胡騫予,趙婭紅,呂怡穎,鄧晨宵,肜 磊,盧 超,余 磊,戴利利,齊 穎,高鵬華,蔡憲杰,閆 鼎,黃飛燕,韓天華

(1.昆明學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,昆明 650214;2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海 200082;3.云南省煙草公司麗江市公司,云南 麗江 674100)

【研究意義】近年來(lái),關(guān)于土壤健康和土壤質(zhì)量問(wèn)題逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。土傳病害頻發(fā)導(dǎo)致作物大量減產(chǎn),為保護(hù)土壤資源,踐行可持續(xù)發(fā)展,生物炭在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[1]。生物炭是生物質(zhì)在缺氧或無(wú)氧條件下經(jīng)高溫裂解后產(chǎn)生的一類富含碳元素的高度羧酸酯芳香有機(jī)物[2]。因其碳質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被生物降解,孔隙發(fā)達(dá)具有強(qiáng)吸附能力[3],施入土壤可以改變土壤理化性質(zhì),繼而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤根際微生物對(duì)環(huán)境的變化具有高敏感性[4],在一定程度上反映著土壤質(zhì)量[5]。【前人研究進(jìn)展】馮慧琳等[6]研究表明,施用生物炭1.2 t/hm2可提高感染青枯病煙株根際土壤的碳氮比,影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu),降低厚壁菌門等致病菌豐度,維持根際土壤微生態(tài)的健康,促進(jìn)煙株健康發(fā)育,降低發(fā)病率。王博等[7]研究表明,在減氮40%的條件下,施用生物炭可以提高煙株根系活力,促進(jìn)根系發(fā)育,提高根際土壤微生物數(shù)量。許躍奇等[8]研究表明,有機(jī)肥與生物炭配施可以提高煙田褐土土壤細(xì)菌與真菌、放線菌和真菌的比值,改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。何甜甜等[9]研究表明,等碳量添加秸稈和生物炭,可以提高土壤呼吸速率及微生物生物量,生物炭與秸稈的交互效應(yīng)為正值。楊敏等[10]研究表明,施用生物炭可以提高連作烤煙根際土壤微生物多樣性與豐富度,改良土壤微生態(tài)環(huán)境,緩解化感自毒引起的連作障礙?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,通過(guò)施用生物炭來(lái)改良修復(fù)植煙區(qū)土壤、調(diào)整微生物種群結(jié)構(gòu)、提高煙葉質(zhì)量與產(chǎn)量的研究較多。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù),深入討論施用不同量生物炭對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育較關(guān)鍵的旺長(zhǎng)期煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和種群功能的變化,以期為云南地區(qū)植煙土壤的保育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)置與根際土壤樣品采集

試驗(yàn)于2019年6月5日在安寧市植煙區(qū)開展,供試煙草品種為紅花大金元,供試生物炭基本理化性狀見表1。試驗(yàn)設(shè)置3種處理,在常規(guī)施肥減量10%的情況下,分別施用生物炭250 g/株(A1)、300 g/株(A2)、350 g/株(A3),以常規(guī)施肥為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理植煙100株,3次重復(fù),隨機(jī)排列。所有處理栽培條件按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)方式進(jìn)行。

表1 供試生物質(zhì)炭的基本理化性狀Table 1 The basic physicochemical properties of experimental biomass charcoal

采用“S”形5點(diǎn)取樣法采集土壤樣品,在旺長(zhǎng)期(移栽后30 d)采集每處理近煙株根部10 cm處、直徑3 cm、深度15 cm的根際土壤樣品約1000 g,重復(fù)3次。每份土壤樣品充分混勻后分為2份,1份裝入無(wú)菌袋中迅速放入干冰盒中,帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 土壤總DNA提取及PCR擴(kuò)增

煙株根際土壤樣本DNA的提取參照 PowerSoil?DNA土壤基因組DNA試劑盒說(shuō)明書。選用1 ng/μL DNA作為模板,ITS1基因PCR擴(kuò)增選用真菌ITS基因特異性引物 ITS1F (5′-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2R(5′-TGCGTTCTTCATC GATGC-3′)[11]。擴(kuò)增程序:預(yù)變性,95 ℃ 3 min;變性,95 ℃ 3 s;退火,55 ℃ 30 s;延伸,72 ℃ 45 s;再延伸,72 ℃ 10 min,共36個(gè)循環(huán),擴(kuò)增體系為20 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)后純化回收(參照AxyPrep DNA試劑盒方法),委托上海美吉生物進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計(jì)分析

