脲類細胞分裂素誘導尾葉桉愈傷組織分化過程中活性及基因表達變化1)

李麗純 許漫琪 黃惠紫 陳裕婷 李觀玲 黃真池

(嶺南師范學院,湛江,524048)

桉樹(Eucalyptus)因生長速度快、抗性強,經(jīng)濟效益好,已成為我國南方造林的戰(zhàn)略性樹種,種植面積高達546萬hm2[1]。桉樹多用于造紙木漿原料、建筑和林副產(chǎn)品生產(chǎn)等方面,對我國推動經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)監(jiān)測等具有突出作用[2]。桉樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展迫切需要解決改良材質(zhì)、提升木材蓄積量、增強病蟲害抗性等諸多難題。轉(zhuǎn)基因育種是解決這些難題的有效途徑之一,但其受愈傷組織易褐化、不定芽難分化及轉(zhuǎn)化率低等因素制約[3]。探討桉樹再生與分化的機理,尋找合適的培養(yǎng)條件,突破育種技術瓶頸可加快優(yōu)良種質(zhì)的選育過程。

高效再生體系的建立是轉(zhuǎn)基因育種的前提。細胞分裂素(CTK)在干細胞分裂分化、不定芽形成、維管組織發(fā)育等方面起著關鍵的作用[4]。根據(jù)化學結(jié)構差異,CTK有嘌呤類和脲類細胞分裂素(UCTK)兩大類[5]。嘌呤類CTK有6-芐氨基嘌呤、激動素、玉米素等。UCTK有N-苯基-N-噻唑基脲(PBU),氯吡苯脲(CPPU)和苯基噻二唑脲(TDZ)等。

UCTK是新型植物生長調(diào)節(jié)劑。CPPU可促進植物細胞分裂和增大,可促進植物細胞分化形成愈傷組織及不定芽[6]。TDZ具有較強的細胞分裂素活性,誘導桉樹細胞分裂分化效果較好[7]。PBU可通過抑制尾葉桉愈傷組織分化初期rboh1基因的轉(zhuǎn)錄,減輕褐變、促進不定芽分化[8]。PBU有減輕桉樹愈傷組織褐化,促進不定芽分化的獨特效果[9-10]。PBU影響愈傷組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等活性氧(ROS)代謝相關基因的表達,調(diào)節(jié)酶活性,維持ROS平衡,減輕褐變、促進分化[11-12]。

ROS代謝與植物細胞分裂、分化及生理變化等有重要關系。外植體在切傷刺激和離體培養(yǎng)時使得ROS過度積累,ROS代謝失衡對植物細胞膜系統(tǒng)等細胞結(jié)構造成氧化損傷,導致生物大分子功能紊亂或喪失,是引起外植體褐化的重要因素之一[13]。為確保氧自由基在各種環(huán)境均被有效清除,SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,能與POD、過氧化氫酶(CAT)協(xié)同運作將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化成完全無害的水和分子氧,以維持ROS代謝平衡[14]。

目前,有關UCTK抑制褐化促進分化作用機理的報道較少,不同種類的UCTK有無相互作用尚不明確。實驗研究UCTK誘導尾葉桉愈傷分化過程中SOD活性、ROS水平及SOD基因表達的變化,探討UCTK間的相互作用,為桉樹高效再生體系的建立積累資料。

1 材料與方法

本研究采用國家林草局速生樹木所提供的尾葉桉U6(Eucalyptusurophylla)種子。

無菌苗培養(yǎng):將尾葉桉種子置于蒸餾水浸泡2 h,再用體積分數(shù)0.2% Triton-100浸泡25 min,用蒸餾水除去表面油漬后于超凈工作臺中進行消毒。先用無菌水漂洗5次后用體積分數(shù)70%的乙醇消毒30 s,用無菌水漂洗2次以清除殘留乙醇。接著用體積分數(shù)10%的NaClO溶液消毒7 min,用無菌水漂洗3次,再用體積分數(shù)10%的NaClO溶液消毒7 min,最后用無菌水漂洗7次。將種子播種到大量元素減半的0.5倍濃度的MS培養(yǎng)基,置于25 ℃暗處萌發(fā)。

愈傷組織誘導:取8 d苗齡的無菌健壯幼苗,置于20 μmol·m-2·s-1光下處理1 d,切取8 mm長的下胚軸莖段作為外植體,等量接種于含0.57 μmol/L 6-BA+0.57 μmol/L IAA,添加不同類型細胞分裂素的SPCa培養(yǎng)基中(PBU+CPPU組合為2 μmol/LPBU+2 μmol/LCPPU;PBU+TDZ組合為2 μmol/L PBU+2 μmol/L TDZ;CPPU+TDZ組合為2 μmol/L CPPU+2 μmol/L TDZ;PBU組合為4 μmol/L PBU;CPPU組合為4 μmol/L CPPU;TDZ組合為4 μmol/L TDZ)。外植體經(jīng)暗處理2周后,置于16 h光/8 h暗、光合有效輻射50 μmol·m-2·s-1、溫度(25±2)℃的人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)10周,每2周統(tǒng)計愈傷組織的生長情況。

