李曉瓊，周芥鋒**，李超穎，李春容，胡惠茗

(1.長寧縣產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，四川 宜賓 644300；2.長寧縣產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心，四川 宜賓 644300)

富油竹葉糕由竹葉包裹糯米、紅糖、臘肉等原料制作而成，因加入了臘肉而獲得了獨(dú)特的風(fēng)味和口感，是西南地區(qū)的一道傳統(tǒng)美食[1]。臘肉中亞硝酸鹽殘留量是該小吃的食品安全控制點(diǎn)，當(dāng)成人攝入0.2～0.5 g亞硝酸鹽即可中毒，3 g致死[2]。此外，亞硝酸鹽在胃酸環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為亞硝胺，具有誘發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，故《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)中規(guī)定腌臘肉制品中亞硝酸鹽殘留量不得超過30 mg/kg[3-4]。因此，探究富油竹葉糕中亞硝酸鹽的含量及其測量不確定度尤為重要。

目前，實(shí)驗(yàn)室評定不確定度的標(biāo)準(zhǔn)有很多，《測量不確定度評定與表示》 (JJF 1059.1-2012 )、《測量不確定評定和表示》 (GB/T 27418-2017)、《測量不確定度的要求》 (CNAS-CL01-G003：2019)、《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》 (CNAS-GL006：2019)、《化學(xué)分析測量不確定度評定》 (JJF1135-2005)、《檢測實(shí)驗(yàn)室中常用不確定度評定方法與表示》 (GB/T27411-2012)等[5-10]。

基于此，以宜賓長寧富油竹葉糕為研究對象，采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》 (GB/T5009.33-2010)中的第二法[11]，測定富油竹葉糕中的亞硝酸鹽殘留量，分析不確定度來源，對各分量進(jìn)行計(jì)算，最后合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

富油竹葉糕樣品：四川省長寧縣產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心委托檢驗(yàn)樣品(將樣品用粉碎機(jī)粉碎備用)；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(200 mg/L)：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)玻璃儀器使用5%硝酸溶液浸泡；硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鹽酸，均為分析純試劑；實(shí)驗(yàn)用水均為一級水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV2紫外可見分光光度計(jì)(龍尼柯(上海)儀器有限公司)；BSA223S電子天平(賽多利斯)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋：吸取 2.50 mL 上述亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于 100 mL 容量瓶中，定容制得 5.00 μg/mL 亞硝酸鈉中間溶液1；

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制：吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 中間溶液1(分別相當(dāng)于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg 亞硝酸鈉)，分別置于 50 mL 帶塞比色管中。

1.2.2 富油竹葉糕的前處理

稱取 5 g 均勻試樣，置于 250 mL 具塞錐形瓶中，加 12.5 mL 質(zhì)量濃度 50 g/L 飽和硼酸鈉溶液，加入 70 ℃ 左右的水約 150 mL，混勻，于沸水浴中加熱 15 min，取出冷卻至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至 200 mL 容量瓶中，加入 5 mL 質(zhì)量濃度 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入 5 mL 質(zhì)量濃度 220 g/L 乙酸鋅溶液，沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置 30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液 30 mL，濾液備用。

1.2.3 試樣顯色處理

吸取 40.00 mL 上述試樣濾液于 50 mL 帶塞比色管中。向試樣管和1.2.1中的標(biāo)準(zhǔn)工作液中分別加入 2 mL 4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置 4 min 后各加入 1 mL 2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置 15 min，用 1 cm 比色皿，以空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于 538 nm 處測定其吸光度。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型及不確定度來源分析

富油竹葉糕中亞硝酸鹽含量按下式(1)計(jì)算。

(1)

式中：X為亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；M1為測定用樣液中亞硝酸鈉質(zhì)量，μg；V1為試樣處理液總體積為 200 mL；m為試樣質(zhì)量，g；V2為測定用樣液體積 40 mL；1000為換算系數(shù)。

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》 (GB/T5009.33-2010)中分光光度法測定亞硝酸鹽的原理和式(1)分析，紫外分光光度法測定富油竹葉糕中亞硝酸鹽的不確定度主要來源如表1所示。

