朱健敏 陳 煒 胡躍強(qiáng) 蔣凌飛 吳 林

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西南寧市 530001; 2 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西省南昌市 330004; 3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科,廣西南寧市 530023; 4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心,廣西南寧市 530001)

血管性癡呆被認(rèn)為是僅次于阿爾茨海默病的癡呆類型,占所有癡呆的15%～30%,其以認(rèn)知障礙為特征。血管性癡呆目前還沒有具體的治療方法,該類患者的健康已經(jīng)成為一個不容忽視的社會問題[1]。隨著我國人口老齡化的日益加劇,血管性癡呆的患病率呈逐年增加趨勢,且隨著病情的進(jìn)展,血管性癡呆患者的自理能力逐漸下降,這增加了患者家庭和社會的負(fù)擔(dān)[2]。目前血管性癡呆的病理機(jī)制尚未完全清楚。慢性腦缺血導(dǎo)致的線粒體功能障礙引發(fā)大量活性氧簇在神經(jīng)細(xì)胞中聚積,最終可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[3]。此外,腦缺血會導(dǎo)致多種病理反應(yīng),包括血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡、白質(zhì)脫髓鞘和神經(jīng)炎癥[4-5]。已有研究表明,在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程中,慢性腦血流灌注不足與認(rèn)知能力下降及海馬神經(jīng)元損傷相關(guān)[6]。因此,長期慢性腦血流灌注不足或反復(fù)腦缺血再灌注被認(rèn)為是血管性癡呆發(fā)生的主要原因之一[7]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的駐留細(xì)胞群[8]。其中,星形膠質(zhì)細(xì)胞是突觸傳遞和可塑性的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞,其在維持正常大腦功能中發(fā)揮極其重要的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞可與神經(jīng)元建立雙向通信,從而對突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)做出反應(yīng),進(jìn)而釋放影響神經(jīng)元和突觸活動的膠質(zhì)遞質(zhì)。神經(jīng)元損傷為進(jìn)展性認(rèn)知能力下降的潛在原因,而星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷與較差的認(rèn)知功能亦有一定的相關(guān)性[9]。研究表明,慢性腦血流灌注不足小鼠模型中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活并釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6等炎癥因子,參與大腦的神經(jīng)免疫反應(yīng),而過度的免疫反應(yīng)又可以促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡和自噬[10]。由此推測,靶向干預(yù)受損的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用,從而減輕缺血性腦疾病的炎癥反應(yīng),促進(jìn)腦組織的修復(fù)。

血管性癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“健忘”“呆病”等范疇,病位在腦,臨床多從肝腎論治。益肺宣肺降濁方為傳統(tǒng)中藥處方,具有調(diào)養(yǎng)五臟,補(bǔ)腎填精,祛瘀、化痰的功效。本課題組前期的臨床研究表明,益肺宣肺降濁膠囊可改善血管性癡呆患者的神經(jīng)遞質(zhì)水平,提高患者的行為和認(rèn)知能力[11]。此外,有動物研究顯示,益肺宣肺降濁方可能通過上調(diào)腦組織海馬鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ、突觸蛋白的表達(dá),減輕海馬損傷和神經(jīng)元凋亡,從而改善學(xué)習(xí)和記憶功能,達(dá)到治療血管性癡呆的目的[12-13]。氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)模型是目前較為公認(rèn)的研究腦血流灌注不足的細(xì)胞模型,能較好地模擬體內(nèi)細(xì)胞缺血的環(huán)境[14]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)由多個亞基構(gòu)成,其中α7-nAChR是最重要的亞基之一,其在哺乳動物腦內(nèi)分布最為廣泛,與認(rèn)知功能及記憶功能密切相關(guān)[15-16]。本研究通過體外星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)以建立星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元OGD模型,基于膽堿能系統(tǒng)、α7-nAChR及炎癥因子等分析益肺宣肺降濁方含藥血清對該模型的干預(yù)作用,從而探討益肺宣肺降濁方抗血管性癡呆的作用機(jī)制,為該方的臨床應(yīng)用與推廣提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 約8周齡無特定病原體級雄性SD大鼠30只[體重(280±20)g]及新生24 h內(nèi)的SD大鼠12只(雄雌不限),由廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所實驗動物中心提供(動物許可證號:SYXK桂2019-0001)。將SD大鼠正常飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心無特定病原體級動物房,光照周期為12 h,明暗比為1 ∶1,飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃,相對濕度為(50±10)%,自由飲食。本實驗已通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的審查(審查號:DW20190213-007)。

