肖琛聞, 包省軍, 王教瑜, 陳金朗, 陳霖, 徐麗華

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江 杭州 310021; 2.浙江昆微農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司, 浙江 杭州 311121;3.武義新鑫家庭農(nóng)場(chǎng), 浙江 武義 321031; 4.武義縣科學(xué)技術(shù)局, 浙江 武義 321299)

中國(guó)是世界最大豬肉生產(chǎn)國(guó)與消費(fèi)國(guó), 據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布數(shù)據(jù)顯示, 2022 年全國(guó)生豬出欄45 256 萬頭, 能繁母豬存欄量4 390 萬頭[1]。生豬養(yǎng)殖一直以來是農(nóng)民增收的重要來源, 浙江省生豬規(guī)模養(yǎng)殖水平居全國(guó)前列。

斷奶仔豬腹瀉是一種多因素疾病[2], 在斷奶兩周內(nèi)高發(fā)。該病流行面廣, 一年四季均可發(fā)病,病愈后仔豬生長(zhǎng)緩慢, 給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì), 在我國(guó), 仔豬斷奶后腹瀉率甚至可高達(dá)50%。斷奶應(yīng)激引起腸道絨毛脫落, 腸黏膜吸收能力降低和滲透性增大, 造成仔豬腹瀉或死亡。有研究表明, 日糧中抗原過敏及病原感染是導(dǎo)致斷奶仔豬腸道損傷的重要因素[3]。近年來由于抗生素的大量使用, 耐藥性病原株日益增多, 給預(yù)防和治療病原感染為主的斷奶仔豬腹瀉帶來了諸多困難。

環(huán)保昆蟲黑水虻 (black soldier fly) 的幼蟲在自然界能以有機(jī)物為食物, 具有食性雜、食量大、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn), 已被歐美國(guó)家引入環(huán)保建設(shè)中。黑水虻的昆蟲體內(nèi)還含有多種抗微生物的活性成分[4], 可以增強(qiáng)動(dòng)物抵抗力, 減少畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用, 有利于建立健康的畜禽養(yǎng)殖模式。本項(xiàng)目前期研究表明, 黑水虻提取物能夠顯著抑制腸道致病菌的生長(zhǎng), 同時(shí)對(duì)家畜腸道細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用, 因此具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值[5]。本文探究黑水虻提取物 (black soldier fly extraction,BFE) 對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、免疫功能及斷奶后腹瀉率的影響, 以及BFE 對(duì)仔豬腸道絨毛生長(zhǎng)是否有改善作用。利用BFE 在生豬健康養(yǎng)殖中開展試驗(yàn), 努力使抗生素使用大幅下降, 為浙江省生豬健康養(yǎng)殖提供可持續(xù)發(fā)展的新產(chǎn)品和新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 黑水虻提取物BFE 提取方法

清洗0.5 h, 通過機(jī)器將黑水虻蟲卵清洗干凈;清洗后投入蒸煮鍋中, 蒸煮30 min; 蒸煮后的黑水虻通過螺旋, 提升出水濾干并輸送至破壁壓榨系統(tǒng), 進(jìn)行壓榨處理, 進(jìn)而得到蟲漿混合物和固渣蟲皮; 得到蟲漿混合物后, 輸送至三相離心機(jī)進(jìn)行油、水、渣的分離, 進(jìn)而獲得蟲油, 黑水虻提取物(蟲油) BFE。

1.2 斷奶仔豬飼喂BFE

選取杜長(zhǎng)大外三元母豬所產(chǎn)仔豬, 在仔豬斷奶后開始在飼料中添加2% BFE, 連續(xù)飼喂1 個(gè)半月, 前腔靜脈采集抗凝血。分離血清, 飼喂BFE 2個(gè)半月進(jìn)行稱重, 并計(jì)算出平均增重。

1.3 豬瘟病毒 (CSFV) 抗體檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各采集10 頭仔豬, 前腔靜脈采血, 采用豬瘟病毒抗體 ELISA 檢測(cè)試劑盒(IDEXX 產(chǎn)品) 進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒是用豬瘟病毒抗原包被的微量反應(yīng)板, 利用阻斷ELISA 原理來檢測(cè)豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體。具體方法參考說明書。

