李 彬，汪 越，侯鳳偉，杜家如，童旭輝

蚌埠醫(yī)學院藥學院/安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽 蚌埠233030

睪丸癌是青年人群中最常見的惡性腫瘤［1］。西方國家發(fā)病率在過去20年中上升,手術和以順鉑為基礎的化學療法的結合使得睪丸癌患者的治愈率大于90%［2］。盡管如此，10%～20%患有轉移性疾病的睪丸癌患者不能通過基于順鉑的化療治愈［3］。因此，探索治療睪丸腫瘤的新方法具有研究價值。

鐵死亡是一種鐵依賴形式的非凋亡細胞死亡，其特征是脂質ROS的積累［4］。在細胞和小鼠中進行的遺傳學研究確定硒酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）是這種形式的細胞死亡的關鍵調節(jié)因子。GPX4將脂質氫過氧化物轉化為脂質醇，這一過程阻止了鐵（Fe2+）依賴的有毒脂質活性氧（ROS）的形成。GPX4功能的抑制導致脂質過氧化，并可誘導鐵死亡［5,6］。近年來，人們在設計和開發(fā)基于鐵死亡誘導的抗癌藥物方面做了大量工作，在癌癥治療中引入鐵死亡具有很好的治療潛力［7］。RSL3是一種常用的鐵死亡誘導劑，通過抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）造成細胞脂質過氧化物堆積導致鐵死亡［8］。在晚期前列腺癌、肝癌以及膠質母細胞瘤中，RSL3可以通過誘導鐵死亡的發(fā)生發(fā)揮較好的腫瘤細胞殺傷作用［9-11］。然而，RSL3能否在睪丸癌細胞I-10中觸發(fā)鐵死亡尚未見報道。

大多數睪丸腫瘤的特征是PTEN的缺失，PTEN是一種負性調節(jié)PI3K信號的腫瘤抑制因子，因此睪丸腫瘤中PI3K/AKT/mTOR通路活性異常增強，睪丸腫瘤模型也顯示異常增強的PI3K/AKT/mTOR通路［3］。PTEN功能缺失在人類腫瘤中較為多見，腫瘤細胞表現為對鐵死亡的抵抗性，抑制PI3K/AKT/mTOR信號軸能使癌細胞對鐵死亡誘導敏感［12］。有研究發(fā)現mTOR有助于保護心肌細胞免受鐵死亡和過量鐵的影響［13］，雷帕霉素衍生物依維莫司聯(lián)合RSL3/Erastin在腎細胞癌中表現出協(xié)同作用，促進鐵死亡［14］。以上研究提示，靶向mTOR結合誘發(fā)鐵死亡對于睪丸癌的治療具有一定的臨床意義。雷帕霉素是雷帕霉素復合物1（mTORC1）機制靶點的抑制劑，其通過結合FKBP12發(fā)揮抑制mTORC1的作用［15,16］。因此，雷帕霉素可能通過抑制mTOR促進RSL3誘導的鐵死亡，提高睪丸癌細胞對RSL3的敏感性。為此，本文旨在研究雷帕霉素是否提高RSL3對睪丸癌I-10細胞的抑制作用，并探討雷帕霉素對RSL3抗睪丸癌I-10細胞活性的影響及其作用機制，為睪丸癌的治療方法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Biosharp）；胎牛血清（杭州四季青）；雷帕霉素（RAPA）（MCE）；RSL3（Type II）（MCE）；谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；GPX4 抗體（Proteintech）；C11 BODIPY 581/591 熒光探針（賽默飛）；GAPDH（Proteintech）；胰酶（Biosharp）、細胞裂解液（上海碧云天）；其他常用試劑均為國產分析級。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

小鼠間質瘤細胞株I-10來源于ATCC（Manassas,VA,USA），細胞在含5%CO2的37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI 1640，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素。