1.2 藥物及試劑 益肺宣肺降濁方(中藥免煎顆粒)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供,組方包括黃芪15 g、人參15 g、麥冬15 g、桔梗10 g、苦杏仁10 g、三七15 g、蘇子15 g、石菖蒲15 g、大黃6 g。α7-nAChR抗體購自Invitrogen公司(批號:PA5-115651),微管關(guān)聯(lián)蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗體購自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(批號:sc-74421),膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)抗體、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體、GAPDH抗體、山羊抗兔IgG H&L(Cy5?)熒光二抗及山羊抗小鼠 IgG H&L(Alexa Fluor?488)熒光二抗購自成都正能生物生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號分別為R23923、381012、301341、550083、550036);活性氧簇檢測試劑盒、Triton X-100、RIPA細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號分別為S0033S、P0096-500ml、P0013B),ChAT活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號:A079-1-1); IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司(貨號分別為JL20884、JL13202、JL20896),高糖DMEM及無糖DMEM均購自Thermo Fisher Scientific公司(貨號分別為11965126、11966025),NeurobasalTM-A培養(yǎng)基、B27、1%牛血清白蛋白、GlutaMaxTM均購自Gibco公司(貨號分別為10888022、A3582801、10091-148、35050061),阿糖胞苷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號:C111218-5g),山莨菪堿購自MedChemExpress公司(貨號:HY-N0584);RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real Time PCR試劑盒購自TaKaRa公司(貨號分別為9109、RR036A、RR820A),二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號分別為P0012、C0016)。

1.3 主要儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱購自SANYO Trading CO.,LTD.(型號:MCO-15AC),熒光顯微鏡光鏡購自O(shè)LYMPUS公司(型號:BX43);超聲波細(xì)胞破碎儀購自Sonics &Materials,Inc.(型號:VCX750),Transwell-膜嵌套購自CORNING公司(型號:3412)。

1.4 實驗方法

1.4.1 益肺宣肺降濁方含藥血清的制備:根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的SD雄性大鼠分為對照組10只和益肺宣肺降濁方組20只,分別給予純凈水和益肺宣肺降濁方(經(jīng)雙蒸水溶解,給藥劑量為3.045 g/100 g)灌胃,0.87 mL/100 g,早晚各1次,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后2 h,經(jīng)腹部皮下注射10%水合氯醛(3.75 mL/kg )麻醉大鼠,在腹主動脈采血至大鼠死亡。將血標(biāo)本常溫靜置0.5 h,在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min,取上清液,置于56 ℃水浴30 min,然后用0.22 μm過濾器過濾除菌。分別將對照血清和益肺宣肺降濁方含藥血清分裝至2 mL凍存管,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)胞分離培養(yǎng):(1)神經(jīng)元。取12只新生SD大鼠,按照相關(guān)文獻(xiàn)[17]的方法分離海馬組織的神經(jīng)元。使用75%乙醇全身消毒新生SD大鼠后,斷頭處死,于冰上取全腦組織,分離頂部皮層組織后取部分海馬組織置于預(yù)冷的PBS中,加入0.125%的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min后,過細(xì)胞篩(200目),收集細(xì)胞液,在4 ℃下以1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞,用高糖完全DMEM(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素)重懸,計數(shù)后以1×107個/皿的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿,放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3 d后用5 μmol/L阿糖胞苷進(jìn)行處理,24 h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)基(96% NeurobasalTM培養(yǎng)基+2% B27+1% GlutaMaxTM+1%青鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng),10 d后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài),并通過檢測神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2的表達(dá)情況鑒定為神經(jīng)元后用于后續(xù)實驗。(2)星形膠質(zhì)細(xì)胞。參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]的方法分離海馬組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞。取上述新生SD大鼠的其余海馬組織,加入0.25%的胰酶在37 ℃下消化10 min后,在4 ℃條件下以1 000 r/min離心5 min,除去上清液,收集下層細(xì)胞,用高糖完全DMEM重懸,計數(shù)后以1×107個/皿的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿,放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1 h后取細(xì)胞懸液置于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),7 d后置于搖床(37 ℃ ,250 r/min),18 h后換成新鮮高糖完全DMEM清洗后消化傳代,取培養(yǎng)總時間足10 d的細(xì)胞,通過檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞后用于后續(xù)實驗。

