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      胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代條件優(yōu)化

      2024-01-05 10:27:46朱文豪劉天一張曉宇王海峰
      關(guān)鍵詞:胎鼠傳代緩沖液

      朱文豪, 劉天一, 何 川, 張曉宇, 辛 強(qiáng), 王海峰

      (吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷外科,吉林 長春 130021)

      目前普遍認(rèn)為中樞神經(jīng)元在人出生后短時(shí)間便會失去再生能力,成人神經(jīng)細(xì)胞一旦受損死亡便無法更新[1]。研究[2]顯示:成年哺乳動(dòng)物的側(cè)腦室下層和海馬齒狀回區(qū)仍可以不斷產(chǎn)生新的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs),并且這種細(xì)胞可以通過遷移對損傷腦組織進(jìn)行替代和修復(fù)。因此,基于神經(jīng)干細(xì)胞移植的治療方法成為研究熱點(diǎn)[3-5]。細(xì)胞療法通過在損傷處移植NSCs,實(shí)現(xiàn)外源性神經(jīng)替代。同時(shí)移植的NSCs 能夠釋放多種營養(yǎng)因子調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境,促進(jìn)神經(jīng)再生并減少繼發(fā)性損傷,限制宿主星形膠質(zhì)細(xì)胞活化以減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成[4,6-7]。研究[8-10]顯示:NSCs 在傳代培養(yǎng)后的活性受培養(yǎng)基成分、生長因子濃度、消化時(shí)長和吹打力度等方面的影響,但傳代的細(xì)胞密度和傳代時(shí)神經(jīng)球大小對NSCs 活性影響及其作用效果尚未完全闡明。本研究在原代培養(yǎng)NSCs 的基礎(chǔ)上,探討傳代的細(xì)胞密度和神經(jīng)球大小對神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響,為優(yōu)化NSCs 的體外培養(yǎng)條件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器孕12~14 d SPF級SD 大鼠,無特定病原體動(dòng)物,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號: SCXK (京) 2021-0006。 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM/F12 培養(yǎng)基、1%青-鏈霉素混合液、谷氨酰胺和非必需氨基酸(北京索萊寶科技有限公司),B27 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑、Accutase 消化酶和鈣黃綠素Calcein-AM(美國Gibco 公司),表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) (美國Peprotech 公司),無血清細(xì)胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司),4%多聚甲醛溶液、兔抗鼠巢蛋白Nestin 抗體和A488 標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G (immunoglobulin G,IgG) 二抗(英國Abcam 公司)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)和Hoechst 33342 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。40 μm 和70 μm 無菌尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)及CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司),激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司),正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

      1.2 胎鼠NSCs 原代培養(yǎng)胎鼠NSCs 原代分離培養(yǎng)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[9,11]并進(jìn)行改良。采用DMEM/F12 培養(yǎng)基、20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF、2% B27、1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸和1%谷氨酰胺配制NSCs 增殖培養(yǎng)基。取材應(yīng)用的手術(shù)器械洗凈后高壓蒸汽滅菌,然后置于65 ℃烘箱中干燥備用。孕12~14 d SD 大鼠頸椎脫位法處死后采用75%酒精浸泡消毒20 min。將消毒后的大鼠置于相對潔凈的手術(shù)臺中剖腹,取出胚胎后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺中。去除胎膜,剪下胎鼠頭部后PBS 緩沖液洗凈置于冰上備用。以顯微彎鑷插入胎鼠眼眶處固定頭部,顯微剪沿大腦中線剪開新生的薄層顱骨,再用小彎鑷將胎鼠神經(jīng)節(jié)擠壓出,置于盛有PBS 緩沖液的培養(yǎng)皿中。將腦組織表面的雜質(zhì)洗凈,顯微鑷小心剝離腦組織表面的微血管。全部胚胎處理結(jié)束后,將收集的腦組織使用顯微剪剪碎,巴氏管吹打20~30 下,1 mL 移液槍吹打5~10下。將制得的懸液依次過40 μm 和70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)。收集細(xì)胞懸液于離心管中,1 500 r·min-1室溫離心5 min,加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),以1~1.6×105·mL-1的細(xì)胞密度接種于T25 或T75 培養(yǎng)瓶中。取培養(yǎng)48~72 h 的細(xì)胞, 收集培養(yǎng)液1 500 r·min-1室溫離心5 min, 加入2 mL 的Accutase 消化酶并轉(zhuǎn)入3.5 cm 培養(yǎng)皿中,于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中消化5~10 min。每隔2 min 取出培養(yǎng)皿于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,直至NSCs 消化完全并均勻分散,加入4 mL 培養(yǎng)基終止消化。收集懸液1 500 r·min-1室溫離心5 min。傳代的細(xì)胞加培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)并接種細(xì)胞。凍存的細(xì)胞加入1 mL 無血清細(xì)胞凍存液,重懸后于-80 ℃冰箱凍存,長期保存需轉(zhuǎn)移至液氮。

