江宜宏,鄭佳新

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病是成人腎小球腎炎的一種常見類型,根據(jù)病因分為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)和繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy,SMN),其中75%表現(xiàn)為IMN,SMN多由臨床疾病發(fā)展而來[1]。IMN具有病程反復(fù)、遷延難愈的特點(diǎn),約80%的IMN患者臨床表現(xiàn)為腎病綜合征[2],目前臨床治療上主要依賴于激素、免疫抑制劑、ACEI和ARB類等藥物[3]。然而,長期的西藥治療不僅給患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且治療后仍存在復(fù)發(fā)的可能,甚至伴隨著嚴(yán)重的副作用。

中藥青風(fēng)藤最早被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,大量研究證實(shí)青風(fēng)藤具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用,對非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用[4-5]。近年來,青風(fēng)藤及其復(fù)方不斷被應(yīng)用在治療膜性腎病等腎臟疾病上,臨床上取得了顯著療效,但其具體作用機(jī)制尚未明確。本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)對IMN相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,同時借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討青風(fēng)藤治療IMN的關(guān)鍵靶點(diǎn)及相關(guān)通路,為進(jìn)一步研究青風(fēng)藤治療IMN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)處理工具 本研究所用數(shù)據(jù)庫包括TCMSP、GEO、Uniprot、STRING、DAVID 6.8、KEGG、PDB,數(shù)據(jù)處理工具包括Venny 2.1.0 在線平臺、Cytoscape 3.9.0軟件、Origin Lab 2020軟件、Auto Dock1.5.7軟件、Pymol軟件、Open Babel軟件。

1.2 青風(fēng)藤活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn) 在 TCMSP數(shù)據(jù)庫中輸入青風(fēng)藤,設(shè)置條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug like,DL)≥0.18,篩選出符合條件的青風(fēng)藤活性成分及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn),并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報道補(bǔ)充未預(yù)測到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后,為規(guī)范青風(fēng)藤活性成分及對應(yīng)蛋白質(zhì)靶點(diǎn),借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.Unipmt.org)進(jìn)行匹配規(guī)范。

1.3 青風(fēng)藤“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選到的青風(fēng)藤成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建青風(fēng)藤“活性成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò),利用cytoNCA插件分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),包括Dgeree、Betweenness等,并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)和發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.4 IMN差異表達(dá)基因篩選 基因數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE115857芯片。該芯片數(shù)據(jù)包含7例健康活體捐贈者和11例IMN患者的腎臟組織基因表達(dá)量,以P<0.05且|log FC|≥1為條件篩選差異表達(dá)基因。

1.5 靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 利用在線平臺Venny 2.1.0將青風(fēng)藤藥物靶點(diǎn)與IMN靶點(diǎn)匹配取交集并繪制韋恩圖,采用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)對獲得的交集靶點(diǎn)之間的相互作用進(jìn)行分析,物種設(shè)置為“Home sapiens”,最小相互作用閾值設(shè)定為0.4,隱藏離散靶點(diǎn),其他參數(shù)保留默認(rèn)值,得到PPI網(wǎng)絡(luò),并通過Cytos Scape 3.9.0中的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,以degree值大小設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小及顏色,分析其主要靶點(diǎn)基因。

1.6 GO靶點(diǎn)功能注釋和KEGG通路富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對青風(fēng)藤治療IMN的靶點(diǎn)進(jìn)行基因生物學(xué)富集分析(gene ontology,GO)和基因組通路富集分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG),設(shè)置閾值P<0.05,保存數(shù)據(jù)結(jié)果并借助Origin Lab 2020對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.7 分子對接驗(yàn)證活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn) 根據(jù)上述分析結(jié)果,從TCMID數(shù)據(jù)庫下載青風(fēng)藤活性成分的SDF格式文件,經(jīng)Open Babel軟件轉(zhuǎn)化為MOL 2格式文件。使用PDB數(shù)據(jù)庫篩選獲取青風(fēng)藤核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),然后將文件導(dǎo)入Py Mol軟件中進(jìn)行去水、加氫、刪除配體等處理,設(shè)置分子對接的活性口袋,利用Auto Dock Vina 軟件將受體(靶點(diǎn))與配體(活性成分)進(jìn)行半柔性對接,預(yù)測兩者的結(jié)合性能,從而驗(yàn)證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性,并利用Py Mol軟件繪制對接結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 青風(fēng)藤活性成分和靶點(diǎn)的獲取 初步提取青風(fēng)藤化學(xué)成分16種,經(jīng)過篩選后獲得6種活性成分,見表1。根據(jù)青風(fēng)藤活性成分,經(jīng)過去重和排除非人類靶點(diǎn)蛋白后,共得到52個靶點(diǎn),并獲得其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)基因名。

