蘇少林, 張文娟

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 陜西 楊陵 712100)

隨著餐飲業(yè)發(fā)展的多樣化,餐飲廢水油脂物含量越來越高,其化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜,給廢水處理增加了困難。脂肪酶又被稱為甘油三酰酯水解酶,是能將天然油脂的酯鍵水解的一種酶[1],根據(jù)國內(nèi)外許多研究[2-4]表明,它能快速地水解甘油三酯的酯鍵并釋放脂肪酸和甘油。Rosa等[5]研究表明,水解反應(yīng)階段是餐飲廢水處理中限制反應(yīng)速度最重要的一步,脂肪酶在水解過程中起關(guān)鍵性作用[6]。

脂肪酶廣泛存在于動物體胰腺內(nèi)、植被的油料種子和各種細(xì)菌真菌[7]微生物中,在微生物中發(fā)現(xiàn)的脂肪酶種類最多,常見于細(xì)菌、酵母菌和真菌中,非常容易獲得,可以大批量的生產(chǎn),而且具有比動、植物體內(nèi)脂肪酶更高的pH存在范圍值和耐高低溫性,因此成為了工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的重要來源。當(dāng)前的脂肪酶相對于普通的化學(xué)催化劑,生產(chǎn)的成本仍然偏高,因此篩選出新型的酶微生物和優(yōu)化反應(yīng)酶的條件具有重要意義。本研究從某高校食堂下水道采集含油廢水,從廢水樣中分離篩選出產(chǎn)脂肪酶的菌株,進(jìn)行多次復(fù)篩,純化后測定酶活力,最終得到能產(chǎn)脂肪酶的高效菌株,并觀測其特性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本次實驗選自某高校食堂下水道中的廢水為研究對象,裁剪相同規(guī)格大小的無菌紗布,分幾次蘸取下水道排污口的含油物質(zhì)用來篩選產(chǎn)酶菌株。

1.2 主要試劑和儀器

蛋白胨(AR)、牛肉膏(AR)、瓊脂粉(BR)、氯化鈉(AR);PHS-25pH計、SW-CJ-2FD超凈工作臺、SPX-150-Z恒溫振蕩培養(yǎng)箱、AR1140型電子分析天平、JB-2磁力攪拌器、ZSD-1270全自動化生化培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、3K15冷凍離心機(jī)。

1.3 培養(yǎng)基

(1)普通篩選培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,牛肉膏粉3 g/L,氯化鈉5 g/L,瓊脂15 g/L,再添加0.05%的羅丹明B(篩選培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min)和1%的三丁酸甘油酯的普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基,最終pH 7.3～7.5。

(2)液體種子培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,121℃高壓滅菌16 min。

(3)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO42 g/L,NaCl 3 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,橄欖油2 mL/L,pH7.0。

1.4 實驗方法

1.4.1 產(chǎn)脂肪酶微生物的分離 從食堂下水道采集含油廢水水樣,無菌條件下,將一份5g的樣品加入一個裝有45ml無菌水并且瓶內(nèi)放有一定數(shù)量的玻璃珠的錐形容器中,然后放置于搖床。利用磁力攪拌器的作用使其充分振蕩,打散搖勻水樣中的膠團(tuán)使其游離菌跑出來,完全混合均勻后取出在室溫條件下靜置分層30～40 min,取上清菌液按梯度分別制成1∶10的稀釋液。用一次性無菌塑料吸管吸取上清液,用同樣的操作方式配制成稀釋度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度懸菌液。分別從以上7個梯度依次吸取0.1 mL,接種于事先配制好的普通篩選培養(yǎng)基的平板上,于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)2 d左右。每天都要觀察菌落的存在,以及附近有無黃色透明圈出現(xiàn),將沒有透明圈的菌落淘汰出去,有透明圈的挑選出并進(jìn)行檢測純化,重復(fù)多次直至變?yōu)榧兎N后置于冰箱中,調(diào)節(jié)冰箱溫度至4 ℃,將培養(yǎng)基傾斜保存。

