué)工具可以用來分析可能的交叉反應(yīng)情況。③標(biāo)簽的選擇：探針上的熒光標(biāo)簽和探針的修飾，對于檢測的靈敏度和特異性有影響。熒光標(biāo)簽應(yīng)具有穩(wěn)定性和高信號強(qiáng)度，以確保在PCR反應(yīng)中可靠地檢測到信號。

2.2 樣本處理與前處理策略

2.2.1 樣本來源與處理的挑戰(zhàn)

在食品微生物檢測中，樣本的來源和處理是影響PCR 技術(shù)應(yīng)用的重要因素之一。食品樣本的復(fù)雜性可能對PCR 的準(zhǔn)確性和靈敏度產(chǎn)生影響。不同食品類型的樣本可能包含不同的成分，如脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等，這些成分可能干擾PCR 反應(yīng)，影響檢測結(jié)果的可靠性。此外，食品樣本中可能還存在各種抑制因子，如多種化學(xué)物質(zhì)、酶抑制劑等，也可能阻礙PCR 擴(kuò)增的進(jìn)行。這些樣本復(fù)雜性帶來的挑戰(zhàn)需要在樣本處理過程中克服，以確保PCR 反應(yīng)的可靠性和準(zhǔn)確性。否則，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽性的結(jié)果，影響食品微生物檢測的準(zhǔn)確性[3]。

2.2.2 去除抑制因子的方法與策略

為了克服食品樣本中的抑制因子，樣本前處理過程至關(guān)重要。當(dāng)前，有多種方法和策略可以幫助減少抑制效應(yīng)，保障PCR 檢測的準(zhǔn)確性[4]。①使用特定的提取試劑盒：不同的提取試劑盒可以針對不同食品類型的樣本特性，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行核酸提取，以有效分離核酸，并去除一些抑制因子。②酶處理：酶的加入可以在核酸提取過程中分解一些抑制性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)酶、脂肪酶等，有助于減少抑制效應(yīng)，提高PCR 反應(yīng)的成功率。③離心：通過離心操作，可以將樣本中的固體顆粒沉淀，分離出液相，從而降低抑制性物質(zhì)的含量。④稀釋樣本：對于特別濃縮或含有高濃度抑制因子的樣本，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，從而降低抑制效?yīng)。⑤內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的使用：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)是已知的DNA 片段，與待測的目標(biāo)基因一起擴(kuò)增。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的存在可以幫助判斷PCR 反應(yīng)是否受到抑制，從而驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化策略

2.3.1 溫度循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化與穩(wěn)定性

PCR 反應(yīng)的溫度循環(huán)參數(shù)對于擴(kuò)增效率和產(chǎn)物特異性具有重要影響。①在PCR 過程中，溫度循環(huán)通過不同溫度階段的切換來實(shí)現(xiàn)DNA 的變性、退火和延伸。因此，優(yōu)化這些溫度循環(huán)參數(shù)可以顯著提高PCR 反應(yīng)的效率和準(zhǔn)確性。通過調(diào)整退火溫度，可以確保引物在目標(biāo)DNA 序列上結(jié)合的特異性。②延伸時(shí)間的優(yōu)化也至關(guān)重要。延伸時(shí)間應(yīng)足夠長，以確保DNA 聚合酶充分?jǐn)U增目標(biāo)序列，同時(shí)也應(yīng)避免過長的延伸時(shí)間，以免引起非特異性擴(kuò)增或引物的降解。③擴(kuò)增周期數(shù)的選擇取決于起始DNA 模板的初始濃度以及所需的擴(kuò)增量。適當(dāng)?shù)闹芷跀?shù)可以在不引起副產(chǎn)物的情況下達(dá)到足夠的擴(kuò)增。

2.3.2 反應(yīng)體系組成的調(diào)控與優(yōu)化

①PCR 反應(yīng)體系的組成是影響PCR 反應(yīng)效率和產(chǎn)物穩(wěn)定性的重要因素之一。合理的反應(yīng)體系組成可以確保引物和核酸模板之間的充分結(jié)合，以及酶的高效催化。在反應(yīng)體系中，核酸模板的濃度應(yīng)該處于合適的范圍內(nèi)，以確保擴(kuò)增的效率和特異性。引物和探針的濃度也需要經(jīng)過優(yōu)化，以避免過高或過低的濃度對反應(yīng)的影響。②反應(yīng)體系中，緩沖液的選擇和濃度影響pH 值的穩(wěn)定，從而影響酶的活性。適當(dāng)添加酶抑制劑可以防止酶在PCR 反應(yīng)開始前不受控制的活性，從而保證反應(yīng)的穩(wěn)定性[5]。

2.4 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解釋策略

2.4.1 分析PCR 產(chǎn)物的方法與工具

當(dāng)前，有多種方法和工具可以用于分析PCR 產(chǎn)物。①凝膠電泳是一種常用的分析方法，通過將PCR 產(chǎn)物在凝膠中進(jìn)行電泳分離，可根據(jù)產(chǎn)物的大小判斷PCR擴(kuò)增是否成功。然而，凝膠電泳能夠提供關(guān)于PCR 產(chǎn)物大小的信息，但無法進(jìn)行定量分析。②毛細(xì)管電泳是一種高效分離和定量分析PCR 產(chǎn)物的方法。它通過在毛細(xì)管中進(jìn)行電泳分離，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的大小和電荷來分析樣品。③實(shí)時(shí)熒光PCR 是一種廣泛應(yīng)用于PCR 分析的技術(shù)。它可以提供實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR 產(chǎn)物積累量的信息，通過熒光信號的強(qiáng)度來反映目標(biāo)基因的豐度。實(shí)時(shí)熒光PCR 可以用于定量分析，計(jì)算閾值周期數(shù)（Ct 值），從而比較不同樣本中目標(biāo)基因的數(shù)量。④數(shù)據(jù)分析工具和軟件，在PCR 產(chǎn)物分析中扮演著重要角色。這些工具可以用于解釋實(shí)時(shí)熒光PCR 的結(jié)果，繪制熒光曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Ct 值以及進(jìn)行樣品間和批次間的比較與分析。

2.4.2 結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

為了確保PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需要進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證步驟。①陽性和陰性對照樣本：陽性對照樣本可以包含已知目標(biāo)基因序列，用于驗(yàn)證PCR 的靈敏度和特異性。同時(shí)，陰性對照樣本可以用于檢測是否存在潛在的污染。②重復(fù)性試驗(yàn)：進(jìn)行多次獨(dú)立的PCR試驗(yàn)，可以驗(yàn)證結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。通過比較不同試驗(yàn)之間的結(jié)果，可以評估PCR 反應(yīng)的一致性和穩(wěn)定性。③平行試驗(yàn)：同時(shí)進(jìn)行多個(gè)平行試驗(yàn)，可以評估試驗(yàn)的一致性，幫助排除試驗(yàn)中可能的隨機(jī)誤差。通過上述驗(yàn)證步驟，可以確保PCR 檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，有助于排除假陽性和假陰性結(jié)果，提高PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中的可信度和應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語

綜上所述，PCR 技術(shù)在食品微生物檢測中具有巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，PCR 技術(shù)將在食品微生物檢測中發(fā)揮越來越重要的作用，為人們提供更加可靠和高效的食品安全保障。