酶液提取、蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定及SOD活性檢測:以6周齡愈傷組織為材料,稱取0.1 g材料,加100 mg交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),1 mL酶提取液(50 mmol/L pH為7.0 Tris-HCl緩沖液,1 mmol/L EDTA,5 mmol/L MgCl2,1 mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴勻漿后4 ℃,8 000 r/min離心10 min,所得上清即為酶提取液。用考馬斯亮藍法[15]測定酶液蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù);采用四氮唑藍(NBT)光化還原法[16]測定SOD活性,在560 nm下測定試驗組的吸光度,反應被抑制50%所需酶量為1個酶活力單位(U)。所有測定3個生物學重復。

超氧陰離子清除速率和過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度檢測:以6周齡愈傷組織為材料,按南京建成抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基檢測試劑盒說明書檢測超氧陰離子清除速率,用二甲酚橙法[9]檢測過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度。所有測定3個生物學重復。

基因選擇及引物設計:檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)找到已知的桉樹SOD基因,將能以尾葉桉愈傷組織cDNA作模板有效擴增的6個SOD基因編號為SOD1至SOD6,選擇RTEF為內(nèi)參基因[17]。將基因的CDS序列輸入Primer3Plus軟件設計qPCR引物。內(nèi)參基因RTEF和6個SOD基因的編號和引物序列見表1。

表1 內(nèi)參基因和SOD基因編號、對應酶類型、qPCR引物序列

總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR擴增:稱取30～50 mg材料(每種樣品重復3次),根據(jù)Fruit-mateTMfor RNA Purification試劑盒(TaKaRa)說明書配合使用RNAiso Plus的方法提取總RNA,再用Nanodrop 2000c檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書完成反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。qPCR反應體系為25 μL(SYBR Premix TaqTMⅡ 12.5 μL,10 μmol/L Primer F和Primer R各1 μL,ddH2O 8.5 μL,cDNA模板2 μL);擴增儀器為CFX-96Touch(Bio-Rad);擴增程序:94 ℃,10 s;55 ℃,10 s;72 ℃,15 s。采用相對定量的Pfaffl法[18],計算各基因用不同類型細胞分裂素處理后的相對表達值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合處理對愈傷組織分化的影響

切取8 mm長的無菌幼苗下胚軸莖段,等量接種在添加不同激素組合的SPCa愈傷誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)8周后,尾葉桉愈傷組織分化形成白色、紅色和綠色愈傷組織(圖1A、B、C)等類型,部分愈傷組織褐化、細胞壞死。白色愈傷組織表面較為光滑、細胞團質(zhì)地疏松;紅色愈傷組織細胞團質(zhì)地稍致密、呈粉紅色至紅色;綠色愈傷組織表面有光澤、細胞團質(zhì)地致密,呈淺綠色至深綠色。后續(xù)培養(yǎng)中綠色愈傷組織可分化形成綠色芽點(圖1D),芽點逐漸長成不定芽(圖1E)。兩兩組合脲類CTK誘導出的再生型愈傷組織比例均高于49.27%,顯著高于單種脲類CTK的不到29%。PBU+CPPU和CPPU+TDZ組合褐化率明顯低于其他組合,分別為8.92%、10.22%(表2)。CPPU+TDZ處理2周后,愈傷組織轉(zhuǎn)綠速度較其他組合快。6周時PBU+TDZ組合的愈傷組織轉(zhuǎn)綠速度加快,逐漸接近其他組合。10周時PBU+CPPU組合的愈傷組織轉(zhuǎn)綠效果最佳,且褐化率顯著低于其他組合。推測不同UCTK組合使用時有協(xié)同作用,可顯著降低褐化率,促進再生型愈傷組織分化。

A.白色愈傷;B.紅色愈傷;C.綠色愈傷;D.帶芽點的綠色愈傷組織;E.不定芽(圖中標線長5 mm)。

表2 不同激素組合誘導8周后尾葉桉愈傷組織的生長情況

2.2 不同激素組合誘導形成的愈傷組織SOD活性及ROS水平

長期觀察發(fā)現(xiàn),外植體接種后的4～6周是愈傷組織分化形成不同類型愈傷組織的關鍵期,6周后部分愈傷組織開始褐變。檢測不同激素組合誘導所得的6周齡愈傷組織的SOD活性及ROS水平(表3),PBU處理組SOD活性顯著高于其他處理組。