      1.3 巢蛋白免疫熒光染色鑒定NSCs多聚賴氨酸包被細(xì)胞爬片,將24 孔細(xì)胞爬片浸泡于多聚賴氨酸溶液中,5~10 min 后用PBS 緩沖液洗滌3 次,超凈臺中室溫晾干備用。取傳代后培養(yǎng)48 h 的NSCs,接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸細(xì)胞爬片的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,孵育2 h 使細(xì)胞貼壁。于培養(yǎng)板中將爬片采用4%多聚甲醛溶液固定30 min 以上,PBS 緩沖液洗滌3 次。0.5% Triton X-100 溶液室溫打孔30 min,PBS 緩沖液洗滌3 次。5%牛血清白蛋白溶液室溫下封閉1 h 后,滴加兔抗鼠巢蛋白單克隆抗體(1∶100)孵育過夜。PBS 緩沖液洗滌3 次后加入A488 標(biāo)記山羊抗兔二抗,室溫避光孵育2 h,PBS 緩沖液洗滌3 次。采用含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片,正置熒光顯微鏡下觀察NSCs 并進(jìn)行圖像采集。

      1.4 神經(jīng)球直徑測定取培養(yǎng)第3 代的NSCs,以1.0×104、2.0×104、6.0×104、1.0×105、1.6×105和2.0×105mL-1的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔2 mL 培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后形成神經(jīng)球。采用光學(xué)顯微鏡觀察神經(jīng)球形態(tài)表現(xiàn)并進(jìn)行圖像采集。每個(gè)傳代密度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)孔內(nèi)選取隨機(jī)3個(gè)視野成像。采用Image J 1.47v軟件分析神經(jīng)球直徑。

      1.5 活死細(xì)胞染色法檢測神經(jīng)球中NSCs 存活率取傳代后72 h 的神經(jīng)球,培養(yǎng)液中加入終濃度5 μmol·L-1鈣黃綠素AM、0.5 g·L-1PI 和5 mg·L-1Hoechst 33342,于室溫靜置10 min。采用倒置熒光顯微鏡觀察并調(diào)整焦距后對神經(jīng)球最大直徑視野進(jìn)行圖像采集。采用Image J 1.47v 軟件分別對神經(jīng)球的直徑、該視野下總細(xì)胞面積和死細(xì)胞面積進(jìn)行定量分析,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(總細(xì)胞面積-死細(xì)胞面積)/總細(xì)胞面積×100%。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,GraphPad Prism 8.0 軟件繪制圖像。各細(xì)胞傳代密度下神經(jīng)球直徑和細(xì)胞存活率均符合正態(tài)分布且方差齊,以±s表示,多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 神經(jīng)球中NSCs 鑒定培養(yǎng)的NSCs 呈巢蛋白陽性,且直徑約40 μm 神經(jīng)球中心部分巢蛋白的表達(dá)量最高。有少量散在的單個(gè)細(xì)胞呈巢蛋白陽性,偶爾可見呈巢蛋白陰性的細(xì)胞,考慮是由于傳代過程中發(fā)生凋亡或貼壁后細(xì)胞迅速失去干性所導(dǎo)致的。因此,培養(yǎng)的細(xì)胞呈較強(qiáng)的巢蛋白表達(dá),提示培養(yǎng)出的細(xì)胞為NSCs。見圖1。