表1 青風(fēng)藤主要活性成分Table 1 The main active ingredient of Caulis Sinomenii

2.2 青風(fēng)藤 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件3.9.0,構(gòu)建青風(fēng)藤“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含了59個節(jié)點(diǎn)和112條邊,其中矩形、菱形和圓形分別代表青風(fēng)藤、活性成分和對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白。根據(jù)degree值排名前4位的分別是β-谷甾醇(beta-sitosterol)、左旋千金藤啶堿(stepholidine)、拉茲馬寧堿(16-epi-Isositsirikine)和青藤堿(sinomenine),可能是青風(fēng)藤起治療作用的主要成分。

圖1 青風(fēng)藤“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 “Active ingredient-arget” network diagram of Caulis Sinomenii

2.3 IMN差異表達(dá)基因的獲取 以P<0.05且|log FC| ≥1為標(biāo)準(zhǔn)對GEC115857芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,得到差異表達(dá)基因共3 983個。

2.4 核心靶點(diǎn)及靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將青風(fēng)藤活性成分靶點(diǎn)和IMN差異表達(dá)基因取交集得到青風(fēng)藤-IMN共同靶點(diǎn)8個,見圖2。對共同靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),并運(yùn)用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,見圖3。此網(wǎng)絡(luò)中包含13個節(jié)點(diǎn)和31條邊,圖中節(jié)點(diǎn)大小代表該靶點(diǎn)作用強(qiáng)度,degree 值越高,節(jié)點(diǎn)越大,對應(yīng)顏色越深,其相關(guān)靶標(biāo)蛋白重要性排名見表2。說明青風(fēng)藤治療IMN作用機(jī)制復(fù)雜,非單一蛋白靶標(biāo)作用而成。

圖2 青風(fēng)藤活性成分-IMN靶點(diǎn)Venn圖Figure 2 Venn diagram of active ingredient of Caulis Sinomenii and IMN

圖3 青風(fēng)藤-IMN核心靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Core target interoperability network of Caulis Sinomenii and IMN

表2 青風(fēng)藤治療IMN關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 2 Caulis Sinomenii treatment of IMN key targets

2.5 靶點(diǎn)功能與通路的分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)平臺對青風(fēng)藤治療IMN相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路分析,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。由結(jié)果可見多個靶點(diǎn)參與了細(xì)胞凋亡過程,見圖4;參與的通路主要有MAPK通路、cAMP通路和癌癥相關(guān)通路等,見圖5。

注:BP.生物學(xué)過程(biological process);CC.細(xì)胞定位(cellular component);MF.分子功能(molecular function)。圖4 青風(fēng)藤治療IMN的GO分析圖Figure 4 GO analysis of the treatment of IMN by Caulis Sinomenii

2.6 分子對接結(jié)果 選擇青風(fēng)藤活性成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中degree前5的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接,結(jié)果見表3。根據(jù)對接得分判斷青風(fēng)藤活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合性能,結(jié)合能≤ -5.0 kJ/mol說明活性成分與靶點(diǎn)對接效果較好。對接結(jié)果顯示,藥效成分與核心靶點(diǎn)的最低結(jié)合能均小于0 kJ/mol,說明受體與配體間可以自發(fā)結(jié)合,其中JUN蛋白與各成分的對接結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol,CASP3蛋白、CASP8蛋白、EP300蛋白、和RIPK1蛋白與β-谷甾醇、甘露聚糖、烏心石環(huán)氧內(nèi)酯的對接結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol 。對對接結(jié)果進(jìn)行可視化,結(jié)果見圖6。

3 討論

IMN 是Th2 介導(dǎo)的體液免疫所致,導(dǎo)致以IgG4 為主的原位免疫復(fù)合物在GBM上皮細(xì)胞側(cè)形成,并激活補(bǔ)體,導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合物(C5b-9)刺激足細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)引起蛋白尿和GBM損傷[6],不少學(xué)者認(rèn)為IMN應(yīng)屬一種自身免疫性疾病。青風(fēng)藤味苦、辛,性味平,歸肝、脾經(jīng),具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、利小便的功效,常作為主要藥物出現(xiàn)在IMN的中藥治療中,在改善腎功能、減輕蛋白尿方面療效肯定[7]。

本研究篩選出青風(fēng)藤的有效成分6個,其主要活性成分包括β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿、青藤堿和拉茲馬寧堿。β-谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分,通過上調(diào)γ-干擾素和下調(diào)白介素-6、腫瘤壞死因子-α發(fā)揮抗炎作用[8]。青藤堿可通過調(diào)控足細(xì)胞自噬相關(guān)的信號通路,引起應(yīng)激性的細(xì)胞自噬,對腎臟發(fā)揮保護(hù)作用[9]。左旋千金藤啶堿主要作用于多巴胺受體[10]。拉茲馬寧堿相關(guān)研究文獻(xiàn)較少,主要涉及腫瘤抑制方面的作用。青風(fēng)藤的主要成分對于機(jī)體炎癥及細(xì)胞凋亡均有相應(yīng)作用。