1.4.3 神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及OGD損傷模型的構(gòu)建方法:將分離的神經(jīng)元以1×107個/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板,加入神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后,在Transwell小室的上室中接種0.1 mL星形膠質(zhì)細(xì)胞(接種密度為4×104個/mL) ,與下室神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)12 h。然后,參考相關(guān)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行OGD(無糖DMEM、2%氧氣)培養(yǎng),4 h后將下室更換為神經(jīng)元培養(yǎng)基,上室更換為高糖DMEM,在5% CO2、37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.4 實驗分組及處理:將細(xì)胞分為4組進(jìn)行干預(yù)。(1)對照組:將下室原代海馬神經(jīng)元和上室星形膠質(zhì)細(xì)胞分別置于神經(jīng)元培養(yǎng)基和高糖DMEM中常規(guī)(5% CO2、37 ℃)培養(yǎng)24 h。(2)OGD組:將原代海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞按照1.4.3的方法處理后,將上室的培養(yǎng)基換為含5%對照血清的高糖DMEM。(3)OGD+YFXF組:將原代海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞按照1.4.3的方法處理后,將上室的培養(yǎng)基換為含5%益肺宣肺降濁方含藥血清的高糖DMEM。(4)OGD+YFXF+山莨菪堿組:將原代海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞按照1.4.3的方法處理后,將上室的培養(yǎng)基換為含5%益肺宣肺降濁方含藥血清及含100 μg/mL山莨菪堿的高糖DMEM。各組均干預(yù)24 h。

1.4.5 神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的檢測:收集各組神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)4.0%多聚甲醛溶液固定30 min后, 使用PBS清洗3次。使用Triton X-100破膜后用PBS清洗3次。使用1%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后,將MAP2抗體(1 ∶50)或GFAP(1 ∶50)加入濕盒中4 ℃搖床過夜。使用PBS清洗3次后,加入山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor? 488)熒光二抗或山羊抗兔IgG H&L(Cy5?)熒光二抗室溫避光孵育 1 h,DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核后,使用PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察拍照。MAP2蛋白呈綠色熒光,GFAP蛋白呈紅色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

1.4.6 活性氧簇含量的檢測:收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞,按照檢測試劑盒使用說明書的步驟進(jìn)行操作,檢測各組活性氧簇的相對含量。設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.4.7 LDH水平的檢測:收集各組上室培養(yǎng)液上清液,以3 500 r/min離心10 min,保留上清液,根據(jù)LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書檢測LDH水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.4.8 ChAT活性的檢測:收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞,用超聲破碎后在4 ℃條件下以10 000 r/min離心30 min后取上清液,根據(jù)檢測試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作,檢測各組ChAT活性。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.4.9 IL-1β、TNF-α和IL-6 水平的檢測:收集各組上室培養(yǎng)液上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測各組IL-1β、TNF-α和IL-6水平。每組設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.4.10 α7-nAChR和ChAT mRNA表達(dá)量的檢測:收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取總RNA后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置20 μL反應(yīng)體系,包括SYBR Green Mix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA溶液1 μL、焦碳酸二乙酯dH2O 8 μL。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GCATCTTCTTGTGCAGTGCC-3′,下游引物序列為5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′;α7-nAChR上游引物序列為5′-TCTGCTCTGGACAGCCCTAT-3′,下游引物序列為5′-TAGCAAAGGCAGACAGCGAA-3′;ChAT上游引物序列為5′-CCTGGAAAAGGCTCCCCAAA-3′,下游引物序列為5′-CCCAAACCGCTTCACAATGG-3′。然后進(jìn)行實時熒光定量PCR(兩步法)檢測,反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min,95 ℃ 3 s、60 ℃ 3 s(40個循環(huán))。繪制溶解曲線,以2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