      圖1 巢蛋白抗體免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)球中NSCsFig. 1 NSCs in neurospheres identificated by nestin antibody immunofluorescence staining method

      2.2 傳代NSCs 形態(tài)表現(xiàn)傳代48 h 后NSCs 呈聚集生長趨勢,形成神經(jīng)球。細(xì)胞球大小不均一,直徑為76.41~306.79 μm,平均直徑為(152.72±47.52)μm。NSCs 生長方式呈牢固細(xì)胞間黏附聚集模式,球與球之間少有單獨(dú)的細(xì)胞散在。大部分NSCs 聚集呈圓球形或橢圓球形,也有部分因球與球之間的粘連呈串珠狀。神經(jīng)球中細(xì)胞間連接緊密且縫隙較小,形成緊密的球形結(jié)構(gòu)。見圖2 和3。

      圖2 倒置顯微鏡觀察NSCs 傳代培養(yǎng)48 h 后神經(jīng)球形態(tài)表現(xiàn)Fig. 2 Morphology of neurospheres after 48 h of subculture of NSCs observed by inverted microscope

      圖3 共聚焦顯微鏡觀察活死細(xì)胞染色神經(jīng)球的形態(tài)表現(xiàn)(Bar=20 μm)Fig. 3 Morphology of neurospheres with live-death cell staining observed by confocal microscope(Bar=20 μm)

      2.3 不同傳代密度神經(jīng)球直徑與2.0×104mL-1傳代密度(39.01 μm±12.37 μm) 比較,6.0×104mL-1和1.0×105mL-1傳代密度的神經(jīng)球直徑(61.99 μm±22.87 μm 和79.72 μm±25.31 μm)增加(P<0.05);1.0×105mL-1、1.6×105mL-1(86.11 μm±30.00 μm)和2.0×105mL-1(79.69 μm±18.43 μm) 傳代密度的神經(jīng)球直徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

      圖4 光學(xué)顯微鏡觀察不同傳代密度神經(jīng)球直徑(Bar=200 μm)Fig. 4 Neurosphere diameters at different transmission densities observed by light microscope(Bar=200 μm)

      2.4 不同直徑神經(jīng)球中NSCs 存活率0~40 μm(91.92%±9.69%)、 40~60 μm (87.25%±8.27%)、60~80 μm (78.98%±5.79%) 和80~100 μm 神經(jīng)球(80.24%±4.93%) 中NSCs 存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與0~40 μm、60~80 μ m 和80~100 μ m 神經(jīng)球比較,100~200 μm 神經(jīng)球中 NSCs 存活率 (65.12%±5.20%)降低(P<0.05)。見圖5。

      圖5 不同直徑神經(jīng)球中NSCs 活性(活死細(xì)胞染色,Bar=100 μm)Fig. 5 Activity of NSCs in neurospheres with different diameters(Live-dead cell staining,Bar=100 μm)

      3 討 論

      原代提取的NSCs 質(zhì)量受胎鼠的成熟度、干細(xì)胞提取分離方法和傳代擴(kuò)增條件等多個(gè)方面的影響,其中首要影響因素為胎鼠發(fā)育情況[12]。研究[12-13]顯示:發(fā)育早期小鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)較發(fā)育晚期小鼠含有更多的有絲分裂干細(xì)胞,同時(shí)在孕10.5~14.5 d 的大鼠宮內(nèi)提取的胎鼠NSCs 細(xì)胞活性增加并達(dá)到高峰,并于發(fā)育后期細(xì)胞活性逐漸減弱。因此,NSCs 原代提取的時(shí)機(jī)對于保持干細(xì)胞活性尤為關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示:采用孕11~14 d的胎鼠可獲得能夠穩(wěn)定快速擴(kuò)增的NSCs,不足孕11 d 胎鼠提取NSCs過少且擴(kuò)增效率低,超過孕14 d的胎鼠由于發(fā)育成熟度較高使獲取的NSCs 聚球和增殖活性較差。此外,在NSCs 提取分離過程中有效地分離出單細(xì)胞是提升NSCs 質(zhì)量的關(guān)鍵。研究[9]顯示:采用1 mL 槍頭反復(fù)吹打可以使腦組織迅速分散,但過度吹打易使細(xì)胞增殖活性減弱。本研究結(jié)果顯示:巴氏管吹打20~30 下后1 mL 移液槍吹打5~10 下的分離條件可以在不影響細(xì)胞活性前提下高效分離NSCs。