剔除下機(jī)數(shù)據(jù)中的標(biāo)簽及引物序列,進(jìn)行序列拼接得到原始數(shù)據(jù);使用軟件 Usearch(version 7.0)進(jìn)行過(guò)濾,去嵌合體序列,得到有效序列;利用軟件Mothur 繪制稀釋度曲線(圖1),判定此次測(cè)序量能否真實(shí)反映樣品中真菌實(shí)際情況;同時(shí)計(jì)算文庫(kù)覆蓋率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù),對(duì)根際土壤真菌群落中的物種多樣性和豐富度進(jìn)行評(píng)價(jià);在 97%相似性水平上用軟件 Uparse 進(jìn)行 OTUs 聚類分析;利用 SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件 RDP classifier對(duì)物種進(jìn)行注釋,并運(yùn)用 Student’sT檢驗(yàn)對(duì)排名前10 菌屬的相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn);使用軟件Qiime 進(jìn)行主成分分析;采用FUNGuild進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè);運(yùn)用軟件Excel 2017、SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測(cè)序深度驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)4組根際土壤進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析,共得到有效序列18 7920條,平均覆蓋率超過(guò)99%,當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到40 000時(shí),曲線趨于平緩,說(shuō)明序列數(shù)的進(jìn)一步增加不會(huì)引起較多新 OTU 的出現(xiàn)。本次對(duì)煙株根際土壤的測(cè)序深度趨于飽和,真菌群落置信度較高,能夠較為全面的反映根際土壤樣品真菌群落與結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。

2.2 真菌的OTU豐度和α多樣性

由表2可知,各處理真菌群落Shannon指數(shù)表現(xiàn)為A3>A2>A1>CK,Simpson指數(shù)表現(xiàn)為A2>CK>A1>A3,ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為A3>CK>A2>A1。Coverage值均在99.19%以上,反映出測(cè)序結(jié)果可以代表樣本真實(shí)情況。由α多樣性指數(shù)可以看出,A3處理真菌群落多樣性及豐富度最高。

表2 不同處理根際土壤真菌α多樣性Table 2 α diversity of fungi in different treatments of rhizosphere soils

2.3 OTU水平樣品主成分分析

主成分分析中,2個(gè)主坐標(biāo)成分是PC1和PC2,PC1主坐標(biāo)成分表示盡可能最大程度地解釋數(shù)據(jù)變化,PC2主坐標(biāo)成分解釋余下變化度中比例最大的主坐標(biāo)成分,樣本間距離表示樣本間相似程度,距離越近說(shuō)明真菌群落間差異越小。如圖2所示,主成分1解釋真菌群落變異的45.58%,主成分2解釋變異的35.26%,兩者共同解釋80.84%。

圖2 OTU水平樣品主成分分析Fig.2 PCoA on OTU level

2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)及差異

門水平(圖3-A)上,子囊菌門(Ascomycota)在各處理中均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其次是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)。子囊菌門的相對(duì)豐度隨著生物炭施用量的增大而逐漸降低,A1、A2、A3較CK(78.63%)分別降低2.72%、15.66%、17.50%;與子囊菌相反,擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度與生物炭的施用量呈正相關(guān),隨著生物炭施用量的增大各處理較CK(6.53%)相對(duì)豐度分別提高9.65%、75.65%、191.58%。被孢霉門在CK中的相對(duì)豐度為10.17%,A2處理較CK增加45.33%,A1、A3處理較CK分別降低34.81%、8.46%,無(wú)明顯變化趨勢(shì);A1、A2、A3處理中未知分類的真菌門的相對(duì)豐度較CK(3.59%)分別增加35.93%、72.98%、54.60%;壺菌門在CK中的相對(duì)豐度為0.79%,A1處理中增加479.75%,A2、A3處理較CK分別降低58.23%、13.92%,無(wú)明顯變化趨勢(shì)。

圖3 門和綱水平上的相對(duì)豐度Fig.3 Community abundance on phylum and class level

綱水平(圖3-B)上,檢測(cè)出主要的種群有糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)和被孢霉綱(Mortierellomycetes)等。其中糞殼菌綱、散囊菌綱、座囊菌綱和錘舌菌綱為子囊菌門;傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)為擔(dān)子菌門;根囊壺菌綱(Rhizophlyctidomycetes)為壺菌門。在施用生物炭處理中,糞殼菌綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為CK(33.35%)>A2(31.92%)>A1(29.94%)>A3(24.97%);散囊菌綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為CK(25.63%)>A3(19.73%)>A1(14.99%)>A2(13.61%),表明施用生物炭處理降低了糞殼菌綱和散囊菌綱相對(duì)豐度。傘菌綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為A3(13.83%)>A2(5.37%)>CK(2.38%)>A1(1.53%);銀耳菌綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(6.03%)>A1(5.19%)>A3(4.47%)>CK(3.76%),表明施用生物炭處理提高了傘菌綱和銀耳菌綱的相對(duì)豐度。被孢霉綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%);錘舌菌綱相對(duì)豐度表現(xiàn)為A1(8.64%)>CK(2.96%)>A3(1.56%)>A2(0.62%),表明施用生物炭處理對(duì)被孢霉綱和根囊壺菌綱無(wú)明顯的影響。