表1 不確定度的來源分析

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

2.2 樣品處理后定容和移取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

2.2.1 定容所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品處理后用 200 mL A容量瓶定容，移取 40 mL 樣品于 50 mL 具塞比色管中加入試劑并定容。分別在《常用玻璃量器檢定規(guī)程》 (JJG 196-2006)[13]、《專用玻璃量器檢定規(guī)程》 (JJG 10-2005)[14]查得 200 mL A級容量瓶的容量允差為 0.15 mL 和 50 mL 具塞比色管的容量允差為 0.40 mL。按均勻分布計(jì)算，則由體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果如表2所示。

表2 體積引入的不確定度

2.2.2 移液管所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

50 mL A級分度吸量管在 20 ℃ 下校準(zhǔn)合格，實(shí)際定容時(shí)的溫度為21 ℃。在《常用玻璃量器檢定規(guī)程》 (JJG 196-2006)查得 50 mL A級分度吸量管的容量允差為 0.10 mL。按均勻分布計(jì)算，則由體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果如表2所示。

2.2.3 溫度效應(yīng)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

200 mL 容量瓶、50 mL 比色管在 20 ℃ 下校準(zhǔn)合格，實(shí)際定容時(shí)的溫度為 21 ℃。已知液體的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1。按均勻分布計(jì)算，則由溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果如表2所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Q)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度引入的不確定度 urel(ρ)

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液證書濃度為 200 mg/L，依據(jù)證書其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2%(包含因子K=2)，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(ρ)=2%/2=0.01。

2.3.2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋引入的不確定度

1)5.00 μg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋引入的不確定度urel(Z1)

表3 移取和容量引入的不確定度

2)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配置引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(G)

取9支 50 mL 比色管，依次準(zhǔn)確加入1.2.1所述的亞硝酸鈉中間液1，按照1.2.3 試樣顯色處理，制得亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配置過程用到 1000 μL 移液器、5000 μL 移液器、50 mL 比色管，實(shí)驗(yàn)室溫度波動變化為 ±1 ℃。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作曲線稀釋過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(J)

采用9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量點(diǎn)測量3次，取其吸光度(A)平均值，并由平均吸光度(A)與亞硝酸鈉質(zhì)量(m)擬合得到過原點(diǎn)的關(guān)系方程，即：A=0.0153 m，相關(guān)系數(shù)為0.997。測定結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果

扣除試劑空白，樣品平行測試兩次，吸光度分別為0.059和0.060。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到亞硝酸鹽的質(zhì)量分別為 3.86 μg 和 3.92 μg，平均質(zhì)量為 3.89 μg。

擬合曲線的偏差為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的殘差平方和為：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(J)=0.176/3.89=0.0452

2.5 儀器測定重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對富油竹葉糕溶液進(jìn)行6次重復(fù)測定，如表6所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和1.2.4數(shù)學(xué)模型計(jì)算出富油竹葉糕中亞硝酸鹽平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.70 mg/kg。

表6 樣品的測定結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式，測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由紫外分光光度計(jì)測定重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

將亞硝酸鈉的各個(gè)分量進(jìn)行合成，其的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(X)=

=0.0544

取置信區(qū)間p=95%，K=2，則擴(kuò)展不確定度為U=0.70 mg/kg×0.0544×2=0.0762 mg/kg。

2.7 測量不確定度報(bào)告

實(shí)驗(yàn)測定富油竹葉糕中的亞硝酸鹽含量為X=(0.70±0.076 2) mg/kg；K=2。

3 結(jié)論

采用紫外分光光度法測定富油竹葉糕中的亞硝酸鹽含量，當(dāng)富油竹葉糕中的稱樣質(zhì)量為 5.279 g 時(shí)，亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.70±0.0762)mg/kg，該樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于 30 mg/kg，符合國家標(biāo)準(zhǔn)的限量要求。通過分析并計(jì)算主要不確定來源發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是主要的不確定度來源，在配置標(biāo)準(zhǔn)溶液的時(shí)候必須規(guī)范操作。