劉 政,易善萍,2,李謝雨,楊 立,程寅勝,聶顯雙,張 爽,黎蘭獻(xiàn),和世玉,伍 濤

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所/果樹種質(zhì)創(chuàng)新與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢,430064;2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,武漢,430070;3 棗陽(yáng)市精致農(nóng)業(yè)有限公司,棗陽(yáng),441200;4 武漢市東西湖區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,武漢,430040)

生物鐘(circadian clock)是生物適應(yīng)環(huán)境周期性變化的一種普遍內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制[1-2]。植物可通過(guò)生物鐘機(jī)制產(chǎn)生與環(huán)境信號(hào)(如光照、溫度等)相適應(yīng)的節(jié)律,在生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境響應(yīng)等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[3]。偽應(yīng)答調(diào)控(pseudo-response regulator,PRR)蛋白家族是植物生物鐘中央振蕩器的重要組成部分[4-5]。PRR蛋白家族包含一個(gè)N端REC偽響應(yīng)調(diào)節(jié)受體域(pseudo-receiver domain)以及C端植物特有的CCT(CONSTANS/CONSTANS-like/TOC1)結(jié)構(gòu)域[6]。PRR基因的功能在模式植物擬南芥中研究最為深入。擬南芥Arabidopsisthaliana一共包含5個(gè)PRR家族成員,它們的表達(dá)是按照AtPRR9→AtPRR7→AtPRR5→AtPRR3→AtPRR1/AtTOC1的順序從黎明到黃昏依次轉(zhuǎn)錄到最高峰,具有明顯的生物周期節(jié)律;它們被報(bào)道參與了非生物反應(yīng)、細(xì)胞延伸和光周期開花反應(yīng)等生物過(guò)程[3,7-9]。例如,PRR5通過(guò)與ABI5(ABSCISIC ACID INSENSITIVE 5,脫落酸不敏感蛋白5)互作,進(jìn)而介導(dǎo)了ABA(abscisic acid,脫落酸)信號(hào),在擬南芥種子萌芽過(guò)程起到調(diào)控作用[10]。超量表達(dá)AtPRR5表現(xiàn)出在紅光下呈現(xiàn)下胚軸變短的特征[11],而Atprr5單突變體表現(xiàn)完全相反的表型[12],說(shuō)明AtPRR5在光形態(tài)建成方面具有重要功能。

梨是我國(guó)重要的果樹物種,其栽培模式影響了光照在冠層內(nèi)的滲透與分布,進(jìn)而對(duì)果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響[13]。本課題組前期對(duì)不同栽培模式梨(Pyrus)光合特性進(jìn)行生理學(xué)測(cè)定,并與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析[14]。通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn),“植物-生物鐘周期節(jié)律”代謝途徑在梨樹凈光合速率表型相關(guān)性最高的基因模塊中顯著富集,這個(gè)代謝途徑上的PpPRR5a(LOC103943360)和PpPRR5b(LOC103951583)被鑒定是該基因模塊的核心基因(hub gene)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,PpPRR5a和PpPRR5b是擬南芥AtPRR5的同源基因;它們?cè)诩t光增強(qiáng)條件下的梨葉組織中呈現(xiàn)出上下波動(dòng)的表達(dá)變化模式,而在藍(lán)光增強(qiáng)的條件下則表現(xiàn)出先持續(xù)上升后下降的表達(dá)變化趨勢(shì),這說(shuō)明PpPRR5a和PpPRR5b確實(shí)是能夠受到光信號(hào)的調(diào)控[15]。瞬時(shí)表達(dá)PpPRR5a基因能夠抑制煙草凈光合速率,表明PpPRR5a是一個(gè)在光合作用中起負(fù)調(diào)控作用的基因[15]。然而,PpPRR5b基因尚未被克隆,其在果樹中調(diào)控光合作用的功能還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究克隆PpPRR5b基因,利用瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化分析其功能,以期為分子育種途徑培育高光效種質(zhì)提供優(yōu)良基因資源,為高光效管理模式創(chuàng)新提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料用于基因克隆的材料是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所梨育種試驗(yàn)基地的圓黃梨(P.pyrifolia‘Wonhwang’)9年生樹的葉片。用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種植于基質(zhì)土中,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 ℃,相對(duì)濕度60%,光照時(shí)間14 h/10 h。煙草長(zhǎng)出第4片葉時(shí)用于農(nóng)桿菌侵染。

