牛乃琪,趙潤(rùn)澤,宗文成,劉先策,劉 海,石國(guó)華,井西濤*,張龍超*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.北京黑六牧業(yè)科技有限公司,北京 102211)

脊椎動(dòng)物的脊椎經(jīng)歷復(fù)雜而有序的發(fā)育過(guò)程,通過(guò)體節(jié)發(fā)育形成。而軸向骨骼是脊椎動(dòng)物體內(nèi)體節(jié)發(fā)育的典型。主要分為頸部、軀干和尾部,軀干主要由脊椎和肋骨組成[1-3]。這些都源自一個(gè)重復(fù)的組織結(jié)構(gòu)——體節(jié)。體節(jié)是受分割時(shí)鐘控制(分割時(shí)鐘會(huì)產(chǎn)生一系列周期性的信號(hào),這些信號(hào)會(huì)逐漸擴(kuò)散和傳播到胚胎中不同部位的細(xì)胞。這些信號(hào)會(huì)調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞分化),在脊索兩側(cè)按順序成對(duì)形成的中胚層組織塊狀結(jié)構(gòu),是脊椎軸向骨骼形成必不可少的瞬時(shí)元件[4-5]。體節(jié)在機(jī)體發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用,受到多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子(Notch、FGF、Wnt、RA、BMP、Hox、brachyury (T) 和Tbx6)相互作用的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[6-10],信號(hào)分子必須在正確的位置和正確的時(shí)間以恰當(dāng)?shù)姆绞椒植荚谂咛ブ?調(diào)控不同的細(xì)胞命運(yùn)和協(xié)調(diào)模式。體節(jié)的形成是動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)組成部分,它是脊椎動(dòng)物軸向骨骼正確形成的基礎(chǔ)元件,軸向骨骼是脊椎動(dòng)物脊柱的基礎(chǔ)。最終形成具有復(fù)雜特征的枕骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎[11-12]。每個(gè)域中的椎骨數(shù)量在物種內(nèi)是固定的,在物種之間各不相同,從而產(chǎn)生了物種特定的軸向公式[13]。而豬是為數(shù)不多的胸腰椎數(shù)可變的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一[14]。研究表明豬胸腰椎數(shù)每增加一節(jié),會(huì)使其胴體長(zhǎng)增加80 mm[15],胴體重[16]也會(huì)隨之增加。

由于豬的肋骨數(shù)有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,因此,對(duì)于肋骨數(shù)的研究也持續(xù)了很多年,篩選到了一些候選基因,如:VRTN、NR6A1、PROX2、LTBP2、Hoxc8、PLAG1、LCORL基因等。而前期本團(tuán)隊(duì)基于北京黑豬群體,通過(guò)GWAS在豬6號(hào)染色體(SSC6)上篩選到了與肋骨數(shù)相關(guān)的兩個(gè)基因GREB1L和MIB1[17]。而北京黑豬(Beijing black pig)是中國(guó)典型的復(fù)合型黑豬品種,是1960年代由巴克夏、大白和中國(guó)地方豬種雜交形成的一個(gè)培育豬種[18],它完美地結(jié)合了中國(guó)地方豬品種肉質(zhì)優(yōu)良、抗病能力強(qiáng)、繁殖性能好等特點(diǎn)和商品豬品種生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高、飼料轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。在北方豬肉市場(chǎng)中占有重要地位,但是北京黑豬在GREB1L和MIB1基因的多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)GREB1L和MIB1基因所有外顯子區(qū)進(jìn)行PCR及測(cè)序檢測(cè)突變位點(diǎn)并將其與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以期探索影響性狀變異的候選基因功能位點(diǎn),為性狀變異遺傳機(jī)理的闡釋奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

本試驗(yàn)收集317頭北京黑豬個(gè)體,均飼養(yǎng)在北京黑六牧業(yè)科技有限公司,飼養(yǎng)過(guò)程和管理方式均一致,在豬飼養(yǎng)至215日齡時(shí),健康狀況均良好。將317頭豬提前運(yùn)輸至北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司進(jìn)行屠宰,在屠宰中記錄耳號(hào)并采集耳組織樣本,同時(shí)一一對(duì)應(yīng)并記錄肋骨數(shù)和胴體性狀(胴體重、胴體長(zhǎng)[19]、胴體斜長(zhǎng)和胴體直長(zhǎng)[20-21])。

