劉益麗,唐 嬌,閔 奇,楊 露,王澤寧,胡 蓮,趙 迪,江明鋒*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院,成都 610041)

牦牛是長(zhǎng)期生活在我國(guó)青藏高原上的特有物種,可為牧民提供生產(chǎn)及生活所必需的資源,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。犢牦牛出生后,從液體奶到斷奶采食草料經(jīng)歷了巨大的生理和代謝變化,消化道系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能迅速發(fā)育。牦牛皺胃是典型的管狀器官[1],是牦牛的第四個(gè)胃,又稱為真胃,剛出生犢牛的消化吸收功能主要依靠皺胃和小腸來(lái)完成[2]。新生犢牛皺胃已有一定程度的發(fā)育,具有消化吸收能力,攝食液體乳時(shí),經(jīng)食管溝可直接進(jìn)入皺胃消化,利用葡萄糖為機(jī)體供能[3-4],犢牛出生2～3周內(nèi),皺胃是最主要的營(yíng)養(yǎng)消化場(chǎng)所;成年時(shí)期的皺胃主要是對(duì)前胃消化的較小食糜進(jìn)一步消化吸收[5]。由此可見(jiàn),皺胃在牦牛的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。

皺胃早期相關(guān)研究主要集中在疾病、引發(fā)疾病因素、形態(tài)及其影響因素[6-8]。近年研究主要在皺胃相關(guān)酶[9-10]、微生物及其作用等方面[11-12]。有研究對(duì)犢牛皺胃凝乳酶和胃蛋白酶安全性進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果表明皺胃凝乳酶和胃蛋白酶可作為食品酶,用于牛奶加工和奶酪生產(chǎn)[10]。周亞楠等[13]研究發(fā)現(xiàn),哺乳期補(bǔ)飼開(kāi)食料能正向調(diào)控牦牛犢牛的皺胃形態(tài)與功能發(fā)育,進(jìn)而提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。Nazish等[11]從山羊和綿羊皺胃分離出睪酮科單胞菌、威氏假單胞菌和線蟲(chóng)等,研究3種皺胃真菌對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行生物防治,3種皺胃真菌培養(yǎng)濾液濃度增加,線蟲(chóng)的死亡率增加,對(duì)線蟲(chóng)卵孵化具有抑制作用。Kasl等[12]研究發(fā)現(xiàn),含有醋酸鈉的口服電解質(zhì)溶液可限制降低犢牛皺胃內(nèi)大腸桿菌的體外生長(zhǎng)潛力,可能減少皺胃大腸桿菌過(guò)度到腸道,從而減少腹瀉發(fā)病率[14-15]。可見(jiàn)皺胃的深入研究對(duì)反芻動(dòng)物的健康發(fā)育和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

對(duì)牦牛復(fù)胃的轉(zhuǎn)錄組研究主要集中在瘤胃,網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃的相關(guān)研究較少。本團(tuán)隊(duì)謝書(shū)瓊等[16]前期對(duì)牦牛皺胃全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)定和初步分析,但基于不同年齡段牦牛皺胃組織的轉(zhuǎn)錄組分析和功能發(fā)育研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究在前期基礎(chǔ)上,以液體乳為主階段(1、20日齡),過(guò)渡階段(60日齡),反芻為主階段(15月齡和3歲)共5個(gè)年齡段的牦牛皺胃組織為研究對(duì)象,進(jìn)行RNA-Seq高通量測(cè)序及功能分析,篩選參與皺胃發(fā)育和代謝調(diào)控的信號(hào)通路及相關(guān)基因,為今后闡明牦牛皺胃發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)代謝的調(diào)控分子機(jī)制提供更多的理論依據(jù)和重要參考,為皺胃組織相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

動(dòng)物樣本采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣,牦牛培育采用自然放牧方式,犢牛出生后隨母哺乳,自由采食。本試驗(yàn)選取5個(gè)年齡段,即1日齡、20日齡、60日齡、15月齡與3歲的健康牦牛作為研究對(duì)象,每組各3頭。按照以下程序人道地處理牦牛:放血前電休克,昏迷時(shí)經(jīng)頸部放血并快速解剖,用滅菌剪刀取皺胃上皮及皮下組織塊,剪成約1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊,用DEPC水沖洗后迅速放入凍存管中,并立即投入液氮中保存。