表3 不同激素組合處理6周后誘導所得尾葉桉愈傷組織SOD活性及ROS水平

從第6周開始,愈傷組織向不同類型分化,推測分化方向與ROS水平有關。比較超氧陰離子清除速率和過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度(表3)。超氧陰離子清除速率由大到小表現(xiàn)為PBU、TDZ、CPPU、PBU+CPPU、PBU+TDZ、CPPU+TDZ、下胚軸。過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度由大到小表現(xiàn)為PBU、TDZ、CPPU、PBU+CPPU、PBU+TDZ、CPPU+TDZ、下胚軸。6種愈傷組織的超氧陰離子清除速率高低與過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度多少完全對應,即超氧陰離子清除速率越高,過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度越高。UCTK組合誘導所得愈傷組織過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度顯著低于單種UCTK激素誘導的愈傷組織。PBU誘導所得愈傷組織SOD酶活性最高,超氧陰離子清除速率最高,其過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度也顯著高于其他激素組合。

2.3 不同激素組合處理6周后SOD基因表達變化

以不同激素組合處理的6周齡尾葉桉愈傷組織為材料,比較各組合6個SOD基因的表達水平(表4)。設PBU誘導所得6周齡愈傷組織的相對表達量為1,PBU+TDZ和CPPU+TDZ組合誘導所得愈傷組織中6個SOD基因全部表達上調(diào),PBU+CPPU組合僅SOD6表達下調(diào)。其中,PBU+CPPU誘導的愈傷組織中SOD2、SOD3、SOD4和SOD5表達顯著增強;PBU+TDZ誘導的愈傷組織中6個SOD基因表達都顯著增強;CPPU+TDZ誘導的愈傷組織中SOD1和SOD3表達顯著增強。結(jié)果分析可知,不同脲類細胞分裂素對SOD同工酶的表達的影響不同,使得不同細胞部位活性氧的種類等出現(xiàn)差異,影響細胞分化。

表4 不同激素組合處理6周后誘導所得綠色愈傷組織的6個SOD基因的表達水平

2.4 兩兩組合脲類CTK誘導愈傷組織SOD基因表達變化

2.4.1PBU+CPPU組合誘導愈傷組織SOD基因表達變化

不同激素組合中,PBU+CPPU組合的褐化率最低、再生型愈傷組織率最高,分別為8.92%和49.34%(表2)。檢測PBU+CPPU組合誘導所得的愈傷組織2、4、6、10周時的6個SOD基因相對表達量的變化(表5)。

表5 PBU+CPPU誘導不同時間的尾葉桉愈傷組織SOD基因相對轉(zhuǎn)錄水平變化

SOD1、SOD2基因編碼Mn-SOD,主要存在線粒體基質(zhì)中。白色愈傷組織中SOD1基因轉(zhuǎn)錄呈上升趨勢。10周齡的綠色愈傷組織中SOD1和SOD2的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,分別為524.77和71.20。SOD3、SOD4基因編碼Fe-SOD,主要存在葉綠體中。白色愈傷組織中SOD3基因轉(zhuǎn)錄呈上升趨勢。10周齡的綠色愈傷組織中的SOD3和SOD4轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,分別為14 789.44和28.15。SOD5、SOD6基因編碼Cu/Zn-SOD,SOD5基因主要存在葉綠體和細胞質(zhì)基質(zhì)中,SOD6基因定位尚未明確。SOD5、SOD6基因在4周齡白色愈傷組織中的轉(zhuǎn)錄水平最高,分別為80.45和104.06。推測SOD基因的表達調(diào)控與其類型、生理作用和細胞定位有關。

2.4.2PBU+TDZ組合誘導愈傷組織SOD基因表達變化

以PBU+CPPU組合誘導出的2周齡愈傷組織為對照,檢測PBU+TDZ組合誘導所得的愈傷組織2、4、6、10周時的6個SOD基因相對轉(zhuǎn)錄水平的變化(表6)。發(fā)現(xiàn)SOD1、SOD2、SOD3、SOD4基因表達水平在2周后均下降,在4～6周期間逐漸升高,6周后SOD1、SOD2、SOD3、SOD4基因表達值則整體下降,且6周齡的白色愈傷組織中SOD1、SOD3基因的相對表達量為最高,分別為1 501.81和7 086.52,顯著高于其他時間的愈傷組織。SOD5、SOD6基因在4周齡白色愈傷組織中的轉(zhuǎn)錄水平最高,分別為1 002.43和27.29。推測SOD基因表達變化與其生理作用和細胞定位有關。

