直接進樣-氣相色譜質(zhì)譜法快速測定芝麻香白酒及酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分的研究

呂曉鳳，孟 武，劉玉濤，張夢夢，盧春玲，李 強，馬春蓮，邱振清，韓云翠，趙巧珍，胥鑫鈺，高紅波

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟南 250353；2.濟南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司技術(shù)質(zhì)量部，山東濟南 250115；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

白酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，更是中國人民智慧的象征。自中國建國以來，芝麻香型白酒一直是中國的創(chuàng)新白酒之一，綜合感官具有焙烤芝麻香的優(yōu)雅細膩，其生產(chǎn)工藝更是結(jié)合醬香、清香、濃香3種白酒香型的特點，獨成一家[1]。

芝麻香白酒及其酒醅中存在吡嗪類風(fēng)味組分，吡嗪類風(fēng)味組分主要貢獻為堅果香、焙烤香。吡嗪類風(fēng)味組分的香氣閾值高，濃度低，OAV 值較小，但其對一些白酒起到重要的作用。吡嗪是在1,4 位含氮的六元雜環(huán)化合物，其衍生物在自然界中非常豐富，特別是在食品和飲料中，是一類重要的食品雜環(huán)香料[2-4]。自然界中存在著各種形式的吡嗪類化合物，也是各類香型白酒中均可檢出的一類微量健康成分[5-7]，尤其是在醬香型白酒和芝麻香白酒中含量較多，具有特殊的焦糊香和獨特的健康功能。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是醬香型、芝麻香型白酒中極其重要的香氣物質(zhì)[8]，有焙烤芝麻、可可等氣味[8-10]，四甲基吡嗪作為川芎的有效藥用成分，在心腦血管方面有顯著效果，同時作為香料廣泛應(yīng)用于食品調(diào)香中[11-16]。當(dāng)今社會，人們追求風(fēng)味健康雙導(dǎo)向，在追求風(fēng)味的同時，更加關(guān)注健康功能[17]。因此，對于吡嗪風(fēng)味組分的檢測成為主要研究方向。近年來，王佳琳[18]在研究一種格瓦斯飲料的制作時，創(chuàng)建了一種固相萃取-氣相色譜法來測定四個主要的吡嗪化合物，并且分析比較3 種萃取頭，得出最佳萃取頭為75 μm CAR/PDMS；程偉[19]在研究馥合香白酒的風(fēng)味特征時，采用SPME-GC-MS 結(jié)合OAV 進行金種子酒的分析與感官評價；龍四紅等[17]建立高效液相色譜（HPLC）法測定白酒中8 種吡嗪類化合物含量的方法，并進行了方法學(xué)研究；蘇寧等[20]建立了一種測定高溫大曲中吡嗪類化合物含量的方法，采用直接進樣法進GC-MS，進行分析；喬慧等[21]應(yīng)用氣相色譜與NPD 檢測器聯(lián)用技術(shù)，建立了快速測定白酒中吡嗪類化合物的方法；王莉等[22]采用氣相色譜-質(zhì)譜-離子掃描聯(lián)用法快速檢測白酒中4 種吡嗪類化合物。本研究采用直接進樣法-GC-MS 對芝麻香白酒及酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分進行檢測，總共檢出8 吡嗪類風(fēng)味組分，該方法與固相微萃取相比更加簡潔、高效。

芝麻香白酒及其酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分含量與酸、酯、醇類相比，含量甚微，因此其定性定量存在一定程度的困難。本試驗采用直接進樣-氣相色譜質(zhì)譜法對芝麻香白酒以及酒醅中的吡嗪類味組分進行測定，建立直接進樣-氣相色譜質(zhì)譜法快速測定芝麻香白酒以及酒醅中的8 種吡嗪類風(fēng)味組分的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗樣品：芝麻香型白酒，來自濟南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司；酒醅，取自濟南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司芝麻香手工釀造班組入池酒醅。

試劑及耗材：無水乙醇（色譜純）；內(nèi)標(biāo)物：2-甲氧基-3-甲基吡嗪；吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品：2-甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙基吡嗪。內(nèi)標(biāo)物與吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.9%，均購于百靈威科技有限公司。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫7890 A-5975 C)；恒溫磁力攪拌器；磁力轉(zhuǎn)子；移液槍；秒表；FA2004 精密電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；UPR 超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；KQ2200E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣相色譜分析條件（表1）

表1 氣相色譜分析條件

1.2.2 質(zhì)譜條件(表2)

表2 質(zhì)譜分析條件

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 吡嗪類混標(biāo)儲備溶液（100 mg/L)

準(zhǔn)確稱取2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g（精確至0.0001 g）于容量瓶中，使用無水乙醇定容至100 mL，配制成100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.3.2 吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L)

準(zhǔn)確吸取10 mL吡嗪類混標(biāo)儲備溶液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶液定容至100 mL，配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.3.3 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲備液（100 mg/L)

準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確至0.0001 g）2-甲氧基-3-甲基吡嗪標(biāo)品于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶液定容，配制成濃度為100 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲備溶液。

1.2.3.4 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)使用液（10 mg/L)

準(zhǔn)確吸取10 mL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)儲備液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成濃度為10 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)使用液。

1.2.3.5 吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別取適量吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液于容量瓶中，用無水乙醇溶液定容混勻，逐級稀釋成一系列的標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度，待用。

