劉濤，沈濤，李艷萍，羅洪文，張偉

1.云南大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，云南昆明 650021；2.紅河州滇南中心醫(yī)院/個(gè)舊市人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，云南紅河 661000；3.西雙版納州人民醫(yī)院門診部，云南西雙版納 666100

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是臨床常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是目前尚未攻克的醫(yī)學(xué)難題。AD 是老年期癡呆最主要的類型，我國60 歲及以上老年人中約有1500 萬癡呆患者，其中近1000 萬是AD 患者。我國AD 患者呈現(xiàn)年輕化的增長趨勢。AD 患者女性多于男性，60 歲以上婦女患AD 通常是相匹配男性的2～3 倍[1]。AD 的大腦病理特征包括含有細(xì)胞外淀粉樣蛋白-β（amyloid β，Aβ）的老年斑或神經(jīng)炎斑塊和由高磷酸化Tau 蛋白（pTau）組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2-3]。Aβ 是早期發(fā)現(xiàn)AD 的有吸引力的腦生物學(xué)標(biāo)志物，因?yàn)樗赡茉贏D 臨床表現(xiàn)之前積累長達(dá)20 年[4]。

百草枯是許多除草劑中的活性成分，是全球應(yīng)用最廣泛的除草劑之一。百草枯作為除草劑在130多個(gè)國家廣泛使用。大量百草枯死亡涉及致命攝入導(dǎo)致的自殺，也有與職業(yè)有關(guān)的疾病和死亡，發(fā)病率因國家和相關(guān)人口統(tǒng)計(jì)而異[5-6]。百草枯引起的呼吸問題（慢性咳嗽或呼吸困難、呼吸困難和喘息）與其劑量依賴性和在農(nóng)業(yè)中使用百草枯增加的接觸時(shí)間有關(guān)。百草枯的致命性導(dǎo)致全球30 多個(gè)國家制定了嚴(yán)格的法規(guī)。例如，百草枯自2007 年起在歐盟被禁止使用，目前在美國被限制使用。然而，百草枯在一些發(fā)展中國家的使用正在增加。雖然從2016年7 月1 日起中國已經(jīng)禁止百草枯水劑的銷售和使用，自2020 年9 月26 日起禁止百草枯可溶膠劑在中國境內(nèi)銷售、使用，但是對使用過百草枯的人來說，它所帶來的影響卻是長遠(yuǎn)的。因?yàn)榘俨菘葸M(jìn)入體內(nèi)后不會被人體代謝，所以會持續(xù)存在于體內(nèi)，這導(dǎo)致了長期的毒性。除草劑和殺蟲劑不當(dāng)使用導(dǎo)致的神經(jīng)病變的報(bào)道已經(jīng)很多，但是關(guān)于百草枯的研究仍然不多。Chen 等[7]研究表明，百草枯暴露引起小鼠的聯(lián)想學(xué)習(xí)和記憶受損與Aβ 水平升高直接相關(guān)。但目前對于Aβ 在體內(nèi)升高的機(jī)制尚不明確，同時(shí)百草枯通過何種途徑進(jìn)入腦內(nèi)導(dǎo)致Aβ 的水平異常同樣未知。

血-腦脊液屏障作為循環(huán)系統(tǒng)物質(zhì)入腦的最后一道屏障，其完整性是關(guān)系神經(jīng)病變是否發(fā)生的關(guān)鍵。為探究百草枯是否會導(dǎo)致阿爾茨海默病，同時(shí)探究百草枯是否是通過破壞血-腦脊液屏障完整性導(dǎo)致這一結(jié)局的，本研究構(gòu)建了百草枯中毒的動物模型，同時(shí)分析了作為細(xì)胞生命活動的關(guān)鍵信號通路的Wnt 信號通路在百草枯破壞血-腦脊液屏障完整性的機(jī)制[8-10]。

1 材料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建

選取9 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為（250±10）g。3 只大鼠隨機(jī)設(shè)為對照組。另外六只大鼠設(shè)為百草枯組，一次性灌胃百草枯溶液20mg/kg，連續(xù)觀察大鼠一般情況，造模后7d 檢測實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。本研究涉及的動物實(shí)驗(yàn)由昆明醫(yī)科大學(xué)支持，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（滇）K2020-0004。

1.2 免疫印跡（Western blot）法

取對數(shù)生長期細(xì)胞，在6 孔板中加入細(xì)胞懸液，每孔約有細(xì)胞數(shù)的組織中加入含有蛋白酶抑制劑和PSMF 的RIPA 裂解液，置于均質(zhì)器中。組織在低溫下完全裂解。裂解后10000～14000×g離心3～5min，取上清放入新的EP 管中。根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，定量后進(jìn)行免疫印跡檢測。SDS-PAGE 分離的蛋白樣品經(jīng)過電泳轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝化纖維素膜）上。封膜后，用BSA 稀釋的一抗在4℃下孵育過夜，在TBST 室溫脫色搖床上洗滌2 次，每次10min。加入二抗稀釋劑，室溫孵育1～2h。用TBST 在室溫下脫色搖床上洗滌兩次，每次10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl。分別設(shè)空白對照孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5 倍）。將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。450nm 波長依序測量各孔的吸光度（A值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