1.2 皺胃指數(shù)測(cè)量

準(zhǔn)確測(cè)量每頭牦牛體重,屠宰后迅速取出完整復(fù)胃,將瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃相連部位結(jié)扎,將4個(gè)胃室分開(kāi),清空內(nèi)容物,準(zhǔn)確測(cè)得4個(gè)胃室重量并記錄。皺胃指數(shù)為皺胃重(g)/復(fù)胃重(g),數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± SD)”表示,使用Microsoft Excel 2007與Origin9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、記錄、運(yùn)算與分析。兩組數(shù)據(jù)間的比較用t檢驗(yàn)方法,多組數(shù)據(jù)間的差異分析使用ANOVA檢驗(yàn)方法。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit 試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(AM1561);TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit購(gòu)自Illumina公司(RS-122-2101);Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒購(gòu)自Beckman Coulter公司(A63881);QubitTMRNA HS Assay Kit 購(gòu)自Thermo公司(Q32852);Qubit dsDNA Assay Kit購(gòu)自Thermo公司(Q328520);Bioanalyzer 2100 RNA-6000 Nano Kit購(gòu)自Aglient(5067-1511);Bioanalyzer 2100 DNA-1000 Kit購(gòu)自Aglient(5067-1504);Super Script II Reverse Transcriptase購(gòu)自Invitrogen公司(18064014);PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自TaKaRa公司(RR047B); TB Green Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 購(gòu)自TaKaRa公司(RR820A)。

1.3.2 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司(Centrifuge 5418R);PCR 儀購(gòu)自Bio-rad公司(MyCycler);紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司(NanoDrop 2000);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司(LightCycler 96);凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自天能公司(Tanon 2500);定量?jī)x購(gòu)自Invitrogen公司(Qubit2.0);磁力架購(gòu)自Invitrogen公司(Magneticstand-96);Bioanalyzer生物分析儀購(gòu)自Aglient(2100)。

1.4 RNA提取與 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)mirVanaTMmiRNA ISOlation Kit試劑盒操作流程提取15個(gè)牦牛皺胃組織的總RNA,利用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度、純度(OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm比值)和RNA完整值(RNA integrity number,RIN),隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),將質(zhì)檢合格的RNA置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肐llmina? TruSeq Stranded mRNA樣品制備試劑盒構(gòu)建15個(gè)測(cè)序樣本的cDNA文庫(kù)。主要步驟包括:將樣品總RNA用DNase消化DNA,用Oligo(dT)磁珠富集mRNA;用打斷試劑將mRNA打斷成短片段,以打斷后的mRNA短片段為模板,用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA,利用二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA并用試劑盒純化雙鏈cDNA;對(duì)純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭,片段大小選擇和PCR擴(kuò)增;利用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)構(gòu)建文庫(kù)的大小、濃度及質(zhì)量,得到合格cDNA文庫(kù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與質(zhì)量控制

本試驗(yàn)中15個(gè)樣本的建庫(kù)測(cè)序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成?；贗llumina二代高通測(cè)序平臺(tái)(Illumina HiSeq X ten),采用PE150測(cè)序方式對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,獲得原始序列數(shù)據(jù)(raw reads)。為了得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量reads,使用Trimmomatic軟件[17]進(jìn)行質(zhì)控并去除接頭(adaptor),過(guò)濾掉低質(zhì)量堿基及N堿基得到高質(zhì)量的clean reads,統(tǒng)計(jì)clean reads的Q30和GC含量。用 Hisat2[18]將clean reads與牦牛參考基因組(GCF_000298355.1)進(jìn)行序列比對(duì),通過(guò)基因組比對(duì)率來(lái)評(píng)估樣本的情況。