1.2 基因克隆與生物信息學(xué)分析RNA提取與cDNA合成參照本課題組已發(fā)表的方法[13-14]。基于梨參考基因組的序列信息(http://peargenome.njau.edu.cn),設(shè)計(jì)PpPRR5b基因上下游引物(F:5’-ATGGCTATGGCGAACAAATAC-3’;R:5’-TCAGTGGTCTGAATCCTGCTTG-3’)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體pTOPO-BLUNT Simple Vector后,送武漢天一華煜基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò)生物信息分析在線工具Compute pI/Mw tool (https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)PpPRR5b蛋白的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)。利用Protscaler軟件(https://web.expasy.org/protscale/)分析編碼蛋白的親疏水性,ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算親水性平均系數(shù)。通過(guò)SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線軟件PSORT Ⅱ Prediction (https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞中的定位。運(yùn)用Clustal X2軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析,并用GENEDOC軟件展示比對(duì)結(jié)果。

1.3 載體構(gòu)建與煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化利用Gateway技術(shù)構(gòu)建超量表達(dá)載體。以測(cè)序正確的PpPRR5b質(zhì)粒為模板,通過(guò)2輪PCR反應(yīng)獲得預(yù)期的電泳條帶,回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行BP反應(yīng)。由大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化,經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆。抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒,通過(guò)LR反應(yīng)轉(zhuǎn)化到pHEX2表達(dá)載體上。進(jìn)一步由大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR,陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將已構(gòu)建成功的pHEX2-PpPRR5b表達(dá)載體以及對(duì)照質(zhì)粒pHEX2(含有GUS基因)分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,于LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)。收集菌體后,采用滲透液(0.5 mol·L-1MgCl2· 6H2O + 1 mol · L-1乙酰丁香酮)重新懸浮菌體至OD600值約為0.5。靜置2～4 h,注射煙草葉片背面。每個(gè)處理接種15片煙草葉作為生物學(xué)重復(fù)(n=15)。

1.4 凈光合速率表型檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的煙草置于三色光氣候箱(紅光波長(zhǎng)615～650 nm,綠光495～530 nm,藍(lán)光450～480 nm)培養(yǎng)3 d。其中,藍(lán)光[(50±5) μmol·m-2·s-1]和綠光[(50±1) μmol·m-2· s-1]強(qiáng)度為定值,紅光強(qiáng)度為變量(逐漸升高,光譜檢測(cè)儀檢測(cè)變化范圍為45～120 μmol·m-2·s-1)。農(nóng)桿菌侵染后第3天,使用CIRAS-3光合作用測(cè)定儀(PP Systems公司,USA)檢測(cè)煙草葉片的光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19軟件的Student’s t test法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,顯著性水平α=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1PpPRR5b克隆與生物信息學(xué)分析對(duì)PpPRR5b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PpPRR5b的cDNA序列全長(zhǎng)序列為2 019 bp,編碼一個(gè)含有672個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),PpPRR5b與PpPRR5a和AtPRR5的序列相似性分別為88.56%和39.80%,它們?cè)贜端和C端分別有保守的REC結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域(見圖1)。PpPRR5b相對(duì)分子量為74.23 kD,理論等電點(diǎn)為6.28。對(duì)PpPRR5b進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)其親水性氨基酸較疏水性氨基酸多,總親水性平均系數(shù)為-0.743,表明該蛋白具有很強(qiáng)的親水性(見圖2A)。PpPRR5b二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)卷曲為主,有410個(gè)氨基酸(占60.01%);其余,α螺旋有191個(gè)氨基酸(占28.42%),延伸鏈有56個(gè)氨基酸(占8.33%),β轉(zhuǎn)角有15個(gè)氨基酸(占2.23%)(見圖2B)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PpPRR5b主要定位在細(xì)胞核中的可能性約占56.5%,推測(cè)其很可能定位于細(xì)胞核。

注:方框分別標(biāo)識(shí)了兩個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域,即REC結(jié)構(gòu)域(pseudo-receiver domain)和CCT結(jié)構(gòu)域。圖1 PpPRR5b與PpPRR5a和AtPRR5序列比對(duì)

2.2PpPRR5b表達(dá)載體的構(gòu)建BP反應(yīng)催化PpPRR5b與pDONR221載體發(fā)生重組(見圖3A)。通過(guò)LR反應(yīng)使測(cè)序正確的pDONR221-PpPRR5b質(zhì)粒與pHEX2載體發(fā)生重組,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中并進(jìn)行菌液鑒定(見圖3B)。結(jié)果顯示,BP和LR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物約為2 000 bp,與預(yù)期大小相符,條帶清晰可見;陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)瞬時(shí)表達(dá)載體pHEX2-PpPRR5b構(gòu)建成功。

注:(A)pDONR221-PpPRR5b載體鑒定結(jié)果。(B)pHEX2-PpPRR5b載體鑒定結(jié)果。M:DNA Marker,圖A的1-4泳道和圖B的1-8泳道分別代表了PpPRR5b在BP和LR反應(yīng)后的菌液PCR結(jié)果。圖3 PpPRR5b超表達(dá)載體構(gòu)建