免疫印跡條帶用Image J 計(jì)算各孔條帶灰度值，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較使用t檢驗(yàn)，三組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡法檢測百草枯中毒會導(dǎo)致大鼠腦組織Aβ表達(dá)水平上調(diào)

Wnt 信號通路是維持血-腦脊液屏障完整性的關(guān)鍵分子機(jī)制。結(jié)果表明，百草枯處理之后神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白Aβ42 的表達(dá)水平顯著升高（圖1，P<0.001）。

圖1 免疫印跡法檢測腦組織中Aβ42 的表達(dá)水平

2.2 免疫印跡法檢測百草枯中毒會導(dǎo)致大鼠腦組織GSK-3β 表達(dá)水平上調(diào)

Wnt 信號通路是維持血-腦脊液屏障完整性的關(guān)鍵分子機(jī)制。SD 大鼠給予百草枯后，去除血-腦脊液屏障進(jìn)行免疫印跡法檢測。結(jié)果表明，百草枯處理后糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）表達(dá)水平升高（圖2）。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible isoform of nitric oxide，iNOS）的表達(dá)水平升高（圖3C）。

圖2 Western blot 法檢測腦組織中GSK-3β的表達(dá)水平

圖3 GSK-3β抑制劑拯救百草枯導(dǎo)致的血-腦脊液屏障損傷

2.3 GSK-3β作為百草枯破壞血-腦脊液屏障的主要因素

伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示，GSK-3β 抑制劑能一定程度地緩解百草枯導(dǎo)致的血-腦脊液屏障損傷，伊文思藍(lán)染色液入腦的量減少（圖3A）。同時(shí)GSK-3β 抑制劑處理后百草枯導(dǎo)致的Aβ 升高得到緩解（圖3B），降低了炎癥因子IL-1β、TNF-α 及iNOS 的表達(dá)水平。

3 討論

百草枯作為廣譜除草劑，其除草效果的良好作用使其大量推廣使用。但是其對環(huán)境及人體也造成了難以恢復(fù)的損傷。由于其強(qiáng)大且急性的毒性，目前關(guān)于百草枯中毒主要集中在肺、肝臟等臟器的損傷研究，這也是急性百草枯中毒的重要靶點(diǎn)，但是其在環(huán)境以及人體中存量仍然是導(dǎo)致疾病的重要因素，特別是長期的百草枯暴露導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病是不可忽視的[11-14]。Aβ42 可以在大腦中發(fā)生異常聚集和淀粉樣蛋白生成，形成纖維狀斑塊，這是阿爾茨海默病的標(biāo)志[15-16]。GSK-3β 作為細(xì)胞生長中的關(guān)鍵蛋白，參與細(xì)胞的多種生命過程，Yamaguchi 等[17]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制GSK-3β表達(dá)能促進(jìn)病理狀態(tài)下的血-腦脊液屏障的完整性。百草枯中毒的SD 大鼠的血-腦脊液屏障被破壞，伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示大量穿過血-腦脊液屏障進(jìn)入大腦，這表明百草枯能改變血-腦脊液屏障結(jié)構(gòu)，使血-腦脊液屏障的保護(hù)作用減弱，這將極大地促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生。

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，百草枯入腦后腦組織中Aβ42 的表達(dá)水平上調(diào)，這是阿爾茨海默病發(fā)生的關(guān)鍵蛋白。ELISA 結(jié)果顯示，百草枯中毒SD 大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、iNOS 和TNF-α 的表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)百草枯可以上調(diào)血-腦脊液屏障中GSK-3β 的表達(dá)水平。使用GSK-3β 抑制劑處理百草枯中毒SD 大鼠，伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示，GSK-3β抑制劑能顯著增加血-腦脊液屏障的完整性，降低腦組織中Aβ42 的表達(dá)水平以及炎癥因子的表達(dá)水平。本研究表明，百草枯可以通過上調(diào)GSK-3β 的表達(dá)導(dǎo)致血管破壞，最終破壞血-腦脊液屏障完整性，進(jìn)一步導(dǎo)致百草枯入腦上調(diào)Aβ 的表達(dá)水平，使百草枯中毒動物產(chǎn)生阿爾茨海默病樣病變。

阿爾茨海默病作為神經(jīng)細(xì)胞性疾病，目前已知的發(fā)病假設(shè)包括教育水平、遺傳、頭部外傷及其他軀體性疾病等，外界毒素或其他物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)組織中最重要的屏障即血-腦脊液屏障的完整性破壞可能是誘發(fā)神經(jīng)病變的重要原因，本研究也證實(shí)這一觀點(diǎn)[18-21]。本研究的結(jié)論為阿爾茨海默病新的致病因素判定提供參考。