1.6 主成分分析

利用HTSeq-count[19]軟件獲取落到各個(gè)樣本中基因的reads 數(shù)目,使用cufflinks[20]軟件對(duì)蛋白編碼基因的FPKM[21]表達(dá)量值定量,用R語(yǔ)言繪制主成分分析(principal component analysis,PCA)二維圖。

1.7 差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析

利用HTSeq-count[19]軟件獲得比對(duì)到每個(gè)樣本中蛋白編碼基因的reads數(shù),使用DESeq (2012) R package[22]的函數(shù)estimateSizeFactors對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,使用函數(shù)nbinomTest計(jì)算差異倍數(shù)(Fold Change)和差異的顯著性(P-value)。選取P<0.05,log2(Fold Change)>2 的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO和KEGG[23]通路富集分析。以1日齡樣本為參照,利用GO Seq分別對(duì)20日齡、60日齡、15月齡和3歲齡的牦牛皺胃DEGs進(jìn)行GO功能注釋,基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)功能,按照細(xì)胞組分(cellular component,CC),生物過(guò)程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)將4個(gè)年齡段的DEGs進(jìn)行分類,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到顯著富集的GO條目和KEGG信號(hào)通路。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證牦牛皺胃RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性,隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)基因,利用Primer BLAST設(shè)計(jì)引物,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因的表達(dá)水平。將測(cè)序返樣RNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH作為內(nèi)參基因,利用TB Green? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒在LightCycler 96 系統(tǒng)上檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL:2×TB Green? Premix Ex TaqTMII 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,皺胃組織cDNA 2 μL,RNase Free ddH2O 7 μL。PCR 程序: 95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min;重復(fù)3次。采用2-△△ct法分析數(shù)據(jù),用t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析相對(duì)表達(dá)量,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”,P<0.05為差異顯著。對(duì)應(yīng)的引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因及對(duì)應(yīng)引物序列Table 1 Gene and the corresponding primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 不同年齡段牦牛皺胃重量和指數(shù)分析

對(duì)牦牛5個(gè)年齡段15個(gè)樣本的復(fù)胃重量和皺胃指數(shù)進(jìn)行分析,如表2所示,在同一年齡段,1日齡皺胃最重,瘤胃次之,皺胃重顯著高于網(wǎng)胃和瓣胃重(P<0.05);20日齡皺胃重顯著高于網(wǎng)胃和瓣胃重(P<0.05),與瘤胃重差異不顯著(P>0.05);60日齡瘤胃重最大,顯著高于皺胃、網(wǎng)胃和瓣胃重(P<0.05);15月齡瘤胃重顯著高于瓣胃(P<0.05),皺胃與網(wǎng)胃重最小,差異不顯著(P>0.05);3歲瘤胃重量最大,顯著高于瓣胃(P<0.05),皺胃重大于網(wǎng)胃重,差異不顯著(P>0.05)。如圖1所示,1日齡、20日齡和60日齡牦牛皺胃重量差異不顯著(P>0.05),15月齡與3歲牦牛的皺胃重顯著增加(P<0.05),皺胃重整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì);1日齡、20日齡牦牛的皺胃指數(shù)差異不顯著(P>0.05);與1日齡相比,15月齡與3歲牦牛的皺胃指數(shù)顯著下降(P<0.05),皺胃指數(shù)與皺胃重量變化趨勢(shì)相反,整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表2 不同年齡段牦牛復(fù)胃重量的變化Table 2 Changes of compound stomach weight of yaks at different ages

橫坐標(biāo)表示年齡,N=3/組;左縱坐標(biāo)表示皺胃重量,右縱坐標(biāo)表示皺胃指數(shù) The abscissa represents the age, N=3/group, the ordinate on the left side represents the weight of abomasum, and the ordinate on the right side represents the abomasal index圖1 不同年齡組牦牛皺胃重量與指數(shù)分析Fig.1 Analysis of weight and index of abomasum in yak at different ages