2.3PpPRR5b瞬時(shí)表達(dá)的光合效應(yīng)前期轉(zhuǎn)錄組研究和表達(dá)分析結(jié)果表明,PpPRR5b能夠響應(yīng)光質(zhì)信號(hào),并且與梨樹光合作用水平表型密切相關(guān)[14-15]。此外,考慮到擬南芥同源基因AtPRR5也被報(bào)道響應(yīng)紅光信號(hào),以及紅光是光合作用重要光譜波段的事實(shí)[12,16-17],進(jìn)一步在煙草葉片中瞬時(shí)超量表達(dá)PpPRR5b基因,檢測(cè)在紅光誘導(dǎo)條件下其對(duì)光合特性的影響。結(jié)果表明,隨紅光強(qiáng)度的增強(qiáng),PpPRR5b瞬時(shí)超量表達(dá)葉片組(n=15)和空載對(duì)照系(n=15)在凈光合速率、氣孔導(dǎo)度及胞間CO2濃度水平等生理指標(biāo)上均呈現(xiàn)出上下波動(dòng)的變化特點(diǎn),并且在PpPRR5b瞬時(shí)超量表達(dá)葉片組中上述生理指標(biāo)的總體平均(每組樣本的各生理指標(biāo)在紅光范圍內(nèi)隨機(jī)選取15個(gè)進(jìn)行測(cè)定比較,算其平均值進(jìn)行比較)水平極顯著地低于對(duì)照系(見圖4),表明PpPRR5b在響應(yīng)紅光誘導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控光合作用的功能。

注:A為凈光合速率,B為氣孔導(dǎo)度,C為胞間CO2濃度。PpPRR5b為葉組織中瞬時(shí)表達(dá)PpPRR5b基因,GUS為空載對(duì)照。平均值是基于15個(gè)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算獲得,兩個(gè)星號(hào)表示p<0.01差異顯著性,三個(gè)星號(hào)表示p<0.001差異顯著性。圖4 紅光增強(qiáng)條件下在煙草中瞬時(shí)表達(dá)PpPRR5b基因的光合作用表現(xiàn)分析

3 討論與結(jié)論

梨樹光合作用水平是影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素,然而光合作用調(diào)控機(jī)制仍不清楚。樹體冠層結(jié)構(gòu)影響到了光照的滲透與分布,進(jìn)而對(duì)光合作用水平產(chǎn)生影響[13]。研究表明,在郁閉冠層環(huán)境下紅光和藍(lán)光水平顯著地降低[18-19]。生物鐘基因是植物適應(yīng)外界光照等環(huán)境變化,長(zhǎng)期進(jìn)化出來(lái)的一種內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。擬南芥生物鐘基因AtPRR5能夠在紅光條件下抑制下胚軸的延長(zhǎng)[11],“紅光或遠(yuǎn)紅光信號(hào)途徑”也被發(fā)現(xiàn)是AtPRR5直接靶基因富集的類別[8],這說(shuō)明了AtPRR5具有響應(yīng)紅光信號(hào)的特性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,梨PpPRR5a和PpPRR5b基因是擬南芥AtPRR5同源基因[15]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)同源基因參與到了梨樹光合作用的調(diào)控中[14]。PpPRR5a和PpPRR5b在紅光誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出明顯上下波動(dòng)的表達(dá)變化模式,說(shuō)明其表達(dá)水平也受到紅光信號(hào)的調(diào)控[15]。AtPRR5響應(yīng)紅光的特性也支持了PpPRR5基因在紅光信號(hào)誘導(dǎo)過(guò)程中可能發(fā)揮重要功能的假設(shè)。盡管PRR基因已被證實(shí)是植物晝夜節(jié)律的關(guān)鍵調(diào)控者,但是PRR基因在其他光依賴農(nóng)藝性狀中的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究揭示。紅光是光合作用的重要光譜區(qū)段,其在不同冠層條件下會(huì)發(fā)生顯著變化[17]。PpPRR5a已被證實(shí)在紅光誘導(dǎo)情況下具有抑制光合作用的功能,但是PpPRR5b的功能還未解析。本研究克隆了PpPRR5b基因,在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果顯示PpPRR5b能顯著抑制凈光合速率、氣孔導(dǎo)度及胞間CO2濃度水平,證明PpPRR5b是光合作用的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

本研究克隆了梨PpPRR5基因并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析,發(fā)現(xiàn)其和PpPRR5a具有相似的抑制光合作用的功能。后續(xù)可進(jìn)一步探究多個(gè)梨PpPRR基因是否能夠形成協(xié)同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以及它們是不是通過(guò)與其他蛋白互作的方式在調(diào)控光合作用發(fā)揮功能。這將為今后利用分子育種手段培育耐郁閉梨樹種質(zhì)資源提供一定參考。