趙 楠, 李秉桓, 宋宇寧, 韓 釗, 武淑芬,*

(1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300457; 2.天津蘭瑞生物科技有限公司, 天津 300384)

紅曲色素(monascus pigments,Mps)是由紅曲霉屬的絲狀真菌在代謝過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,是聚酮類化合物的混合物[1]。目前已被廣泛研究和應(yīng)用的有6種醇溶性Mps,包括兩種黃色素,即紅曲素(monascin)(Y1)和安卡紅曲黃素(ankaflavin)(Y2);兩種橙色素,即紅斑紅曲素(rubropunctatin)(O1)和紅曲玉紅素(monascorubrin)(O2);兩種紅色素,即紅斑紅曲胺(rubropunctamine)(R1)和紅曲玉紅胺(monascrubramine)(R2)[2]。這些色素分子化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,不同色素組分通常以混合物的形式存在于發(fā)酵產(chǎn)物中。由于分離難度大、成本高,Mps大多以混合物的形式應(yīng)用于食品工業(yè)[3]。Mps通常作為食品著色劑應(yīng)用于肉制品、調(diào)味品、面制品等食品工業(yè),Mps還具有抗炎、抑菌、防腐、抗氧化、抗癌等生理活性[1,4]。然而,Mps對溫度和光照敏感,穩(wěn)定性較差,同時在不同pH值條件下溶解性也存在較大差異,限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[5-7]。

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG),是存在于大多數(shù)反芻動物乳中的一種球狀蛋白質(zhì),分子質(zhì)量為18.3 kDa,由162個氨基酸殘基構(gòu)成,等電點pI約為5.2[8-9]。β-LG也是牛乳清蛋白中的主要成分,其含量大約占乳清蛋白的50%[10]。β-LG是由8個反平行的β-折疊鏈組成的β-桶狀結(jié)構(gòu),又稱calyx結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)易與疏水性小分子結(jié)合,是配體結(jié)合的潛在位點[11]。研究表明,β-LG與配體之間的結(jié)合,不僅受配體自身性質(zhì)的影響,還受外界環(huán)境因素的影響,因為β-LG的結(jié)構(gòu)會隨溶液pH值的變化而改變[12]。在生理條件下,反芻動物中的β-LG一般以二聚體形式存在;而當pH值小于3.0時,β-LG主要以單體形式存在;當pH值在3.5～5.5時,β-LG二聚體則轉(zhuǎn)變?yōu)榘司垠w[13];當pH值大于7.4時,β-LG由二聚體解離為單體[14]。借助β-LG獨特的構(gòu)象變化機制,可實現(xiàn)多種疏水活性成分溶解性、穩(wěn)定性及生物可及性的提高[15-16]。Zagury等[17]制備了表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與β-LG復(fù)合物,顯著提高了EGCG的穩(wěn)定性、抗氧化活性及體內(nèi)生物利用度。Abdollahi等[18-19]分別研究了香草酸在酸性(pH值為2.4)和中性(pH值為7.2)條件下與β-LG的相互作用,為香草酸在酸性食品和中性乳制品中的應(yīng)用提供了理論參考。Wang等[20]探究了在pH值為7.0和8.1的條件下,β-LG與番茄紅素之間的結(jié)合情況,發(fā)現(xiàn)當pH值為8.1時,配合物具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。Zhu等[21]發(fā)現(xiàn),β-LG與芹菜素在pH值為6.2時形成的復(fù)合物親和力強且穩(wěn)定性高。

蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用會影響食品的風(fēng)味、顏色和營養(yǎng)功能的變化,以蛋白質(zhì)作為載體可用于改善食品功能因子的物理性質(zhì),同時使復(fù)合物表現(xiàn)出更優(yōu)的生理活性[22-23]。β-LG是一種很好的生物大分子載體,Mps作為一種脂溶性小分子,其光和熱不穩(wěn)定性限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用,目前有關(guān)β-LG作為壁材包載Mps的研究尚未見報道。本研究擬在不同pH值條件下,研究 β-LG 與Mps之間的相互作用,利用熒光光譜和圓二色譜,分析β-LG與Mps的結(jié)合行為,并采用分子對接技術(shù)探究β-LG與Mps的結(jié)合機制,對β-LG&Mps復(fù)合物的抗氧化活性、熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性進行評價。本研究旨在為增強Mps的穩(wěn)定性,拓寬Mps應(yīng)用領(lǐng)域提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白(β-LG)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH),上海源葉生物科技有限公司;Mps提取物(1 031.25 U/g),實驗室自制;無水乙醇,天津市江天化工技術(shù)股份有限公司;無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;鹽酸,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純,所有試劑配制及實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP型天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;SevenEasy型實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-Vis型紫外-可見分光光度計,美國安捷倫公司;F-2500型熒光分光光度計,日本日立公司;MOS-450型圓二色譜儀,法國Bio-Logic公司;Infinite M200 PRO型酶標儀,瑞士Tecan公司;DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器,江蘇金怡儀器科技有限公司;HPG-280HX型人工氣候箱,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;TES-1339型照度計,泰仕電子工業(yè)股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1β-LG與Mps復(fù)合物的制備