2.2 不同年齡段牦牛皺胃總RNA質(zhì)量與測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

15個(gè)皺胃組織樣本的總RNA濃度均大于300 ng·μL-1,RIN值大于7.5,OD260 nm/OD280 nm在2.0～2.2之間,28S/18S核糖體RNA條帶清晰,RNA完整性較好,RNA質(zhì)量檢驗(yàn)合格,可進(jìn)一步用于后續(xù)試驗(yàn)分析。利用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)cDNA文庫(kù)的片段大小與質(zhì)量符合要求,cDNA文庫(kù)有效濃度大于4 nmol·L-1,表明cDNA文庫(kù)構(gòu)建成功。

如表3所示,15個(gè)皺胃組織樣本的有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得過(guò)濾后的clean reads數(shù)目為741.36 M,過(guò)濾后得到的測(cè)序量106.19 G,有效堿基百分比均在93%以上,Q30均在95%以上,GC含量在50%左右,比對(duì)到參考基因組的reads比率均在94%以上,表明15個(gè)樣本的測(cè)序質(zhì)量均較高,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,所選參考基因組的組裝滿足后續(xù)分析要求。

表3 牦牛皺胃組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)分析Table 3 Quality analysis of transcriptome sequencing data of abomasum tissues in yak

2.3 不同年齡段牦牛皺胃基因表達(dá)水平分析

對(duì)不同年齡段牦牛皺胃組織基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,5個(gè)年齡組間的基因表達(dá)水平與基因密度均存在差異。如圖2A所示,1日齡、20日齡和60日齡3個(gè)年齡組組間的基因表達(dá)水平差異較小,15月齡組的基因表達(dá)水平低于其他組,3歲組整體基因表達(dá)量高于其他組;如圖2B所示,20日齡組基因密度高于其他組。

A.不同年齡組牦牛皺胃基因表達(dá)水平箱線圖,橫坐標(biāo)為年齡,縱坐標(biāo)為log10(FPKM+1),且展示了最大值、上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)和最小值。B.不同年齡組牦牛皺胃基因密度分布圖,橫坐標(biāo)為log10(FPKM),縱坐標(biāo)為基因密度 A. Boxplots of gene expression levels in abomasum of yaks at different ages, with the abscissa of age and the ordinate of log10(FPKM+1), showing the maximum, upper quartile, median, lower quartile and minimum values. B. Distribution of abomasal gene density in yaks at different ages, log10(FPKM)in abscissa and gene density in ordinate圖2 不同年齡組牦牛皺胃基因表達(dá)水平箱線圖和基因密度分布圖Fig.2 Boxplots of gene expression levels and distribution of gene density in abomasum of yaks at different ages

2.4 不同年齡段牦牛皺胃差異表達(dá)基因分析

為進(jìn)一步探討在5個(gè)年齡階段牦牛皺胃組織DEGs的表達(dá)模式,本研究采用了兩種比較方法[24],即封閉組 (20日齡vs.1日齡,60日齡vs.1日齡,15月齡vs.1日齡和3歲vs.1日齡),相繼時(shí)間組 (20日齡vs.1日齡,60日齡vs.20日齡,15月齡vs.60日齡和3歲vs.15月齡)。如表4所示,以1日齡組為對(duì)照,隨年齡增加DEGs逐漸增多,在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別鑒定到1 310、1 715、1 931和2 199個(gè)DEGs,且4個(gè)對(duì)比組中上調(diào)基因的數(shù)量均高于下調(diào)基因(表4),其特有DEGs分別為 341、242、395和565個(gè),4個(gè)組共有基因565個(gè)(圖3A),包括GKN1、CXCL17、SCNN1B、SCNN1G和CCL5等基因。以前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)為對(duì)照,20日齡、60日齡、15月齡和3歲組分別鑒定到1 310、861、569和597個(gè)DEGs,20日齡vs.1日齡組的DEGs明顯高于其他3個(gè)對(duì)比組,其特有DEGs分別為 950、419、250和284個(gè),4個(gè)組共有基因9個(gè)(圖3B),分別是MMP9、CDH26、GSTA3、TMEM61、ADGRG5、LOC102269721、LOC102287938、LOC102276015和LOC102271445。