由圖4可知,屬水平上,主要檢測(cè)出被孢霉屬(Mortierella)、青霉菌屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)等合并相對(duì)豐度大于3%的菌屬16類。

圖4 屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Community abundance on genus level

青霉菌屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為CK(16.65%)>A3(11.71%)>A1(8.97%)>A2(2.55%);未知分類毛殼菌科屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為CK(5.37%)>A1(5.02%)>A2(1.63%)>A3(1.59%);枝孢瓶霉屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為CK(3.13%)>A3(2.43%)>A1(2.35%)>A2(2.32%);表明青霉菌屬、未知分類毛殼菌科屬和枝孢瓶霉屬生物炭處理的相對(duì)豐度均低于對(duì)照。鐮刀菌屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(8.28%)>A1(5.94%)>A3(5.83%)>CK(5.82%);未分類的真菌菌群各屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(6.21%)>A3(5.55%)>A1(4.88%)>CK(3.59%);Saitozyma在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(4.38%)>A1(3.61%)>A3(2.93%)>CK(2.28%);錐蓋傘屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A3(5.01%)>A2(3.52%)>A1(0.80%)>CK(0.00);附球菌屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(5.15%)>A3(1.17%)>A1(0.36%)>CK(0.36%);表明鐮刀菌屬、未分類的真菌菌群、Saitozyma、錐蓋傘屬、附球菌屬5個(gè)屬的菌群在生物炭處理中的相對(duì)豐度均高于對(duì)照。被孢霉屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A2(14.52%)>CK(10.09%)>A3(9.23%)>A1(6.58%); 未分類的子囊菌群體各屬在各處理中相對(duì)豐度表現(xiàn)為A1(15.03%)>A2(6.83%)>CK(5.34%)>A3(4.95%),表明這2種菌屬受生物炭影響較小。

屬分類水平上,根據(jù)所有樣品的物種注釋及豐度信息,選取根際土壤真菌豐度排名前35的物種,并按照其豐度信息繪制熱圖(圖5),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CK與A3處于同一分支,表明2組樣品真菌群落結(jié)構(gòu)相似。在所有樣品中,錐蓋傘屬、未知傘菌綱屬、附球菌屬聚為一類,相對(duì)豐度與生物炭的施用量呈正相關(guān)。樹粉孢屬、淡紫紫孢菌、Rhizophlyctis受生物炭影響較大,三者在A1處理中的相對(duì)豐度最高。Paraboeremia、Phialophora在CK和A3處理中相對(duì)豐度較低,在A2處理中相對(duì)豐度較高,無(wú)明顯變化。

圖5 屬水平真菌群落分布Fig.5 Community analysis on genus level

2.5 煙株根際土壤真菌功能預(yù)測(cè)分析

如圖6所示,對(duì)4組樣品利用FUNGuild進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè),以營(yíng)養(yǎng)方式分類,包括病理營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph)、腐生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph)和共生營(yíng)養(yǎng)型(Symbiotroph),基于營(yíng)養(yǎng)方式進(jìn)一步補(bǔ)充細(xì)分,可見未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型(Undefined Saprotroph)、未知營(yíng)養(yǎng)型(Unknown)、植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph)這3種營(yíng)養(yǎng)型群類豐度較高。其中,未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型群類對(duì)應(yīng)真菌有青霉菌屬、木霉菌屬(Trichoderma)、枝孢瓶霉屬等;植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型群類對(duì)應(yīng)的只有被孢霉屬。動(dòng)植物病原-植物病原-未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型(Animal Pathogen-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph)群類豐度在A2和A3處理中有上升趨勢(shì);動(dòng)物病原-排泄物腐生菌-植物內(nèi)生-體表附生-植物腐生-木質(zhì)腐生營(yíng)養(yǎng)型(Animal Pathogen-Dung Saprotroph-Endophyte-Epiphyte-Plant Saprotroph-Wood Saprotroph )群類對(duì)應(yīng)毀絲霉屬(Myceliophthora)、Mycothermus、毛霉菌屬(Mucor)、Dichotomopilus、毛科菌屬(Chaetomium)、Melanocarpus,豐度隨生物炭施用量的增加而下降;植物病原營(yíng)養(yǎng)型(Plant Pathogen)群類對(duì)應(yīng)不整球殼屬(Plectosphaerella)、赤霉屬(Gibberella)、Curvularia、麥角菌屬(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌,這些種群豐度的降低表明施加生物炭可以減緩連作導(dǎo)致的煙草土傳真菌病害。

