彭清晨 楊光 李英 李澤倫 豐華

1.四川省成都市公安局溫江區(qū)分局 2.公安部第一研究所

引言

在日常法醫(yī)DNA檢驗分析中，檢測平臺一般由遺傳分析儀和配套試劑耗材兩大部分組成[1]。我國自2010年研制成功首臺GA118-16A遺傳分析儀以后[2]，又相繼推出了GA118-16B、GA118-24B系列遺傳分析儀，并在全國130多家法醫(yī)DNA實驗室得到大規(guī)模推廣應用，徹底解決了“卡脖子”的難題。

配套試劑耗材作為DNA檢驗過程中的重要組成部分，30多年來我國法醫(yī)DNA實驗室一直依賴進口，價格連年上漲且時而發(fā)生斷供現(xiàn)象，嚴重阻礙了我國DNA技術(shù)的發(fā)展[3]。因此國內(nèi)廠商一直致力于國產(chǎn)配套試劑耗材的研制，楊敏等采用LIZ500標準品、3130xL遺傳分析儀對國產(chǎn)NuHi-POP4凝膠與ABPOP-4凝膠進行了平行比對測試，從電泳時間、電流、分辨率等方面進行了電泳分離效果的比較[4]；孫敬等利用案件樣本和3130xL遺傳分析儀對國產(chǎn)凝膠、甲酰胺、電泳緩沖液等進行了分型一致性的驗證實驗[1]。上述研究表明國產(chǎn)凝膠、甲酰胺、緩沖液等耗材均達到國外同類產(chǎn)品的技術(shù)水平，可以實現(xiàn)國產(chǎn)化替代，但由于當時國產(chǎn)遺傳分析儀并未得到大范圍推廣應用，凝膠等試劑耗材的驗證均在進口3130xL遺傳分析儀上進行，采用的是進口毛細管陣列，研究中用到的凝膠、甲酰胺、緩沖液等也并未實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應用。

成都市公安局溫江區(qū)分局DNA實驗室自2022年引入公安部第一研究所研發(fā)的GA118-24B遺傳分析儀之后，對儀器進行了全面的比對測試，產(chǎn)品性能完全滿足實際檢案需求[5]。24B遺傳分析儀配套國產(chǎn)電泳耗材，包括24通道毛細管陣列、SG系列分離膠、高濃度緩沖液、高純度甲酰胺等，成功解決了我國數(shù)十年來電泳耗材受制于人的技術(shù)難題，同時有效降低了使用成本，為我國今后DNA技術(shù)的發(fā)展和進步奠定了堅實基礎(chǔ)。GA系列耗材可完全適配GA118系列遺傳分析儀，同時兼容進口儀器，本文運用控制變量法設(shè)計相關(guān)實驗，通過案件和建庫樣本驗證全套國產(chǎn)耗材與進口耗材的數(shù)據(jù)分型結(jié)果基本一致，通過各項性能驗證，GA系列耗材可以滿足公安機關(guān)DNA日常檢案的工作需求[6]。

一、主要儀器與耗材

（1）GA118-24B遺傳分析儀、VeriFilerTMPlusPCR擴增試劑盒；

（2）進口耗材：ABPOP4凝膠、Buffer(10×)、甲酰胺、24通道毛細管陣列；

（3）國產(chǎn)耗材：SG2快速分離膠、高濃度緩沖液、高純度甲酰胺、24通道毛細管陣列（CA118-24L36）；

（4）案件樣本擴增產(chǎn)物及其它輔助實驗耗材。

二、實驗方法

（1）樣本準備：擴增案件檢材、口腔拭子各1板（92個），擴增產(chǎn)物均加1μl；

（2）平行測試：以GA118-24B為平臺，使用全套進口耗材電泳上述兩板樣本；完成后換成全套國產(chǎn)耗材，進行空間校正和光譜校正后電泳，電泳模型采用相同參數(shù)。上樣電壓：1.2kv，進樣時間：10s，采集延遲時間：1s，運行電壓：15kv，運行時間：1200s；