表4 不同年齡段牦牛皺胃組織差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of the number of DEGs in abomasum tissues of yaks at different ages

圖3 不同年齡段牦牛皺胃差異表達(dá)基因韋恩圖,4個(gè)封閉組(A),4個(gè)相繼組(B)Fig.3 Venn diagram of DEGs in abmasum in yaks with 4 closed (A) and 4 consecutive (B) groups at different ages

2.5 不同年齡段牦牛皺胃差異表達(dá)基因的功能注釋及分類

對(duì)封閉組的DEGs進(jìn)行GO富集分析,在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別有1 191、2 578、1 117和2 835條顯著性條目。按P值排序篩選BP、CC和MF三大類的前10條顯著性GO條目。如圖4所示,不同年齡組的前10條顯著性GO條目中有共有的,也有各年齡階段特有的條目。在生物過(guò)程中,總共19個(gè)條目,共有條目12個(gè),其中20日齡、60日齡、15月齡和3歲組共有3個(gè)條目,分別是免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng);20日齡、15月齡和3歲年齡組特有條目分別有1、4和2個(gè),20日齡富集到補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)顯著性條目,60日齡無(wú)特有條目,15月齡分別富集到T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子濃度的正向調(diào)節(jié)、Fc-ε受體信號(hào)通路等顯著性條目,3歲組是細(xì)胞趨化性和干擾素-γ介導(dǎo)的信號(hào)通路顯著性條目。在細(xì)胞組分中,總共14個(gè)條目,共有條目10個(gè),其中20日齡、60日齡、15月齡和3歲組共有5個(gè)條目,分別富集于質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙和質(zhì)膜等顯著性條目;20日齡、15月齡和3歲組各有1個(gè)特有條目,分別富集于膠原三聚體、鈉通道復(fù)合物、絲足和含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)顯著性條目。在分子功能中,總共17個(gè)條目,共有條目10個(gè),其中20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段共有6個(gè)條目,分別富集于抗原結(jié)合、C-C趨化因子、C-C趨化因子受體活性、趨化因子結(jié)合等顯著性條目;20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段特有條目分別為3、1、2和1個(gè),20日齡組富集到雙鏈RNA結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合等條目,60日齡組富集到乙醇脫氫酶(NADP+)活性條目,15月齡組是甲狀腺激素結(jié)合和跨膜信號(hào)受體活性條目,3歲組富集到具有拉伸強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分條目。

2.6 不同年齡段牦牛皺胃差異表達(dá)基因KEGG富集分析

對(duì)封閉組的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行KEGG功能富集分析,在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組中分別有100、102、100和111條顯著通路。按P值排序篩選4個(gè)年齡組的前30條顯著性KEGG通路(圖5)。結(jié)果顯示,每個(gè)年齡組前30條顯著通路同樣存在共有的,也有各年齡階段特有的,總共43條通路,共有通路33個(gè),其中20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段共有20個(gè)條目,包括吞噬體、同種異體移植排斥反應(yīng)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用;20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段特有信號(hào)通路分別是4、1、3和4條,如20日齡組富集到白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路,15月齡組富集到亞油酸代謝、谷胱甘肽代謝和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路,3歲組富集到ECM受體相互作用、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450等信號(hào)通路。