圖6 土壤真菌FUNGuild功能分類統(tǒng)計(jì)Fig.6 Functional classification and statistics of soil fungi by FUNGuild

3 討 論

本研究通過(guò)不同生物炭施用量探究其對(duì)煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明,施用生物炭可以提高煙株根際土壤真菌多樣性,Shannon指數(shù)隨生物炭施用量的增加而上升,A1、A2、A3處理較CK分別增加1.09%、6.33%、6.55%;Chao1、ACE指數(shù)均在A3處理中最高。土壤理化性質(zhì)與土壤微生物的存活息息相關(guān),微生物依賴于土壤所供給的有機(jī)質(zhì),并且對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的變化具有高敏感性[9-10]。生物炭中的空隙可以提高土壤的透氣性,增加土壤養(yǎng)分含量,為微生物提供更適宜的生存環(huán)境。研究普遍認(rèn)為,微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,總體水平越高,越有利于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡。相反,微生物群落總體水平降低,豐富度及多樣性指數(shù)降低,則會(huì)導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)抗逆性[12-13]、響應(yīng)脅迫的修復(fù)能力變差[14]。本研究中A3處理煙株根際土壤真菌多樣性和豐富度有所提高,在一定程度上有利于維持根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗逆性。

本研究中,各處理根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門,與前人研究結(jié)果相同[15-16]。其中,擔(dān)子菌門與生物炭施用量呈正相關(guān),子囊菌門與施用生物炭量呈負(fù)相關(guān),施用生物炭后優(yōu)勢(shì)真菌種群結(jié)構(gòu)和豐度發(fā)生改變,這一改變可能與真菌的不同生態(tài)策略有關(guān)[17]。子囊菌門大多數(shù)為腐生菌,其相對(duì)豐度與土壤含水量呈正相關(guān),施用生物炭改變了土壤結(jié)構(gòu),透氣性增強(qiáng)可能是造成其相對(duì)豐度下降的原因;擔(dān)子菌門腐生或寄生,在潮濕的土壤中分解木質(zhì)纖維素[18],且擔(dān)子菌門可與植株根系共生形成菌根,提高植株對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用。錐蓋傘屬(傘菌綱)多腐生于中性或略堿性營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤中[19],對(duì)土壤中的纖維素具有強(qiáng)分解活力。擔(dān)子菌門(Saitozyma)相對(duì)豐度在施用生物炭后顯著提高,該類真菌可有效修復(fù)土壤污染,促進(jìn)土壤中氮、磷、鉀元素的礦化[20]。糞殼菌綱和散囊菌綱是導(dǎo)致果樹和林木煤污病的致病真菌,而糞殼菌綱下屬麥角菌屬的衍生物麥角酸能夠?qū)е伦魑餃p產(chǎn)、人和家畜中毒,此類菌群相對(duì)豐度的降低表明生物炭可以改良土壤環(huán)境,減少有害菌數(shù)量。

FUNGuild真菌功能預(yù)測(cè)表明,在所有處理中未定義腐生真菌、未知營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型-共生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度較高。植物內(nèi)生-垃圾腐生-土壤腐生-未定義腐生營(yíng)養(yǎng)型、動(dòng)植物病原-植物病原-未定義營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度變化較大。植物病原營(yíng)養(yǎng)型中不整球殼屬(Plectosphaerella)、赤霉屬(Gibberella)、Curvularia、麥角菌屬(Clavicep)和Aplosporella等植物病原真菌相對(duì)豐度隨生物炭施用量的增加而降低。

4 結(jié) 論

施用生物炭提高了煙草根際土壤真菌的多樣性,改善了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為擔(dān)子菌門相對(duì)豐度提高,子囊菌門相對(duì)豐度降低;腐生營(yíng)養(yǎng)型和病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度降低,錐蓋傘屬、Saitozyma等有益菌相對(duì)豐度提高。表明合理施用生物炭可以改良土壤真菌群落結(jié)構(gòu),促進(jìn)植煙土壤的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。