1) β-LG溶液制備。準確稱取10 mg的β-LG粉末,分別溶于0.1 mol/L pH值為2.6、6.2、7.1、8.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,在室溫條件下渦旋1～2 min,使其充分溶解,置于4 ℃冰箱過夜,使蛋白質(zhì)充分水合。依據(jù)β-LG的消光系數(shù)(ε278 nm=17.6 mol·mL-1·cm-1)[21],對β-LG溶液進行稀釋,即得到濃度為100 μmol/L的β-LG溶液,置于4 ℃ 冰箱待用。

2) Mps溶液制備。稱取一定量的Mps粉末,溶于無水乙醇中,在室溫下渦旋1～2 min,超聲處理2～3 min,攪拌至充分溶解,得到質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL的色素母液,避光保存、待用。

3) β-LG和Mps混合溶液制備。分別取β-LG溶液與Mps溶液混合,得到pH值為2.6、6.2、7.1、8.2的混合溶液,使得β-LG的終濃度固定為10 μmol/L,Mps的終質(zhì)量濃度為0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/mL。將配制好的溶液混合均勻,室溫下靜置30 min,待二者充分結(jié)合后進行測定。各體系中無水乙醇體積分數(shù)不超過3%,以消除乙醇對蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)變性[24]。

1.3.2β-LG熒光光譜測定

在室溫條件下,使用熒光分光光度計測定蛋白的熒光光譜,記錄隨著pH值與Mps質(zhì)量濃度的改變,β-LG內(nèi)在熒光光譜的變化情況。設(shè)定激發(fā)波長為295 nm,掃描波長為300～450 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm。以不含β-LG的同等質(zhì)量濃度的Mps溶液體系的熒光光譜作為背景,以扣除Mps自身熒光光譜的干擾。

1.3.3β-LG二級結(jié)構(gòu)含量測定

用圓二色譜儀在室溫下分別分析不同pH值和不同Mps質(zhì)量濃度條件下β-LG二級結(jié)構(gòu)含量變化情況。β-LG溶液的濃度固定為10 μmol/L,Mps質(zhì)量濃度設(shè)定為0.004 mg/mL和0.032 mg/mL。測量波長為200～260 nm,石英比色皿厚度為0.1 cm, 步長1 nm。所有樣品掃描3次取平均值。利用CDNN軟件對圓二色譜數(shù)據(jù)進行處理,計算β-LG各二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.4分子對接

β-LG的晶體結(jié)構(gòu)分別從PDB(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)(http:∥www.rcsb.org)下載,pH值為2.6、6.2、7.1、8.2混合溶液的PDB編號依次為1DV9、3BLG、1BSY和2BLG[21]。通過AutoDock軟件對β-LG進行加氫、去除水分子等處理以生成不同pH值的β-LG的PDBQT文件。Mps分子的3D結(jié)構(gòu)從小分子數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載,其中R2的分子結(jié)構(gòu)需要利用ChemBioDraw軟件繪圖后,再通過Chem 3D軟件生成3D結(jié)構(gòu),然后對其進行能量最小化處理,并用OpenBabel軟件進行格式轉(zhuǎn)換,生成可供對接的PDBQT文件。利用AutoDock vina軟件進行盲對接,并用Pymol和Discovery Studio 2017 R2 Client軟件進行可視化分析。

1.3.5抗氧化活性測定

參考趙煥焦[10]的方法,稍加修改。稱取3.95 mg 的DPPH粉末溶解于100 mL的無水乙醇中,配制成濃度為100 μmol/L的DPPH工作液。按照1.3.1中方法制備β-LG&Mps溶液,使復(fù)合物體系中β-LG的終濃度為10 μmol/L,Mps終質(zhì)量濃度分別為0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/mL。 避光靜置20 min,使二者充分反應(yīng),然后向樣品組加入100 μL的DPPH工作液,對照組加入100 μL的無水乙醇,空白組以相應(yīng)PBS代替樣品,混勻后避光反應(yīng)30 min,使用酶標儀于517 nm處測定吸光度值,并根據(jù)式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式(1)中,A0為空白組的吸光度,A1為對照組的吸光度,A2為樣品組的吸光度。

1.3.6熱穩(wěn)定性分析

按照1.3.1中方法制備β-LG&Mps復(fù)合物溶液,使復(fù)合物體系中β-LG終濃度為40 μmol/L,Mps終質(zhì)量濃度為0.048 mg/mL。量取2 mL樣品溶液,分別置于4 ℃冰箱,于25 ℃和50 ℃磁力加熱攪拌器內(nèi)避光孵育。以相同質(zhì)量濃度的Mps溶液作為對照,每間隔2 h取樣一次,測定樣品在410 nm處的吸光度(An)。每個樣品設(shè)置3組平行,取平均值進行計算。將每組樣品的初始吸光度記為A初,保留率設(shè)為100%,按式(2)進行計算。

(2)