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 芝麻香白酒樣品

準(zhǔn)確吸取芝麻香白酒1 mL，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，壓緊瓶蓋后，快速搖勻器進行搖勻。

1.2.4.2 芝麻香酒醅樣品

取酒醅5 g，加15%無水乙醇（色譜純）30 mL，超聲30 min，10000 r/min 離心5 min，離心后經(jīng)0.22 μm 無機濾膜進行過濾，吸取1 mL 濾液放入進樣瓶中，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，壓緊瓶蓋后，快速搖勻器進行搖勻。

1.2.5 定性定量方法

定性：SCAN 模式下，使用NIST 08 標(biāo)準(zhǔn)光譜庫進行定性，以確定被監(jiān)測離子的參數(shù)。

定量：根據(jù)SCAN 檢測模式得到的離子檢測參數(shù)，建立SIM 檢測模式，利用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2.6 檢出限、精密度、重復(fù)性實驗

以信噪比S/N 為3，計算出方法的檢出限；在同一試樣中分別加入3 個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品進行加標(biāo)回收實驗；每個濃度分別做6 個平行樣品，以6 個平行樣品實驗數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度（relative standard deviation,RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)品、樣品的定性定量檢測分析

通過表3 的定性定量分析，確定了8 種吡嗪類化合物的定量離子，通過保留時間與定量離子，建立8 種吡嗪類化合物的SIM 檢測模式，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法，建立吡嗪類風(fēng)味組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，芝麻香白酒中8種吡嗪類化合物色譜圖見圖1。

圖1 芝麻香白酒中8種吡嗪類化合物色譜圖

表3 8種吡嗪類風(fēng)味組分監(jiān)測離子參數(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳色譜條件下進行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8 種吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 8種吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

由表4 可知，在100～5000 μg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上，符合準(zhǔn)確定量的要求。

2.3 重復(fù)性實驗以及加標(biāo)回收率實驗

取芝麻香白酒樣品，檢測吡嗪類風(fēng)味組分含量，根據(jù)測定含量分別加入250 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L 濃度的吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品進行加標(biāo)回收試驗，每個濃度分別做6 個平行樣品，以6 個平行樣品實驗數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度（relative standard deviation,RSD)，結(jié)果見表5。

表5 方法的精密度及回收率試驗結(jié)果

由表5 可知，8 種吡嗪類風(fēng)味組分的RSD≤10，結(jié)果證實該方法具有良好的重現(xiàn)性；8 種吡嗪類風(fēng)味組分的平均回收率在87%～110%之間，表明該方法是可行的，因此可以滿足本研究中對芝麻香白酒中吡嗪類風(fēng)味組分測定的實驗要求。

2.4 樣品檢測-驗證性分析實驗

用所建立的方法對六個芝麻香白酒樣品以及堆積過程中酒醅吡嗪類風(fēng)味組分含量進行測定，結(jié)果見表6、表7。

表6 芝麻香白酒酒樣中吡嗪類風(fēng)味組分的測定

表7 堆積過程吡嗪類風(fēng)味組分的測定

由表6 可知，從吡嗪類風(fēng)味組分總量分析，2#酒樣遠高于其他酒樣，然后依次是3#和4#酒樣、6#酒樣，1#酒樣和5#酒樣的含量相對較低。1#酒樣中總的含量最低，除2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相對較高，其他物質(zhì)都很少。2#酒樣中除2,5-二甲基吡嗪外，其他吡嗪均高于其他酒樣，尤其是2,3-二甲基吡嗪高于其他酒樣。3#酒樣中四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪含量較為突出。4#酒樣中2,5-二甲基吡嗪的含量高于其他酒樣，另外2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量較高。5#酒樣中四甲基吡嗪含量較高，2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均為220～270 μg/L。6#酒樣無論從總量還是各類吡嗪的含量而言，與4#酒樣比較接近。

堆積過程中，芝麻香酒釀造原料含氮量高，采用高溫大曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒的生產(chǎn)工藝，有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生，所以含氮化合物含量高，特別是吡嗪類化合物含量高[23]。但是表7結(jié)果反映出在堆積過程中，除了2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有較為明顯的升高，其他吡嗪類并沒有顯著提高。推測可能由于堆積時間短，美拉德反應(yīng)未完全進行或只產(chǎn)生部分前體物質(zhì)。結(jié)果表明，該方法可以用于芝麻香白酒以及酒醅中8 種吡嗪類化合物的快速檢測。

3 結(jié)論

基于直接進樣-氣相色譜質(zhì)譜法，快速測定芝麻香白酒及其酒醅中8 種吡嗪類化合物，結(jié)果表明，8 種吡嗪線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法最低檢出限為10 μg/L，加標(biāo)回收率為87%～116%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3 %～10 %。該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，準(zhǔn)確度高、精密度好，可用于芝麻香白酒以及酒醅中吡嗪類風(fēng)味組分的常規(guī)檢測。

堆積過程是一個開放式的發(fā)酵過程，可以網(wǎng)羅空氣中的微生物進行聯(lián)合發(fā)酵。2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有較為明顯的升高，其他吡嗪類并沒有顯著提高，推測可能由于堆積時間短，美拉德反應(yīng)未完全進行或只產(chǎn)生部分前體物質(zhì)，后續(xù)可以進行具體機理的深入研究。