1.4 測(cè)定血液中細(xì)胞因子

采用RayBiotech 公司產(chǎn)品芯片, 測(cè)定血清中細(xì)胞因子 (IL-1β、IL-10、TNFα), 并對(duì)芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。具體方法參考QAP-CYT-1 芯片操作流程。

1.5 測(cè)定血液中的mRNA 表達(dá)

從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各采集10 頭仔豬采集凝血樣品, 血液RNA 提取采用 PureLink RNA Mini 試劑盒 (life technologies, USA)。采用Sybgreen 染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 測(cè)定[6], 測(cè)定IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6 的表達(dá)情況。所用的基因引物根據(jù)豬相關(guān)基因序列設(shè)計(jì),Actin作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCT是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.6 測(cè)定腸絨毛和隱窩深度

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各選取5 頭仔豬, 采集斷奶仔豬空腸, 放入固定液中, 采用蘇木精-伊紅染色法(HE) 進(jìn)行腸道組織切片。通過組織處理和石蠟切片的HE 染色得到切片。采用軟件Caseviewer 對(duì)圖片進(jìn)行分析對(duì)比。并對(duì)腸絨毛和隱窩深度進(jìn)行測(cè)定,最后再計(jì)算腸絨毛和隱窩深度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔豬平均增重

飼喂BFE 2 個(gè)半月進(jìn)行稱重, 并計(jì)算出平均增重。結(jié)果表明, BFE 飼喂的實(shí)驗(yàn)組平均增重顯著高于對(duì)照組, 平均增重率9.79% (圖1)。飼喂組仔豬毛色相比對(duì)照組更光亮, 毛發(fā)更滑順, 精神更佳。說明飼喂BFE 一定時(shí)間可以顯著提高仔豬生長(zhǎng)水平。

圖1 不同處理仔豬平均增重

2.2 豬瘟病毒 (CSFV) 抗體檢測(cè)結(jié)果

于仔豬斷奶后20 d 注射免疫豬瘟CSFV 活疫苗(傳代細(xì)胞源, 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司), 同時(shí)飼喂2% BFE 一個(gè)半月, 免疫疫苗40 d 以后, 仔豬的CSFV 抗體水平顯著高于對(duì)照組, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬對(duì)于商品化疫苗的免疫反應(yīng)水平(圖2)。

2.3 斷奶仔豬血清中細(xì)胞因子水平

BFE 飼喂一個(gè)半月, 仔豬血清中的細(xì)胞因子水平 (IL-1β、IL-10、TNFα) 顯著高于對(duì)照組,其余指標(biāo)并沒有顯著性差異, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平 (圖3)。

圖3 不同處理斷奶仔豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平

2.4 斷奶仔豬血液RNA 細(xì)胞因子表達(dá)水平

2%BFE 飼喂一個(gè)半月, 仔豬血液中的細(xì)胞因子表 達(dá) 水 平 (IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6)顯著高于對(duì)照組, 說明BFE 能夠顯著提高斷奶仔豬的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平 (圖4)。

圖4 不同處理斷奶仔豬的細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.5 BFE 添加劑對(duì)斷奶仔豬空腸絨毛和隱窩深度的影響

對(duì)空腸進(jìn)行采樣, 進(jìn)行組織切片, 發(fā)現(xiàn)2%BFE 添加劑可明顯改善空腸內(nèi)腸絨毛長(zhǎng)度與厚度(圖5)。說明2%BFE 添加劑可促進(jìn)仔豬腸道生長(zhǎng),避免因腸道發(fā)育不良導(dǎo)致的仔豬腹瀉。

圖5 不同處理仔豬空腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度

2.6 BFE 對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響

確定斷奶仔豬飼料添加BFE 方案 (即2%BFE添加劑在仔豬上的應(yīng)用, 連續(xù)飼喂1 個(gè)月以上),通過生豬養(yǎng)殖場(chǎng)-武義新鑫家庭農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)估, 根據(jù)腹瀉情況判斷仔豬腹瀉頭數(shù), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 使用BFE 試驗(yàn)組, 可降低仔豬腹瀉率10 百分點(diǎn) (對(duì)照組每100 頭中20 頭腹瀉, 實(shí)驗(yàn)組每100 頭中10 頭腹瀉), 從原來的20%腹瀉率降低為10%, 因此,BFE 對(duì)于預(yù)防仔豬斷奶腹瀉具有較好的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)空間。