1.3 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期細胞I-10，以5×104/mL 密度接種于96孔板，待細胞生長至約60%后，更換含藥培養(yǎng)液。實驗分為單用RSL3組和與雷帕霉素合用組，RSL3濃度分別為0、1、2、4、8、16 μmol/L，雷帕霉素濃度為16 μmol/L。培養(yǎng)24 h 后，添加5 mg/mL MTT 溶液（10μL/孔），在37 ℃的黑暗條件下孵育4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO置于37 ℃烘箱中孵育30 min，酶標儀檢測A490值。樣品檢測全程避光操作。根據公式計算細胞存活率。

1.4 集落克隆形成實驗

將細胞以500個/孔接種于六孔板，待細胞緊貼壁以后，用含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；顯微鏡下觀察集落數大于50，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，再用0.1%結晶紫室溫染色30 min，并拍照。

1.5 劃痕實驗

將細胞以2×105/孔鋪種于6孔板，待細胞生長至約80%時，用200 μL槍頭沿每孔中央劃一條直線，用PBS清洗去除漂浮細胞，每孔加入2 mL含藥無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；分別在培養(yǎng)0 h、24 h用顯微鏡拍照。計算劃痕愈合率。

1.6 Transwell侵襲實驗

在Transwell上室內加入50μL基質膠，置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min，待膠凝固。收集I-10細胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基調整為含藥的細胞懸液（2×105/mL），藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；分別取100μL加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500μL。每組設置3 個復孔，實驗重復3 次；培養(yǎng)48 h 后取出Transwell小室，用PBS清洗兩次，然后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，結晶紫室溫染色30 min。采用光學倒置顯微鏡（×100）下計數侵襲至微孔膜下層的細胞，每個樣本觀察3個視野。

1.7 Transwell遷移實驗

無需在Transwell 上室內鋪基質膠，其余步驟同1.6。

1.8 Lipid ROS檢測

將細胞以2×105/mL的密度接種于六孔板，待細胞長至60%左右，藥物處理24 h。藥物分組為：Control組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組。24 h后棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，每組加入1 mL含有5 μmol/L的C11 BODIPY 581/591熒光探針的RPMI 1640培養(yǎng)基避光染色。在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后，用無EDTA的胰酶消化細胞并收集至10 mL離心管中，1200 r/min離心8 min，再用PBS離心清洗2次。在細胞沉淀中加入300 μL PBS讓細胞重懸，轉移至流式管中在激發(fā)光為488 nm檢測氧化態(tài)細胞數量，收集數據并保存文件，使用Flowjo進行數據分析。

1.9 GSH和MDA含量檢測

使用谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒,按照使用說明檢測各組細胞中GSH和MDA含量。

1.10 Western blot檢測

收集各組細胞，加適量增強型RIPA，冰上裂解30 min后，于4 ℃以12 000 r/min離心30 min，收集蛋白并定量。配制12%SDS-PAGE凝膠。將定量樣品上樣，電泳，轉膜，封閉，孵育一抗，一抗于4 ℃孵育過夜，第2天取出以TPBS清洗3次，10 min/次。二抗于室溫孵育2 h，TPBS清洗3次，10 min/次。ECT發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光，顯影；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，ImageJ掃描灰度值定量分析。

1.11 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，計量資料表示為均數±標準差，兩組之間均數比較采用兩樣本t檢驗，兩組以上均數比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計圖采用Graphpad Prism 8.0 繪制，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷帕霉素增強RSL3對I-10細胞增殖的抑制作用

觀察RSL3對睪丸癌I-10細胞的抑制作用，結果顯示隨著RSL3給藥濃度的提高，細胞存活率逐漸下降（圖1A）。在合用雷帕霉素（16 μmol/L）之后，細胞存活率進一步下降（P＜0.01，圖1A）。為減少細胞活力對侵襲、遷移的影響，實驗中選用低濃度RSL3（2 μmol/L），后續(xù)實驗包括集落以及鐵死亡相關指標檢測也選用同樣濃度的RSL3。通過集落克隆實驗發(fā)現，單用RSL3組集落形成數明顯低于Control組（P＜0.05，圖1B）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組集落形成數進一步下降（P＜0.05，圖1B）。

圖1 雷帕霉素增強RSL3對I-10細胞增殖的抑制作用Fig.1 Rapamycin enhances the inhibitory effect of RSL3 on I-10 cell proliferation.A:Cell viability assessed by MTT assay.B:Colony formation assay of I-10 cells at 10 days of culture(n=3,＊＊P＜0.01 vs 2 μmol/L RSL3,####P＜0.0001 vs RSL3,&&&&P＜0.0001 vs RSL3).*P＜0.05,#P＜0.05.