1.4.2 產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選

(1)產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩。將分離保存的無菌菌株從冰箱中取出,用接種環(huán)分別涂布于單個的篩選培養(yǎng)基平板上,37 ℃條件下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d～3 d。然后將其取出來,采取肉眼觀察法記錄產(chǎn)生黃色透明圈的菌株。透明圈法[8]作為篩選酶最簡捷的辦法之一,需要每隔24 h觀察透明圈的顏色及大小,并測量菌落透明水解圈的直徑(D)以及菌落的直徑(d),然后算出兩者的比值大小,觀察顏色的透明度等,大致推算出酶活力的大小。二者的比值相差越大,該菌株產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。把比值相差大的菌落用金屬接種環(huán)轉(zhuǎn)移至固體的斜面培養(yǎng)基上,使用劃線培養(yǎng)的辦法進(jìn)行多次劃線培養(yǎng),4℃保存供復(fù)篩備用。

(2)產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩。挑取初篩得到的具有酶活性的成熟菌落于液體種子培養(yǎng)基中,在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下,在搖床振蕩中培養(yǎng)12 h,然后在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),接種量以1%的比例接入培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)大約24 h。取適量的上清菌液于冷凍離心機(jī)中,以速率2 500 r/min離心6 min左右,消除酶溶液中的泡沫,取上清菌液進(jìn)行酶活測定,進(jìn)一步得到更高活性菌株。

(3)脂肪酶活力測定。本實驗采用指示劑滴定法[9]來測定酶活力,以下為具體操作方法。

取兩個容量為100 mL的干凈無水漬的錐形瓶,分別在錐形瓶上標(biāo)記為空白①和樣品②,在瓶中分別加入橄欖油乳化液(3%的聚乙烯醇:橄欖油=3∶1的比例混合) 4 mL,pH為7.5,現(xiàn)配制的磷酸緩沖鹽溶液5 mL,再于①中加入95%的無水乙醇15.00 mL,在40 ℃的水浴鍋中保溫反應(yīng)5 min,然后各加1 mL的粗制酶液(需配制),晃勻后立即使用電子手表計時,準(zhǔn)確反應(yīng)15 min后,于②中即刻一次性補(bǔ)加15.00 mL 95%無水乙醇后停止反應(yīng),用濕抹布取出。

于①、②中各滴加早先配制的酚酞溶液兩滴,用0.5 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,直至溶液從無色變?yōu)槲⒓t,并保持在30 s內(nèi)顏色不褪,此刻視為滴定終點,結(jié)束操作。記下使用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,根據(jù)損耗的堿量計算酶活力大小。

(4)脂肪酶菌株形態(tài)學(xué)測定。參照《微生物分類學(xué)》《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對篩選出的菌落進(jìn)行初步形狀的觀察[10]。例如菌落的大小、形狀、顏色、凸起情況、表面有無褶皺、是否透明等等。

1.4.3 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的分析

(1)溫度對酶活性的影響。設(shè)置反應(yīng)轉(zhuǎn)速為150 r/min,將酶液分別放在25～65 ℃條件下,挨個測量脂肪酶活力的最適宜生存溫度,然后再將酶菌液分別放于30～75 ℃的恒溫水浴鍋中,保溫反應(yīng)60 min,其中每間隔20 min需要檢測殘余菌株的酶活。重復(fù)做3次平行實驗,得到最佳溫度。

(2)初始pH對酶活性的影響。主要選用磷酸鹽緩沖液作為本實驗的緩沖體系,然后進(jìn)行脂肪酶水解活性[11]的測定。取適量的粗制酶液,分別與pH為5～9的緩沖溶液等體積混合攪拌至均勻,在40 ℃前提下存放24 h以后,測量殘余酶活,得到最佳初始pH值。重復(fù)做3次平行實驗,獲得脂肪酶活性存在的最適pH。

(3)金屬離子對酶活性的影響。按次序在酶菌液中各加入10 mmol/L的Cu2+、Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以等體積比例混合,室溫情況下靜置一段時間,然后測定其中的酶活,與沒有加任何金屬離子的空白酶液作為它的對照試驗,測量殘余的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離和篩選