3 討論

仔豬斷奶腹瀉是規(guī)?；B(yǎng)豬出現(xiàn)的主要問題之一, 如何有效降低仔豬腹瀉對(duì)于提高養(yǎng)豬效益至關(guān)重要。本研究應(yīng)用一種黑水虻提取物蟲油, 開展斷奶仔豬的腹瀉防控研究。黑水虻蟲油作為一種生物制劑, 沒有抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn), 能夠顯著提升仔豬的免疫力和生產(chǎn)性能, 對(duì)于腸道發(fā)育有明顯促進(jìn)作用。這對(duì)于將來應(yīng)用推廣該種黑水虻蟲油具有重要的意義。

從仔豬增重試驗(yàn)結(jié)果來看, 飼喂BFE 一定時(shí)間可以顯著提高仔豬生長(zhǎng)水平, 提高仔豬的免疫水平, 對(duì)于特定病原的商品化疫苗也具有較好的免疫促進(jìn)效果。IL-1β 作為一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子[7], 參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng), 包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。IL-1β 對(duì)幾乎所有組織的細(xì)胞防御和組織修復(fù)至關(guān)重要, 與疼痛、炎癥和自身免疫有關(guān)。IL-1β 通過非常規(guī)的蛋白質(zhì)分泌途徑分泌, 可以旁分泌或系統(tǒng)分泌, 主要由先天免疫系統(tǒng)的前哨細(xì)胞: 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生, 也可以從上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、神經(jīng)元、肥大細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等釋放, 來源較為廣泛。白介素10 (IL-10) 是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子[8], 參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)。腫瘤壞死因子α(TNFα) 主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[9], 能殺傷腫瘤細(xì)胞, 促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬, 是重要的炎癥因子, 參與某些自身免疫病的病理損傷。BFE飼喂一個(gè)半月, 仔豬血清中的細(xì)胞因子IL-1β、IL-10、TNFα 水平顯著提高, 表明BFE 能提高仔豬先天免疫系統(tǒng)的免疫水平、提高調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)的能力、促進(jìn)殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞生成。因此, 也提示BFE 可作為仔豬斷奶至成熟期間的一種候選免疫增強(qiáng)劑, 有利于仔豬斷奶后的生長(zhǎng)保護(hù), 促進(jìn)斷奶仔豬的健康生長(zhǎng), 提高生產(chǎn)效益。

豬的腸道形態(tài)尤其是絨毛的長(zhǎng)度和隱窩深度,是表征豬腸道健康的重要指標(biāo)。絨毛邊緣可分泌多種消化酶, 因此, 絨毛越長(zhǎng), 動(dòng)物的消化吸收能力越強(qiáng)。隱窩深度決定腸絨毛有絲分裂生成上皮細(xì)胞的速度, 反映細(xì)胞生成率, 而隱窩變淺, 表明細(xì)胞成熟率上升, 分泌功能增強(qiáng)[10]。有研究對(duì)仔豬消化器官 (空腸) 形態(tài)結(jié)構(gòu) (不同日齡仔豬空腸組織結(jié)構(gòu)) 進(jìn)行觀察, 結(jié)果表明, 絨毛越長(zhǎng)、越粗,表面積越大, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收越有利。本研究中的試驗(yàn)組仔豬空腸絨毛的長(zhǎng)度和隱窩深度顯著高于對(duì)照組, 說明蟲油能夠顯著促進(jìn)仔豬斷奶后腸道發(fā)育, 對(duì)于保護(hù)斷奶仔豬腹瀉具有顯著作用, 這為蟲油在斷奶仔豬推廣應(yīng)用積累了較好的科學(xué)數(shù)據(jù)。蟲油在斷奶仔豬腹瀉率防控上具有推廣應(yīng)用價(jià)值。