進(jìn)一步對青風(fēng)藤與IMN的共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析研究,結(jié)果顯示青風(fēng)藤對IMN起治療作用的主要靶點(diǎn)為JUN、CASP3、CASP8、EP300。JUN是一種轉(zhuǎn)錄因子,主要調(diào)控炎癥因子和金屬蛋白酶(MMPs)[11],參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡,影響機(jī)體的免疫和炎性反應(yīng)[12]。CASP3是青風(fēng)藤治療IMN的一個重要靶點(diǎn),CASP3被認(rèn)為是即將死亡或因細(xì)胞凋亡而死亡的細(xì)胞的可靠標(biāo)記,通過對細(xì)胞凋亡過程中的大部分蛋白水解參與細(xì)胞凋亡途徑[13]。此外對CASP3缺陷小鼠的研究發(fā)現(xiàn),小鼠腎臟顯示增殖性腎小球病變,系膜區(qū)域出現(xiàn) IgA 和補(bǔ)體3的免疫復(fù)合物沉積,足細(xì)胞損傷和腎小管間質(zhì)中存在炎性細(xì)胞浸潤,提示CASP3可能在膜性腎病的發(fā)病機(jī)制中具有雙重調(diào)節(jié)作用[14]。CASP8是細(xì)胞凋亡的分子開關(guān),可抑制 RIPK3和 MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡,藥物可通過抑制CASP8的活性降低RIPK3和MLKL水平阻斷壞死性凋亡[15]。EP300作為相互作用分化抑制因子主要在癌癥中表達(dá),EP300突變上調(diào)了參與免疫系統(tǒng)的信號通路,其可能通過增強(qiáng)自身抗免疫能力起到治療IMN的作用[16]。這表明青風(fēng)藤介導(dǎo)的主要靶點(diǎn)可通過調(diào)控人體免疫系統(tǒng),減少腎小球基底膜免疫復(fù)合物沉積,抑制炎癥因子釋放等起到治療IMN的作用。分子對接驗(yàn)證結(jié)果亦表明β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿、青藤堿及拉茲馬寧堿與主要靶點(diǎn)(JUN、CASP3、CASP8、EP300)的結(jié)合活性較強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能分析主要集中在凋亡信號、對脂多糖的反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的細(xì)胞成分分解等生物學(xué)過程。KEGG富集分析結(jié)果顯示青風(fēng)藤治療IMN的通路主要有MAPK信號通路以及cAMP信號通路。MAPK信號通路包括三個亞組:ERK、p38、JNK。ERK激活可促進(jìn)表皮生長因子受體(EGFR)的上調(diào)表達(dá),促進(jìn)對細(xì)胞免疫至關(guān)重要的自分泌生長環(huán),對ERK-MAPK信號的抑制劑研發(fā)是目前治療自身免疫性疾病的新方向[17]。p38是MAKP信號通路的主要分支之一,p38通路通過產(chǎn)生大量不同的生物效應(yīng)對細(xì)胞外部信號做出適當(dāng)反應(yīng)[18]。JNK直接參與細(xì)胞凋亡的線粒體途徑,通過氧化應(yīng)激激活JNK致使半胱天冬酶活化和凋亡,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。cAMP通路是G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 觸發(fā)的信號級聯(lián)反應(yīng),它們會介導(dǎo)心臟和骨骼肌的上皮細(xì)胞功能和生理機(jī)能[20]。IMN 是一種免疫復(fù)合物相關(guān)的腎小球疾病,其與自身免疫系統(tǒng)問題密切相關(guān);cAMP 通路可作為自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)[21],故青風(fēng)藤或許可成為單味中藥免疫抑制劑的一種選擇。

綜上,青風(fēng)藤中的β-谷甾醇、左旋千金藤啶堿和青藤堿等主要活性成分可能通過抑制MAPK、cAMP等信號通路作用于JUN、CASP3、CASP8等疾病靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎癥因子、調(diào)控細(xì)胞凋亡等生物功能,抑制足細(xì)胞損傷,從而起到保護(hù)腎臟,治療IMN的效用。研究結(jié)果表明青風(fēng)藤具有多通路,多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn),為臨床運(yùn)用青風(fēng)藤治療IMN提供了科學(xué)依據(jù),也為進(jìn)一步發(fā)掘青風(fēng)藤潛在作用機(jī)制提供了新的方向。