2.2 雷帕霉素增強RSL3對I-10細胞侵襲和遷移的抑制作用

I-10細胞在雷帕霉素（16 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或雷帕霉素合用RSL3處理后，劃痕實驗和Transwell遷移實驗發(fā)現，與Control 組相比，RSL3 組劃痕愈合率顯著減?。≒＜0.01，圖2A）、穿膜細胞數顯著減少（P＜0.05，圖2B）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組劃痕愈合率進一步減小（P＜0.001，圖2A）、穿膜細胞數進一步減少（P＜0.01，圖2B）。Transwell侵襲實驗發(fā)現，與Control 組相比，RSL3 組穿膜細胞數減少（P＜0.01，圖2C）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組穿膜細胞數進一步減少（P＜0.01，圖2C）。

圖2 雷帕霉素增強RSL3對I-10細胞侵襲和遷移的抑制作用Fig.2 Rapamycin enhances the inhibitory effect of RSL3 on I-10 cell invasion and migration.A:Wounding-healing assay.B:Transwell assay for assessing migration of I-10 cells.C:Transwell assay for assessing invasion of I-10 cells(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01,##P＜0.01,###P＜0.001).

2.3 雷帕霉素促進RSL3誘導的I-10細胞鐵死亡

I-10細胞經RSL3（2 μmol/L）、雷帕霉素（16 μmol/L）合用RSL3處理24 h后，使用GSH和MDA試劑盒檢測發(fā)現，與Control組相比，單用RSL3組GSH含量下降（P＜0.01，圖3A），MDA含量明顯升高（P＜0.05，圖3A）；而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組GSH的水平進一步下降（P＜0.01，圖3A），MDA含量升高（P＜0.01，圖3A）；Western blot檢測結果顯示，與Control組相比，單用RSL3組GPX4的表達水平下降（P＜0.01，圖3B），而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組GPX4的表達水平進一步下降（P＜0.05，圖3B）；C11BODIPY581/591熒光探針處理細胞后，使用流式細胞術檢測發(fā)現,相比于Control組，單用RSL3組細胞中l(wèi)ipid ROS的表達水平增加（P＜0.0001，圖3C），而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組細胞中l(wèi)ipid ROS水平進一步增加（P＜0.05，圖3C）。

圖3 雷帕霉素促進RSL3誘導的I-10細胞鐵死亡Fig.3 Rapamycin promotes RSL3-induced ferroptosis in I-10 cells.A:GSH and MDA level.B:Western blotting for detecting the expression of GPX4.C:Cellular lipid ROS level analyzed with flow cytometry(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01,****P＜0.0001,#P＜0.05,##P＜0.01).

3 討論

睪丸腫瘤是青壯年男性中最常見的腫瘤，生殖細胞腫瘤(TGCTs)占所有睪丸癌的大部分［17］。睪丸癌的基礎化療藥物以順鉑為主，然而順鉑的副作用較大、耐藥性的產生均限制了疾病的治療［18］。因此，課題組近年來主要在睪丸癌中，通過誘導細胞的多種死亡形式，以達到更滿意的抗腫瘤治療效果［19,20］。鐵死亡是一種由脂質過氧化引起的鐵依賴性、非凋亡形式的調節(jié)性細胞死亡［21］。生理狀態(tài)下，細胞內鐵離子水平處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，然而，癌細胞為了繼續(xù)生存，積累了大量的鐵離子。過量鐵離子沉積可以導致膜脂質過氧化反應，以及過度氧化應激，產生大量的脂質ROS［22］。研究表明促進細胞鐵死亡可以抑制腫瘤的生長，并提高腫瘤對化學治療和放射治療的敏感性［23］。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）通過將脂質氫過氧化物轉化為無毒的脂質醇來防止鐵死亡［24］。GSH作為GPX4的主要輔因子，通過GSH與GS-SG之間的轉化，發(fā)揮電子供體或受體的作用，在抗氧化應激中發(fā)揮重要作用。丙二醛是脂質過氧化產物，其含量在鐵死亡過程中逐漸增加［25］。