      傳代的細(xì)胞密度較大程度上決定NSCs 的擴(kuò)增效率,關(guān)于傳代密度的條件尚未完全統(tǒng)一。有學(xué)者[10-11,13-15]采用1×105mL-1和2×105mL-1的傳代密度培養(yǎng)5~7 d 消化傳代; 研究[16-17]采用5×105mL-1的傳代密度培養(yǎng)7 d 消化傳代;也有研究[18-19]采用1×106mL-1的傳代密度以機(jī)械切割分離球的方式傳代。NSCs 屬于聚團(tuán)成簇生長類型細(xì)胞,細(xì)胞在生長過程中會不斷分泌營養(yǎng)物質(zhì)以保持自身生長的環(huán)境。因此,細(xì)胞傳代密度會較大地影響NSCs 的生長環(huán)境,過少的細(xì)胞會在培養(yǎng)過程中因自身營養(yǎng)物質(zhì)分泌不足而導(dǎo)致生長遲緩,過量的細(xì)胞則會因營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而導(dǎo)致生長受限[20]。本研究結(jié)果顯示:當(dāng)傳代密度大于1×105mL-1時(shí),NSCs 神經(jīng)球直徑不再隨傳代密度的升高而增加。傳代密度過大時(shí),由于過量細(xì)胞導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的競爭耗竭,可能出現(xiàn)神經(jīng)球形成速度減慢的現(xiàn)象。因此,以1×105mL-1的傳代密度進(jìn)行培養(yǎng)是保持NSCs 活性的最佳傳代培養(yǎng)條件。

      神經(jīng)球直徑是維持干細(xì)胞活性的重要方面。NSCs 呈聚集生長的狀態(tài),細(xì)胞聚球之后,內(nèi)部的細(xì)胞與外界養(yǎng)分及氣體交換減弱,較大地影響了神經(jīng)球內(nèi)部細(xì)胞活性。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,神經(jīng)球內(nèi)部缺乏氧氣和營養(yǎng)的細(xì)胞將大量死亡[9,11,16]。因此,傳代時(shí)神經(jīng)球的直徑直接決定了NSCs 的活性和培養(yǎng)效率。研究[16-17,21]顯示:直徑為100~150 μm、100~200 μm 或200 μm 的神經(jīng)球可進(jìn)行細(xì)胞傳代。當(dāng)神經(jīng)球直徑為150~200 μm 時(shí),神經(jīng)球球心會出現(xiàn)大量壞死細(xì)胞[11]。本研究結(jié)果顯示:神經(jīng)球直徑大于100 μm 時(shí),神經(jīng)球中心部位會出現(xiàn)細(xì)胞死亡的情況。因此,神經(jīng)球直徑為80~100 μm是傳代的最佳時(shí)機(jī),既可以最大程度延長培養(yǎng)時(shí)間又不會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。

      綜上所述,胎鼠的孕期和腦組織吹打分離細(xì)胞的方式是高活性NSCs 原代提取的重要因素。傳代的細(xì)胞密度和傳代時(shí)機(jī)直接影響體外培養(yǎng)NSCs 的細(xì)胞活性。因此,選擇以1×105mL-1的傳代密度進(jìn)行種板和傳代時(shí)神經(jīng)球直徑為80~100 μm,可以有效地提高NSCs 傳代培養(yǎng)效率和細(xì)胞活性。

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