1.2 DNA提取及檢測(cè)

本試驗(yàn)使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒的提取步驟進(jìn)行耳組織樣品DNA提取,使用IMPLEN超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)(ng·μL-1),同時(shí)用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè),檢測(cè)合格的DNA樣品以備后期突變位點(diǎn)篩選試驗(yàn)的使用。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

本試驗(yàn)的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),使用Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中Sscrofa11.1參考基因組,引物序列均由北京六合華大基因科技有限公司合成。本研究設(shè)計(jì)了2個(gè)基因GREB1L(ENSSSC-G00000003699)、MIB1 (ENSSSCG00000025478),共64對(duì)引物,其中在本群體中檢測(cè)到SNPs的5對(duì)引物見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

本試驗(yàn)使用諾唯贊(Code: P505-d1,Vazyme)的高保真酶進(jìn)行PCR,本試驗(yàn)對(duì)317頭北京黑豬個(gè)體采用25 μL反應(yīng)體系(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,0.5 μL 聚合酶,0.5 μL dNTP,1 μL 上游引物,1 μL 下游引物,8.5 μL 無(wú)菌水,1 μL 模板)進(jìn)行PCR(ABI, Singapore),程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,57～63 ℃退火30 s,72 ℃延伸45～60 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)切膠回收單一條帶在北京六合華大基因科技有限公司平臺(tái)進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序。

1.5 基因分型及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)使用DNAStar中的SeqMan進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的比對(duì)和基因分型,使用Microsoft Excel 2016將分型后的結(jié)果進(jìn)行基因型頻率、等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)。將分型的結(jié)果進(jìn)行基因型和表型個(gè)體間的一一對(duì)應(yīng),并使用SAS軟件中的Duncan’s多重檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(P<0.05),動(dòng)物模型:Y=μ+基因型+e,其中Y為表型值,μ為均值,e為隨機(jī)誤差。數(shù)據(jù)結(jié)果使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬肋骨數(shù)和胴體性狀的表型統(tǒng)計(jì)

317頭北京黑豬個(gè)體的表型值(肋骨數(shù)和胴體性狀)見(jiàn)表2,肋骨數(shù)的均值為14.88節(jié),變異系數(shù)為3.56%(變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/均值);胴體長(zhǎng)的均值為98.28 cm,變異系數(shù)為4.84%;胴體直長(zhǎng)的均值為90.11 cm,變異系數(shù)為4.45%;胴體斜長(zhǎng)的均值為76.24 cm,變異系數(shù)為4.30%;胴體重的均值為64.30 kg,變異系數(shù)為11.35%。

表2 肋骨數(shù)和胴體性狀的表型值統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of phenotypic values of the rib number and carcass traits

2.2 北京黑豬GREB1L和MIB1基因的多態(tài)性檢測(cè)及基因型頻率和等位基因頻率分析

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)GREB1L和MIB1基因的mRNA序列進(jìn)行變異位點(diǎn)檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs(表3),在GREB1L基因中檢測(cè)到3個(gè)外顯子區(qū)的突變且均為同義突變,MIB1基因中也檢測(cè)到3個(gè)突變,其中2個(gè)是同義突變,1個(gè)是離外顯子15僅有4 bp之隔的一個(gè)內(nèi)含子區(qū)的可變剪切突變(表3)。這6個(gè)突變位點(diǎn)的等位基因頻率變化范圍為5%～95%,其基因型頻率變化范圍為1%～90%。

表3 北京黑豬中GREB1L和MIB1的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of GREB1L and MIB1 in Beijing black pigs

2.3 北京黑豬GREB1L和MIB1基因的6個(gè)SNPs與肋骨數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗(yàn)將GREB1L和MIB1基因通過(guò)PCR擴(kuò)增及變異檢測(cè)篩選到6個(gè)SNPs,它們與肋骨數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表4。GREB1L基因上的3個(gè)同義突變6∶106574972 G>A、6∶106648540 C>T、6∶106648558 A>G與性狀關(guān)聯(lián)均不顯著;MIB1基因上的1個(gè)同義突變6∶106936590 C>T與胴體長(zhǎng)顯著相關(guān),其中TT基因型個(gè)體的胴體長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì),與其他性狀關(guān)聯(lián)均不顯著;而內(nèi)含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數(shù)顯著相關(guān),且AA型個(gè)體的肋骨數(shù)表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì),與其他性狀均無(wú)顯著關(guān)聯(lián);第三個(gè)同義突變6∶107028660 G>A與肋骨數(shù)和胴體性狀均無(wú)顯著相關(guān)。