RSL3是公認的細胞鐵死亡的誘導劑，主要通過抑制GPX4的活性來促進細胞的鐵死亡［26］。有文獻報道，RSL3可通過失活GPX4誘導3種不同的結直腸癌細胞系鐵死亡［27,28］，也可以在過表達GPX4的非小細胞肺癌中，誘導其發(fā)生鐵死亡，增加腫瘤對化療藥物的敏感性［29］。然而RSL3能否誘導睪丸癌細胞鐵死亡尚未報道。為此，我們將RSL3作用于睪丸癌I-10細胞。本研究通過MTT結果可以看出，RSL3呈濃度依賴性降低睪丸癌細胞I-10的細胞活力。與對照組相比，RSL3能夠明顯降低I-10細胞的增殖、侵襲與遷移能力，且鐵死亡相關指標GSH 水平、GPX4蛋白水平明顯降低，Lipid ROS、MDA水平明顯升高。這表明，RSL3可以誘導睪丸癌細胞I-10發(fā)生鐵死亡。

雷帕霉素靶蛋白（TOR）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，mTOR可以調節(jié)細胞存活、增殖和代謝，mTOR的失調與多種腫瘤相關，如前列腺癌、乳腺癌等［30］。mTOR包括兩種蛋白復合物，對雷帕霉素敏感的mTORC1 和不受該藥物直接抑制的mTORC2［31］。mTORC1可以通過調節(jié)GPX4的表達、自噬發(fā)生以及脂質代謝等多種途徑影響細胞對于鐵死亡的敏感性［32］。且有研究表明，mTOR參與了細胞的鐵死亡水平的調控。如阿司匹林通過抑制PIK3CA突變的結直腸癌中mTOR/SREBP-1/SCD1介導的脂肪生成來促進RSL3誘導的鐵死亡［33］，GYY4137（一種體內外穩(wěn)定的新型H2S供體）通過抑制mTOR通路促進自噬激活來阻斷CLP誘導的肺鐵死亡［34］。

雷帕霉素是一種特異性較高的mTORC1抑制劑，通常用作免疫抑制劑，目前已被批準用于治療人類惡性腫瘤［35］。雷帕霉素是否能在睪丸癌中促進細胞鐵死亡，并增強鐵死亡誘導劑RSL3的抗腫瘤作用呢？為此，我們將雷帕霉素與鐵死亡誘導劑RSL3聯(lián)合應用于睪丸癌細胞I-10。本研究結果發(fā)現，雷帕霉素合用RSL3組相對于單用RSL3組，I-10細胞的增殖、侵襲和遷移能力有顯著下降。本研究也檢測了鐵死亡其他相關指標，結果顯示，相對于單用RSL3組，雷帕霉素合用RSL3組，I-10細胞內GPX4蛋白表達明顯降低，Lipid ROS水平升高、GSH含量降低、丙二醛含量升高。這些現象表明，雷帕霉素可以促進RSL3誘導的睪丸癌I-10細胞鐵死亡。

然而該研究仍有一定的局限性。第一，沒有針對于雷帕霉素增強RSL3抗腫瘤作用的機制進一步研究。第二，沒有開展相應的動物實驗驗證。

綜上所述，在睪丸癌細胞中，雷帕霉素能夠增強RSL3的抗腫瘤作用，該作用與增強了RSL3誘導的細胞鐵死亡有關。后續(xù)我們將深入研究雷帕霉素在增強RSL3誘導細胞鐵死亡水平過程中的具體機制，為睪丸癌的臨床治療提供更多的理論依據。