2.7 牦牛皺胃發(fā)育和代謝候選基因篩選

本研究以1日齡為對(duì)照,篩選20日齡、60日齡、15月齡和3歲組皺胃組織DEGs,根據(jù)顯著性高低,分別從4個(gè)年齡組前30個(gè)DEGs中篩選影響牦牛皺胃發(fā)育的相關(guān)候選基因,見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,在20日齡、60日齡、15月齡和3歲的年齡組中均包含共有基因,如KRT20;在20日齡、15月齡和3歲的年齡組中均包含共有基因,如GKN1、CXCL17;在60日齡、15月齡和3歲的年齡組中均包含共有基因,如JCHAIN、SCNN1B、SCNN1G;60日齡和3歲組均包含CCL5、B2M;另外4個(gè)組也有一些獨(dú)有基因,如20日齡中的GPR34、PTGS2、LAPTM5,60日齡組中的SCNN1B,15月齡組中的IGF2BP3,3歲齡組中的IGF2BP2,這些基因參與牦牛皺胃的不同發(fā)育階段,可能是與牦牛皺胃發(fā)育相關(guān)的重要候選基因。另外,本研究富集到參與皺胃的葡萄糖代謝、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、胃蛋白酶和溶菌酶活性相關(guān)的信號(hào)通路,分別篩選到12、12、16、4、1和11個(gè)候選基因,見(jiàn)表6。其中GANAB、PRKCSH、GBA2、SLC2A1、SLC2A3、SLC2A4、CPT1B、GOT2等是與牦牛皺胃的代謝和營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)的重要候選基因。

A-C. 4個(gè)年齡組DEGs在BP、CC、MF三大類中前10個(gè)GO條目。氣泡大小表示DEGs的數(shù)量(計(jì)數(shù)),氣泡顏色表示錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR P-value),x軸為-lg(P-value)值,y軸為GO條目 A-C. The top 10 GO terms in molecular function, cellular component and biological process, respectively. The bubble size represents the number (count) of DEGs, the bubble color represents false discovery rate (FDR P-value), the abscissa represents -lg(P-value), and the ordinate displays GO term圖4 差異表達(dá)基因GO富集氣泡圖Fig.4 Bubble charts of GO enrichment of differentially expressed genes

2.8 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

對(duì)隨機(jī)選取的5個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖6所示,以1日齡為對(duì)照,ABAC1基因在20日齡和15月齡上調(diào);ACAT1基因在15月齡上調(diào),但在20日齡、60日齡和3歲組下調(diào);G6PC3、GOT2和SLC38A2基因在20日齡、60日齡、15月齡和3歲組均下調(diào)。上述所挑選的差異表達(dá)基因的qRT-PCR變化規(guī)律與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表達(dá)規(guī)律基本一致,進(jìn)一步表明測(cè)序結(jié)果具有可靠性。

3 討 論

皺胃發(fā)育與多種因素密切相關(guān),如飼養(yǎng)方式[25]、日糧[5,13]等,對(duì)反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。近年來(lái),已有研究對(duì)牛[26-28]、羊[5]、駱駝[29]等的皺胃組織進(jìn)行形態(tài)鑒定和生理功能研究,但這些研究主要集中在皺胃組織形態(tài)、免疫方面等,對(duì)分子水平的功能研究較少。目前關(guān)于牦牛皺胃發(fā)育的分子機(jī)理尚不清楚,需進(jìn)一步研究,為牦牛的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和健康生長(zhǎng)提供理論參考和新思路。本研究中,隨年齡增長(zhǎng)牦牛皺胃重整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì),但20和60日齡的皺胃重差異不顯著,且60日齡有下降趨勢(shì),可能是因?yàn)?0～60日齡是自然放牧犢牦牛生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要階段,正在經(jīng)歷由以液體奶為主到以牧草為主的過(guò)渡,瘤胃快速增長(zhǎng)以適應(yīng)這一變化,但網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃重變化均較小。15月齡和3歲的皺胃重顯著增長(zhǎng),但皺胃指數(shù)逐漸下降,提示隨著年齡增加皺胃組織發(fā)育更加完善,但功能方面可能會(huì)發(fā)生一定程度的變化。1日齡牦牛皺胃重在復(fù)胃重中占比最大,顯著高于其他3個(gè)前胃(P<0.05),可側(cè)面反映牦牛皺胃可能成熟比較早,且新生牦牛皺胃在復(fù)胃中發(fā)揮著重要作用。20日齡至15月齡期間,皺胃重占比相較于前一個(gè)年齡均顯著下降(P<0.05),側(cè)面反映20日齡后牦牛的能量提供不再完全由皺胃組織主導(dǎo),而部分由快速發(fā)育的瘤胃進(jìn)行VFA代謝所提供的營(yíng)養(yǎng)替代,與本實(shí)驗(yàn)室唐嬌等[30]前期對(duì)5個(gè)年齡段牦牛瘤胃的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果相呼應(yīng)。