3 討 論

我國(guó)作為養(yǎng)豬業(yè)和豬肉消費(fèi)大國(guó),豬一直是畜禽遺傳研究者關(guān)注和研究的重要畜種之一,并且豬是一個(gè)與人類(lèi)相似性較高,容易獲得的優(yōu)選模型。豬的脊椎包括頸椎、胸椎、腰椎、薦椎及尾椎共五部分,通常頸椎數(shù)為7節(jié),薦椎數(shù)為4節(jié),然而胸椎和腰椎總數(shù)存在極大的變異。豬肋骨數(shù)的變異與胴體長(zhǎng)和產(chǎn)肉量之間存在關(guān)聯(lián)。具有偏多肋骨數(shù)的個(gè)體往往具有較大的體型和較高的產(chǎn)肉性能。然而,傳統(tǒng)育種方法很難改善豬的肋骨數(shù)。因此,分子標(biāo)記輔助選擇成為一種有潛力的方法,可以通過(guò)分析個(gè)體的遺傳組成來(lái)選育具有期望肋骨數(shù)的豬種。這種方法可以快速、準(zhǔn)確地提高豬種的肋骨數(shù),從而在養(yǎng)豬生產(chǎn)中帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)效益。豬的肋骨數(shù)是一個(gè)高遺傳力的表型性狀,一般遺傳力估計(jì)為0.60～0.62[22]。研究者最先采用全基因組掃描方法對(duì)梅山母豬與杜洛克公豬的F2群體的180個(gè)微衛(wèi)星進(jìn)行研究,最終將影響豬脊椎數(shù)變異的QTL定位在豬1號(hào)(SSC1)和7號(hào)染色體(SSC7)上[23]。后來(lái)在SSC7上發(fā)現(xiàn)了與椎脊椎發(fā)育相關(guān)的基因,被稱(chēng)為vertnin (VRTN)[24],它被認(rèn)為是與椎骨數(shù)變化相關(guān)的候選基因,且在脊椎形成過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[25]。在SSC1上,Mikawa等[26]發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞核因子(NR6A1)c.748C>T發(fā)生堿基替換,導(dǎo)致了192位密碼子脯氨酸被取代為亮氨酸,并將其作為影響椎骨數(shù)變異的候選基因。本團(tuán)隊(duì)對(duì)豬胸腰椎數(shù)和胸椎數(shù)(肋骨數(shù))也展開(kāi)了大量的研究,先后在SSC7[27],SSC12[28]和SSC6[17]均發(fā)現(xiàn)了與其變異顯著相關(guān)的候選基因和QTL。

表4 GREB1L和MIB1基因6個(gè)SNPs與肋骨數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Association of 6 SNPs of GREB1L and MIB1 genes with rib number and carcass traits

GREB1L基因是GREB1(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)雌激素受體結(jié)合1)的重要旁系同源物,在胚胎后腎和生殖器發(fā)育中起主要作用,并已被報(bào)道為維甲酸(RA)信號(hào)傳導(dǎo)的靶點(diǎn)。之前的研究表明,GREB1L基因與雙側(cè)腎發(fā)育不全、內(nèi)耳畸形和耳聾有關(guān)[29-31]。并與RA(維甲酸)信號(hào)通路[30]和Wnt信號(hào)通路[32]相關(guān)。在脊椎動(dòng)物胚胎的近軸中胚層內(nèi),RA、Wnt和FGF信號(hào)通路的活性呈現(xiàn)分級(jí)分布。具體而言,Wnt和FGF信號(hào)在后部未分段的近軸中胚層中顯示出最高的活性。而RA信號(hào)則在體節(jié)中建立了具有最高活性的反梯度作用。這意味著在胚胎發(fā)育過(guò)程中,這些信號(hào)的活性在近軸中胚層內(nèi)呈現(xiàn)一定的空間分布模式,其中Wnt和FGF信號(hào)在胚胎的后部未分段區(qū)域活躍,而RA信號(hào)在體節(jié)區(qū)域活躍,并且其活性隨著體節(jié)的增加而逐漸增強(qiáng)。這些信號(hào)的相互作用和調(diào)控有助于體節(jié)的形成,體節(jié)在脊椎動(dòng)物形成脊椎的過(guò)程中起著重要作用[33]。雖然GREB1L基因在豬肋骨數(shù)變異方面的研究還相對(duì)較少,但是基于其在胚胎發(fā)育中的重要作用,可以將其定義為候選基因。進(jìn)一步的研究可以幫助驗(yàn)證GREB1L基因在豬肋骨數(shù)變異中的確切作用機(jī)制。