1.4.11 α7-nAChR和ChAT 蛋白表達(dá)量的檢測:收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞,加入5 μL的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中,在4 ℃條件下以11 000 r/min離心20 min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中,使用二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。加入15 μL的上樣緩沖液,100 ℃變性10 min。待冷卻后將蛋白加樣至上樣孔進(jìn)行SDS-PAGE,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入α7-nAChR抗體(1 ∶1 000)、ChAT抗體(1 ∶500)及內(nèi)參GAPDH抗體(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜后,置于脫色搖床上加入TBST 清洗10 min,重復(fù)3次;加入山羊抗兔IgG H&L(Cy5?)熒光二抗(1 ∶5 000)室溫下孵育1 h,使用TBST清洗3次后用ECL顯色,曝光成像,使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇含量和上清液LDH水平的比較 與對照組相比,OGD組的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇含量和上清液LDH水平增加(P<0.05);與OGD組相比,OGD+YFXF組的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇含量和上清液LDH水平降低(P<0.05);與OGD+YFXF組相比,OGD+YFXF+山莨菪堿組的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇含量和上清液LDH水平增加(P<0.05),見表1。

表1 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性氧簇含量和上清液LDH水平的比較

2.2 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)情況的比較 與對照組相比,OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的熒光強(qiáng)度減弱,神經(jīng)元胞體皺縮、突起和分叉減少,出現(xiàn)打結(jié)現(xiàn)象,且標(biāo)志物MAP2的熒光強(qiáng)度明顯減弱;與OGD組相比,OGD+YFXF組星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),神經(jīng)元的突起、分叉增加,且標(biāo)志物MAP2的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),但與對照組相比仍有一定的形態(tài)差異;與OGD+YFXF組相比,OGD+YFXF+山莨菪堿組星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的熒光強(qiáng)度減弱,神經(jīng)元細(xì)胞突起和分叉減少,且標(biāo)志物MAP2的熒光強(qiáng)度減弱,見圖1。

圖1 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)情況(免疫熒光染色,×400)

2.3 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性及上清液IL-1β、TNF-α和IL-6水平的比較 與對照組相比,OGD組上清液IL-1β、TNF-α和IL-6含量增加,星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性降低(P<0.05);與OGD組相比,OGD+YFXF組星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6水平減少,星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性增加(P<0.05);與OGD+YFXF組相比,OGD+YFXF+山莨菪組上清液TNF-α水平增加(P<0.05),上清液IL-1β和IL-6水平亦有所增加,且星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性有所降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性及上清液IL-1β、TNF-α、IL-6水平的比較

2.4 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR、ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量比較 與對照組相比,OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞的α7-nAChR、ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05);與OGD組相比,OGD+YFXF組星形膠質(zhì)細(xì)胞的α7-nAChR、ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量增加(P<0.05);與OGD+YFXF組相比,OGD+YFXF+山莨菪堿組星形膠質(zhì)細(xì)胞的α7-nAChR的mRNA和蛋白表達(dá)量降低(P<0.05),ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量有所降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3、表4、圖2。

圖2 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR、ChAT的蛋白表達(dá)情況

表3 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR、ChAT mRNA相對表達(dá)量的比較

表4 4組星形膠質(zhì)細(xì)胞α7-nAChR、ChAT蛋白相對表達(dá)量的比較

3 討 論

腦缺血再灌注損傷與血管性癡呆密切相關(guān),而認(rèn)知功能障礙為血管性癡呆的主要癥狀之一[21]。本課題組前期的臨床和動物實驗研究表明,益肺宣肺降濁方具有改善血管性癡呆患者和血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的作用[22- 23]。但是益肺宣肺降濁方的具體作用機(jī)制尚未明確。本研究建立海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元OGD損傷模型,以探討益肺宣肺降濁方治療血管性癡呆的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)OGD處理后,OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力降低(標(biāo)志物GFAP熒光強(qiáng)度減弱),神經(jīng)元形態(tài)異常(胞體皺縮、突起和分叉減少,出現(xiàn)打結(jié)現(xiàn)象)且活性降低(標(biāo)志物MAP2熒光強(qiáng)度明顯減弱);OGD組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性氧簇含量及LDH釋放水平升高(P<0.05),與吳明鋒等[24]報告的結(jié)果相似。上述結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元OGD損傷模型構(gòu)建成功。而OGD+YFXF組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力增強(qiáng),神經(jīng)元的突起和分叉增加、活力增強(qiáng),且星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性氧簇含量及LDH釋放量低于OGD組(P<0.05),說明益肺宣肺降濁方可減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元OGD損傷。