含油餐飲廢水水樣經(jīng)過分離、初篩、復(fù)篩等過程使菌株大量繁殖生長[12],劃線分離數(shù)次,獲得適應(yīng)環(huán)境生長的產(chǎn)脂肪酶菌株。經(jīng)過初篩可以獲得透明圈與菌落直徑比值較大的菌株,當(dāng)比值≥3.0時,統(tǒng)計出35株產(chǎn)酶能力較好的菌落(大部分酶活在5～11 U/mL之間)透明圈水解圖如圖1所示。進(jìn)一步復(fù)篩之后得到8株透明圈明顯的菌株,但范圍較小,將肉眼可見的菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)。產(chǎn)酶菌株隨時間生長變化檢測成果如表1所示。由表1可以看出,F-11的酶活力最高,其值為10.96 U/mL。本次實驗以F-11菌株作為出發(fā)菌株,對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)[13]的探討。

表1 產(chǎn)脂肪酶菌株酶活力大小的比較

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株在三丁酸甘油酯平板上形成的水解圈

2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株F-11在營養(yǎng)瓊脂平板上38 ℃培養(yǎng)2～3 d進(jìn)行形態(tài)觀察[14],發(fā)現(xiàn)F-11 表面有鞭毛,直徑2～5 cm,表面粗糙有隆起、褶皺,菌落顏色灰綠色,菌體頎長而且長度不一樣,有些是球桿狀,有些為線狀,成雙或者呈短鏈狀排布。在視野比較暗的顯微鏡下可觀測細(xì)菌運動活潑。初步判斷為革蘭氏陰性桿菌。

2.3 菌株所產(chǎn)脂肪酶的性質(zhì)

2.3.1 溫度對脂肪酶酶活力的影響與熱穩(wěn)定性 由圖2看出,溫度為25～30 ℃時,菌株F-11的產(chǎn)酶能力伴隨著溫度的升高,而呈上升趨勢,30 ℃產(chǎn)酶能力最高,可高達(dá)為88.6%左右,30 ℃之后產(chǎn)酶能力伴隨著溫度的升高反應(yīng)活性反而呈下降趨勢,因此,認(rèn)為菌株F-11的最適產(chǎn)酶溫度為30 ℃。然而在40 ℃以后產(chǎn)酶能力快速呈直線下降趨勢,脂肪酶在65 ℃時殘留活力僅為初始反應(yīng)的40%左右。

圖2 溫度對脂肪酶活性的影響

2.3.2 初始pH對脂肪酶酶活力的影響 圖3表明:當(dāng)初始pH小于7.5時,隨著pH值的逐漸增大,酶活力也呈逐漸增長趨勢。當(dāng)pH等于7.5時,酶的活性最大,可達(dá)到88.9%左右。pH在5～7.5之間,酶活性處在較高水平。pH在7.5～9處,酶活性明顯降低。pH在較高或較低水平時,都會對酶活力產(chǎn)生影響,因此,最佳此菌落初始pH為7.5。

圖3 初始pH對脂肪酶酶活力的影響

2.3.3 金屬離子對酶活性的影響 金屬離子可以與酶結(jié)合,對酶的構(gòu)象排布起穩(wěn)定作用,也可以作用與界面生成自由脂肪酸,減少抑制作用,從而改變酶活力的大小。表2顯示,在本次實驗中Ca2+對酶活性有一定的激活作用,酶活為19.06 U/mL。K+對本次實驗產(chǎn)生的菌株酶活性大體上沒有影響,Cu2+、Fe2+、Mg2+對酶活性存在明顯的抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng),由表2可知最小為5.23 U/mL。

表2 金屬離子對酶活性的影響

3 結(jié) 論

本實驗從高校食堂下水道中分離篩選出一株高脂肪酶活力菌株F-11,經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為革蘭氏陰性桿菌。通過對F-11菌株酶活性的探討,反應(yīng)轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min時,最佳初始pH為7.5,最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃,菌株酶活性最高為10.96 U/mL。本次實驗的研究,為含油廢水中油脂的生物降解篩選出了高效產(chǎn)脂肪酶菌株。該菌株在溫度25～30 ℃和pH為5～7.5協(xié)同發(fā)酵時,脂肪酶酶活力趨于穩(wěn)定,酶活損失較小。而在添加金屬離子抑制劑時,Ca2+對酶活有一定的促進(jìn)作用,K+基本無影響,Cu2+、Fe2+、Mg2+存在極大的抑制作用,尤其是Cu2+抑制作用更甚。