MIB1是MIB E3泛素蛋白連接酶1,是一種大的多結(jié)構(gòu)域環(huán)狀 E3連接酶[34]。MIB被認(rèn)為是Notch發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[35]。MIB1 在 Notch 信號(hào)通路中的激活作用十分廣泛,可以直接與各種 Notch配體(jagged 1、jagged 2、Dll1、Dll3 和 Dll4)結(jié)合促進(jìn) Notch 配體泛素化和內(nèi)吞作用[36]。在MIB1 敲除小鼠中,Notch 信號(hào)通路相應(yīng)表現(xiàn)出缺陷,Notch 信號(hào)減少,表現(xiàn)為 Notch 活性形式 Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的生成受到抑制、下游靶基因表達(dá)降低以及體節(jié)發(fā)生、心臟發(fā)生等受損[36]。在斑馬魚(yú)中,MIB1 突變體也表現(xiàn)出類(lèi)似的現(xiàn)象[37]。除此之外,MIB1 在 Wnt 信號(hào)通路中也發(fā)揮重要作用,主要是通過(guò)與 RYK 結(jié)合形成復(fù)合物來(lái)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[38]。之后有研究顯示,MIB1 還與 Wnt 通路中的其他成分 Catenin 家族成員(α、β、delta1 和 delta2)、幾個(gè) MAP/微管親和力調(diào)節(jié)激酶(Mark1、Mark 3和Mark 4)和酪蛋白激酶家族成員等存在相互作用。MIB1 在 Notch 信號(hào)通路和 Wnt 信號(hào)通路之間的潛在連接因子是內(nèi)吞作用[39]。因此,將MIB1基因定義為候選基因,但還需進(jìn)一步驗(yàn)證它的作用機(jī)制。

對(duì)于本試驗(yàn)的GREB1L和MIB1基因也在別的方向上進(jìn)行了多態(tài)性的探索與研究。GREB1L基因作為一個(gè)與腎發(fā)育相關(guān)的基因,它的突變會(huì)引起腎發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn)GREB1L基因的一個(gè)錯(cuò)義突變c.4507C>T會(huì)導(dǎo)致患者單側(cè)缺腎[40]。研究發(fā)現(xiàn),MIB1基因變異與左心室心肌致密化不全相關(guān),但攜帶MIB1基因中c.376C>T變異的患者s31表現(xiàn)為典型的左心室心律失常性心肌病,伴有廣泛的纖維-脂肪替代左心室游離壁,左心室增大但無(wú)小梁形成[41-42]。本試驗(yàn)主要是對(duì)兩個(gè)基因的多態(tài)性進(jìn)行探索,在群體中未發(fā)現(xiàn)GREB1L基因中突變位點(diǎn)與性狀的顯著相關(guān)。MIB1基因外顯子3中的同義突變6∶106936590 C>T位點(diǎn)與胴體長(zhǎng)性狀顯著相關(guān);在內(nèi)含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數(shù)顯著相關(guān)。但是,在位點(diǎn)鑒定方面的結(jié)果還需要進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。雖然本研究已經(jīng)進(jìn)行了嚴(yán)格的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)處理,但為了確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)驗(yàn)證,以確認(rèn)所鑒定的顯著位點(diǎn)在肋骨數(shù)和胴體性狀中的真實(shí)功能和作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

在北京黑豬群體中,MIB1基因上的6∶106936590 C>T位點(diǎn)與胴體長(zhǎng)性狀顯著相關(guān),內(nèi)含子15～16的6∶107016475 A>G可變剪切突變與肋骨數(shù)顯著相關(guān)。這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)于豬肋骨數(shù)和胴體長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記輔助選育工作提供了基礎(chǔ)。