海馬中的乙酰膽堿是影響記憶的重要物質(zhì)。有研究顯示,機(jī)體在進(jìn)行空間記憶任務(wù)訓(xùn)練時,膽堿能標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的水平顯著上升[25];認(rèn)知功能、空間記憶能力等與海馬中的乙酰膽堿水平呈正相關(guān)[26-27]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在海馬中直接注入乙酰膽堿可間接激活海馬的nAChR,從而逆轉(zhuǎn)穹窿損害造成的認(rèn)知功能障礙[28]。α7-nAChR是nAChR的亞型之一,其為表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞表面的配體依賴性離子通道受體,主要發(fā)揮抗炎作用。膽堿能系統(tǒng)可通過α7-nAChR來發(fā)揮抑制免疫效應(yīng)的作用,從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)[29]。這提示膽堿能系統(tǒng)通過作用于神經(jīng)細(xì)胞上的相關(guān)受體來發(fā)揮相應(yīng)作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,星形膠質(zhì)細(xì)胞具有支持神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性的作用,并可表達(dá)α7-nAChR受體。乙酰膽堿可通過間接作用于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞從而引起齒狀回神經(jīng)元興奮降低,而α7-nAChR拮抗劑可阻斷這種作用,說明乙酰膽堿及α7-nAChR均具有抑制神經(jīng)元興奮的作用[30-31]。同時,在海馬中,由乙酰膽堿引起的齒狀回細(xì)胞興奮抑制作用可被膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑重新激活[30]。由此可見,海馬釋放的乙酰膽堿對齒狀回興奮的抑制作用是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞而不是直接作用于神經(jīng)元來實現(xiàn)的。此外,海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞在海馬功能中發(fā)揮重要作用,激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放谷氨基酸等神經(jīng)遞質(zhì),進(jìn)而抑制海馬齒狀回中間神經(jīng)元的活性[32],而抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì),會損害海馬依賴性記憶能力[33]。

基于膽堿能系統(tǒng)與α7-nAChR在抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)方面的共同作用,以及海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及其表達(dá)的α7-nAChR對神經(jīng)元的作用,本研究觀察了益肺宣肺降濁方含藥血清對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元OGD損傷模型中α7-nAChR、ChAT、炎癥因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,OGD組的星形膠質(zhì)細(xì)胞ChAT活性降低,α7-nAChR和ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量下調(diào),細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6增多(P<0.05);而與OGD組相比,OGD+YFXF組的星形膠質(zhì)細(xì)胞中ChAT活性增強(qiáng),α7-nAChR和ChAT的mRNA和蛋白表達(dá)量上調(diào),炎癥因子的釋放量減少(P<0.05)。以上結(jié)果表明益肺宣肺降濁方含藥血清可能通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中α7-nAChR和ChAT的表達(dá),抑制炎癥因子的產(chǎn)生,從而減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的損傷。此外,與OGD+YFXF組相比,OGD+YFXF+山莨菪堿組的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元受損加重,α7-nAChR mRNA和蛋白表達(dá)量降低,炎癥因子TNF-α的釋放量增加(P<0.05),ChAT的mRNA及蛋白表達(dá)也有一定程度的降低,這一結(jié)果說明膽堿受體拮抗劑山莨菪堿可拮抗益肺宣肺降濁方對ChAT、α7-nAChR、炎癥因子的調(diào)控作用,從而逆轉(zhuǎn)該方對星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元損傷的改善作用。

綜上所述,益肺宣肺降濁方可能通過上調(diào)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中α7-nAChR的表達(dá)、增加ChAT活性、抑制炎癥反應(yīng),從而減輕OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷,這或許是該方改善缺血再灌注損傷介導(dǎo)的血管性癡呆的作用機(jī)制之一。