表5 不同年齡組牦牛皺胃的前30個(gè)差異表達(dá)基因Table 5 The top 30 differentially expressed genes in abomasum of yaks in different age groups

表6 參與皺胃主要代謝功能的候選通路與基因Table 6 The pathways and genes involved in major metabolic functions of abomasum

圖6 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證Fig.6 qRT-PCR verification of DEGs

牦牛皺胃胃壁是由漿膜、肌層、黏膜層和黏膜下層構(gòu)成,其中黏膜又可細(xì)分為上皮、固有層和黏膜肌層[31]。研究發(fā)現(xiàn),牦牛皺胃的腺區(qū)固有層均分布著大量彌散淋巴細(xì)胞和孤立淋巴小結(jié),使其具有比其他反芻動(dòng)物更強(qiáng)的黏膜免疫功能[1],這可能與其長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高原環(huán)境密切相關(guān)。KEGG富集分析顯示,與1日齡相比,在20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段的DEGs共同顯著富集到20條信號(hào)通路,這些通路多與牦牛皺胃組織發(fā)育及免疫調(diào)控相關(guān),包括吞噬體、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體、趨化因子信號(hào)通路、腸道IgA生成通路、Thl和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路等。研究表明,Th17細(xì)胞釋放IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22和IL-9,并通過(guò)它們與腸上皮細(xì)胞相互作用,從而誘發(fā)胃腸道炎癥[32],皺胃與炎癥性腸病之間是否具有聯(lián)系、是否可通過(guò)皺胃探究牦牛炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制,以及Th17細(xì)胞分化途徑是否與其相關(guān)值得進(jìn)一步研究。20日齡、60日齡、15月齡和3歲4個(gè)年齡段特有信號(hào)通路分別有4、1、3和4條,20日齡組是白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路,15月齡組是亞油酸、谷胱甘肽代謝和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路,3歲組是ECM受體相互作用、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450, 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)的代謝途徑和ECM受體相互作用途徑在維持瘤胃上皮完整性和健康中發(fā)揮作用[33],可推斷這些代謝通路可能在牦牛皺胃的健康發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)差異表達(dá)基因的顯著性高低,分別從4個(gè)年齡組前30個(gè)DEGs中篩選影響牦牛皺胃發(fā)育相關(guān)的候選基因,其中GKN1、CXCL17、SCNN1B、SCNN1 G、CCL5和IGF2BP3等基因可能與牦牛皺胃發(fā)育相關(guān)。胃動(dòng)蛋白1(gastrokine-1,GKN1)是胃動(dòng)蛋白家族成員之一,該基因能在胃粘膜中特異性表達(dá)一種新型自分泌/旁分泌蛋白。研究發(fā)現(xiàn),GKN1具有保護(hù)胃竇粘膜,并能促進(jìn)損傷胃竇粘膜的修復(fù)和增殖分化,促進(jìn)胃粘膜上皮細(xì)胞分裂與移動(dòng)、維持上皮層完整性和抑癌等功能[34-36]。趨化因子17(CXC chemokine ligand 17,CXCL17)是一種與粘膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關(guān)的新型CXC趨化因子,該基因在支氣管和胃部均有表達(dá),且前者表達(dá)高于胃部[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)CXCL17參與胃癌的發(fā)生[39],能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[40]。另外,在對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌根除者的胃內(nèi)菌群特征研究中發(fā)現(xiàn),CXCL7可能影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)[41],與胃部健康息息相關(guān)。鈉通道上皮1亞基β(sodium channel epithelial 1 subunit beta,SCNN1B)位于染色體16p12.2-p12.1,編碼640個(gè)氨基酸[42-43]。研究發(fā)現(xiàn),SCNN1B基因能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制癌細(xì)胞侵襲、增殖與遷移和促進(jìn)細(xì)胞粘附,其過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[44-45]。鈉通道上皮1亞基γ(sodium channel epithelial 1 subunit gamma,SCNN1G)主要在胃癌細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中,研究表明SCNN1G能顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲與遷移,該基因的表達(dá)與WNT/β-catenin信號(hào)通路緊密相關(guān)[46]。C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5,CCL5)是CC亞家族趨化因子基因,具有調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的功能,同時(shí)能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放,參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過(guò)程[47];CCL5也能提高活化T細(xì)胞的葡萄糖攝取能力和ATP水平[48]。并在瘤胃上皮的基底和棘突層定位到CCL5,在瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[30,49]。胰島素樣生長(zhǎng)因子II mRNA結(jié)合蛋白3(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2BP3)是一種RNA結(jié)合蛋白,能參與細(xì)胞極化、遷移、增殖和分化等生物過(guò)程[50-51]。綜上,GKN1、CXCL17、SCNN1B、SCNN1G、CCL5和IGF2BP3基因可能在牦牛皺胃組織的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。