表6 PBU+TDZ誘導不同時間的尾葉桉愈傷組織SOD基因相對表達變化

2.4.3CPPU+TDZ組合誘導愈傷組織SOD基因表達變化

以PBU+CPPU組合誘導出的2周齡愈傷組織為對照,比較CPPU+TDZ組合誘導所得的尾葉桉愈傷組織2、4、6、10周時的6個SOD基因的表達水平變化(表7)。SOD1、SOD2、SOD3、SOD4基因表達水平在2周后均下降,4周后檢測愈傷組織中SOD1、SOD2、SOD3、SOD4的表達量,則均呈上升趨勢。愈傷組織分化過程中僅SOD5隨著愈傷組織的膨大相對表達量升高,在10周齡綠色愈傷組織中表達水平最高,為8.08。SOD6基因表達水平在6周齡愈傷組織中最低,其他時間無明顯差異。

表7 CPPU+TDZ誘導不同時間的尾葉桉愈傷組織SOD基因相對表達變化

3 討論與結(jié)論

CTK有嘌呤類結(jié)構和脲類結(jié)構兩大類[2,5]。常用的UCTK有PBU、CPPU和TDZ等。本研究中PBU、CPPU和TDZ都表現(xiàn)出抗褐變與促分化的作用。與單種UCTK處理相比,UCTK組合誘導的愈傷組織H2O2質(zhì)量摩爾濃度降低,超氧陰離子清除速率下降,SOD活性則是PBU處理組最高、單種UCTK和UCTK組合間無明顯規(guī)律(表3)。推測UCTK組合使用時有協(xié)同效應,通過影響愈傷組織ROS代謝,減輕褐化,誘導其向再生型愈傷組織的方向分化。

我們檢測發(fā)現(xiàn)UCTK誘導后尾葉桉愈傷組織中定位于線粒體,屬于Mn-SOD的SOD1、SOD2基因在綠色愈傷分化形成過程的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,推測SOD1、SOD2基因的表達量升高對清除線粒體ROS有利,可維持植物的非光合組織的正常結(jié)構和生理功能,有利于再生型愈傷組織的分化。定位于葉綠體中的SOD3、SOD4和SOD5基因的轉(zhuǎn)錄水平在愈傷組織分化前期呈逐漸上升趨勢,且UCTK組合誘導下明顯上調(diào)。推測UCTK組合的協(xié)同效應誘導葉綠體SOD保持較高表達水平,促進葉綠體的發(fā)育和愈傷組織轉(zhuǎn)綠。

分析UCTK組合誘導愈傷組織膨大和分化過程中SOD基因的表達變化,發(fā)現(xiàn)SOD1和SOD3基因的轉(zhuǎn)錄變化最為顯著。CPPU+TDZ處理2周后,SOD1和SOD3的轉(zhuǎn)錄達最大值,分別為762.53和1 119.82;PBU+TDZ處理6周后,SOD1和SOD3的轉(zhuǎn)錄達最大值,分別為1 501.81和7 086.52;PBU+CPPU處理10周后,SOD1和SOD3的轉(zhuǎn)錄達最大值,分別為524.77和14 789.44。結(jié)合愈傷組織形態(tài)觀察,UCTK組合誘導愈傷組織膨大和分化過程,發(fā)現(xiàn)CPPU+TDZ處理2周后,愈傷組織轉(zhuǎn)綠速度較其他組合快。6周后,PBU+TDZ組合愈傷組織轉(zhuǎn)綠速度加快,逐漸接近其他組合。10周時,PBU+CPPU組合愈傷組織轉(zhuǎn)綠效果最佳,且褐化率顯著低于其他組合。UCTK組合處理后,SOD1和SOD3的轉(zhuǎn)錄水平變化極為顯著,且與愈傷組織轉(zhuǎn)綠直接相關,說明其與愈傷組織分化密切相關。后續(xù)通過qPCR轉(zhuǎn)錄分析、同工酶電泳和活性氧定位分析有望進一步明確SOD1和SOD3在愈傷組織分化和不定芽形成中的作用機理。Hothorn et al.[25]發(fā)現(xiàn),脲類細胞分裂素TDZ雖然與嘌呤類細胞分裂素化學結(jié)構明顯不同,但是可與嘌呤類細胞分裂素一樣與細胞分裂素受體CRE1/AHK4建立非常相似的極性接觸。CPPU和PBU如何與細胞分裂素受體結(jié)合,尚無報道。不同UCTK處理后,SOD1和SOD3的轉(zhuǎn)錄峰值在不同發(fā)育階段出現(xiàn),推測UCTK種類和濃度的不同所對應的信號轉(zhuǎn)導途徑并不完全相同,引起的細胞應答發(fā)育有明顯差異。

總之,研究發(fā)現(xiàn)不同UCTK間存在協(xié)同效應,可誘導細胞定位不同的SOD基因在不同時期的高表達,從而影響SOD活性,調(diào)節(jié)ROS代謝,有效減輕褐變,促進再生型愈傷組織形成和不定芽分化。本研究可為深入探討UCTK的作用機理和桉樹SOD與愈傷分化的關系提供參考。