（3）重復性測試：采用國產(chǎn)耗材重復電泳上述兩板樣本3次；

（4）可靠性測試：國產(chǎn)耗材在儀器上放置3天后再次電泳上述兩板樣本（樣本在-20℃冷凍保存）；

（5）采用GeneMapperTMID-X分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

三、實驗結(jié)論

（一）電流波動范圍

在毛細管電泳過程中，電泳電流的大小和波動范圍是重要參數(shù)，電流過大會導致毛細管內(nèi)部產(chǎn)生的熱量增加，電流波動范圍過大表明電泳回路存在氣泡或緩沖液體系不夠穩(wěn)定，二者均會影響凝膠的篩分效果和電泳遷移率。實驗數(shù)據(jù)表明進口耗材的電泳電流為175～200μA，波動范圍為25μA，國產(chǎn)耗材的電泳電流為140～170μA，波動范圍30μA，二者波動范圍差別不大，國產(chǎn)耗材的電泳電流更低一些，二者均可達到較好的篩分效果和穩(wěn)定的遷移率，內(nèi)標質(zhì)量（SQ值）均可達0.9以上。

（二）國產(chǎn)耗材分辨力

使用全套國產(chǎn)GA系列耗材測試，Ladder（等位基因分型標準物）的峰型、峰高與進口耗材相比無明顯差別，如圖1、圖2所示。

D1S1656基因座中的4個等位基因15.3、16、16.3、17兩組相差1bp的DNA片段均能夠被正確分辨識別，證明全套國產(chǎn)GA118系列耗材電泳時可有效篩分相差1bp的等位基因片段，分辨力≤1bp，如圖3所示。

（三）平行測試

92個案件檢材和92個口腔拭子檢材在相同的參數(shù)下電泳，對比果顯示，國產(chǎn)耗材與進口耗材的電泳分型結(jié)果一致，國產(chǎn)耗材的峰高約為進口耗材的95%左右，如圖4所示。

（四）重復性測試

采用國產(chǎn)耗材對上述兩板樣本重復電泳3次，得到的分型結(jié)果和峰高均一致。

（五）可靠性測試

將國產(chǎn)耗材放置3日（72小時）后，重新電泳上述兩板樣本，得到的數(shù)據(jù)從分型上與第一次電泳一致，峰高約為第一次峰高的80%左右，考慮到樣本降解等因素，此差別在可接受范圍內(nèi)，結(jié)果如圖4所示。

（六）電泳時間

經(jīng)測試，GA系列耗材每組實驗的電泳時長均短于進口耗材（同樣環(huán)境同一運行參數(shù)條件下），內(nèi)標LIZ 600中最長的600bp片段在進口耗材中出峰時間為7300幀，在國產(chǎn)耗材中出峰時間為4800幀，如圖5、圖6所示。因此在使用國產(chǎn)GA系列耗材、VeriFilerTMPlusPCR試劑盒時，在保證所有小于600bp的DNA片段熒光信息全部采集到情況下，可將運行時間縮短至800s，比采用進口耗材縮短電泳時間6分鐘左右[7]。

四、實戰(zhàn)應用

2023年6月，任某報稱其酒后昏迷疑似被三人輪奸，三名嫌疑人拒不承認，辦案民警隨即將受害人所穿內(nèi)褲送檢。

檢驗人員采用二步法提取內(nèi)褲上人精子，VeriFilerTMPlusPCR試劑盒擴增，GA118-24B遺傳分析器及全套國產(chǎn)GA系列耗材進行電泳檢測，最終獲得一混合斑，包含兩名嫌疑人的DNA分型，分型準確無誤，結(jié)果如圖7所示，該案順利告破。

本實驗室自2022年1月運行，分別采用進口耗材和國產(chǎn)耗材在GA118-24B平臺上進行DNA檢驗，截止目前累計檢驗樣本3000余份，其中采用國產(chǎn)GA系列耗材檢驗700余份，與進口耗材相比，檢出率無明顯差距，檢驗分型準確，結(jié)果可靠[5]。

五、結(jié)語

綜上所述，國產(chǎn)GA系列耗材與進口耗材在GA118-24B測序儀上的主要性能指標基本一致，通過多次驗證實驗，所得數(shù)據(jù)、峰型等基本無差異，在電泳精度、靈敏度等方面滿足檢案需求，同時縮短了電泳時間，提高了檢驗效率，符合當下公安工作“快檢”“快比”的實戰(zhàn)要求。