牦牛皺胃可消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包含葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等,本研究富集到參與皺胃的葡萄糖代謝、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、胃蛋白酶和溶菌酶活性相關(guān)的信號(hào)通路,分別篩選到12、12、16、4、1和11個(gè)候選基因。其中GANAB、PRKCSH、GBA2、SLC2A1、SLC2A3、SLC2A4、CPT1B、GOT2、SLC15A1等是與牦牛皺胃代謝和營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)的重要候選基因。葡萄糖酰神經(jīng)酰胺酶2(glucosylceramidase beta 2,GBA2)基因編碼一種膽汁酸β-葡萄糖苷酶,可催化膽汁酸3- o -葡萄糖苷作為內(nèi)源性化合物的水解,在碳水化合物的運(yùn)輸和代謝中起作用[52]。溶質(zhì)載體家族2成員1(solute carrier family 2 member 1,SLC2A1)又稱GLUT1,是反芻動(dòng)物促進(jìn)葡萄糖攝入的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[53]; 溶質(zhì)載體家族27成員4(solute carrier family 27 member 4,SLC27A4)又稱FATP4,是動(dòng)物機(jī)體調(diào)控脂肪酸攝取的重要因子,能促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂質(zhì)的吸收[54];溶質(zhì)載體家族15成員1(solute carrier family 15 member 1,SLC15A1)又稱PepT1,參與小肽的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn),可直接促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收[55]。研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)飼精料更有利于犢牦牛對(duì)葡萄糖、脂肪、蛋白質(zhì)的消化吸收,同時(shí)發(fā)現(xiàn)牦牛皺胃GLUTI、PepT1和FATP4基因相對(duì)表達(dá)量均顯著升高[13,56],說(shuō)明這些基因在牦牛皺胃的營(yíng)養(yǎng)代謝和吸收過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于牦牛皺胃營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究極少,有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)液體乳為主階段(1、20日齡)、過(guò)渡階段(60日齡)、反芻為主階段(15月齡和3歲齡)共5個(gè)年齡段的牦牛皺胃組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并對(duì)復(fù)胃相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中,瘤胃重的增長(zhǎng)最快,其次是瓣胃、網(wǎng)胃和皺胃,且皺胃指數(shù)整體呈下降趨勢(shì)。GO注釋分析和KEGG富集分析結(jié)果表明,差異表達(dá)基因多參與免疫反應(yīng)、吞噬體、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、ECM受體相互作用、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性物質(zhì)的代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路有利于牦牛在高原環(huán)境中更好促進(jìn)皺胃細(xì)胞的增殖分化,提高免疫力,更有利于皺胃的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)牦牛皺胃營(yíng)養(yǎng)代謝通路進(jìn)一步篩選,得到GANAB、PRKCSH、GBA2、SLC2A1、SLC2A3、SLC2A4、CPT1B、GOT2和SLC15A1等與皺胃營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝相關(guān)的重要候選基因。上述這些基因可能參與牦牛皺胃的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)程,可為進(jìn)一步理解牦牛皺胃的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)代謝機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。