式(2)中,An為第n小時吸光度,A初為樣品初始吸光度。

1.3.7光穩(wěn)定性分析

按照1.3.1中方法制備β-LG&Mps溶液,使復(fù)合物體系中β-LG終濃度為40 μmol/L,Mps終質(zhì)量濃度為0.048 mg/mL。量取2 mL樣品溶液,分別置于25 ℃,光照強度為600 Lux和避光條件下孵育。以相同質(zhì)量濃度的Mps溶液作為對照,每間隔12 h取樣一次,測定樣品在410 nm處的吸光度。每個樣品設(shè)置3組平行,取平均值進行計算。將每組樣品的初始吸光度記為A初,保留率設(shè)為100%,按式(2)進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理,用Origin 2022軟件對數(shù)據(jù)進行分析和繪圖。所有實驗設(shè)置3個平行,重復(fù)測定2次,結(jié)果用平均值±標準差表示,并用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH值條件下Mps與β-LG結(jié)合行為分析

2.1.1Mps的結(jié)合對β-LG內(nèi)源熒光光譜的影響

由于蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光易受蛋白分子微環(huán)境的影響,因此可通過測定蛋白質(zhì)熒光強度的變化,來推斷蛋白質(zhì)是否與小分子之間發(fā)生了結(jié)合作用。對不同pH值、不同Mps質(zhì)量濃度條件下β-LG內(nèi)源熒光光譜的分析結(jié)果如圖1。由圖1可知,當激發(fā)波長為295 nm時,β-LG在337 nm附近有強吸收峰,且隨著Mps質(zhì)量濃度的增加,β-LG的固有熒光強度逐漸降低,在4個實驗pH值范圍內(nèi)均發(fā)生了熒光猝滅,這表明Mps和β-LG之間發(fā)生了相互作用。此外,不同pH值條件下β-LG固有熒光性質(zhì)不同。當pH值由2.6提高到8.2時,β-LG自身熒光強度增大,這表明β-LG所處微環(huán)境的極性改變,熒光發(fā)色基團由親水環(huán)境向疏水環(huán)境轉(zhuǎn)移[25]。同時,隨著Mps質(zhì)量濃度增大,β-LG的熒光強度逐漸降低,在Mps質(zhì)量濃度增大到0.064 mg/mL時,Mps對β-LG熒光猝滅強度可通過猝滅率表示,見式(3)。

β-LG為10 μmol/L,Mps后括號內(nèi)數(shù)字表示Mps質(zhì)量濃度,單位為mg/mL。

(3)

式(3)中,A0和A1分別為β-LG和β-LG&Mps的熒光強度最大值。

根據(jù)式(3)計算,在不同pH值條件下,Mps對β-LG的猝滅率分別為74.7%(pH值2.6),94.2%(pH值6.2),97.2%(pH值7.1)和97.4%(pH值8.2)。這可能與β-LG在不同pH值條件下的結(jié)構(gòu)存在差異有關(guān)[26]。

2.1.2Mps的結(jié)合對β-LG二級結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析。為了進一步分析在不同pH值條件下Mps的結(jié)合對β-LG二級結(jié)構(gòu)的影響,測定了在4個實驗pH值范圍內(nèi),β-LG同Mps結(jié)合前后的圓二色譜,如圖2。由圖2可見,圓二色譜在216 nm處有一個大的負峰,這是β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰,表明β-LG主要是由β-折疊組成的蛋白質(zhì)[27]。隨著Mps的加入,負峰強度有所降低,使β-LG的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化,但譜圖中的峰形沒有明顯改變,說明β-LG與Mps結(jié)合后仍保持較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

β-LG為10 μmol/L,Mps后括號內(nèi)數(shù)字表示Mps質(zhì)量濃度,單位為mg/mL。

為了進一步量化蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量,通過CDNN軟件對樣品的二級結(jié)構(gòu)進行計算,結(jié)果如表1。當β-LG與Mps結(jié)合后,α-螺旋含量略有降低,β-折疊含量增加,且β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量變化不大。這表明與Mps結(jié)合后,β-LG的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著改變,即沒有明顯松弛或展開[21,28]。

表1 不同pH值條件下Mps添加對β-LG二級結(jié)構(gòu)的影響

2.1.3Mps與β-LG分子對接結(jié)果分析

據(jù)報道,β-LG上存在4個潛在的活性位點,供其與配體結(jié)合,包括β-桶狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部疏水空腔、α-螺旋和β-桶狀結(jié)構(gòu)之間的表面疏水口袋、靠近Trp19至Arg124處的外表面以及二聚體界面[21, 29]。而PDB中所下載的β-LG的晶體結(jié)構(gòu)并不包含配體的結(jié)構(gòu)信息,無法確定其最佳結(jié)合位點。因此,為了預(yù)測6種Mps分子在β-LG上的結(jié)合位點,采用盲對接方式進行模擬分析。在利用AutoDock vina軟件運行20次對接后,生成的Mps分子構(gòu)象按照對接結(jié)合能的大小進行排序,在每個pH值下選擇結(jié)合能最低的對接構(gòu)象來預(yù)測其結(jié)合位點。6種Mps分子和β-LG分子的結(jié)構(gòu)及對接結(jié)果如圖3至圖7。

圖3 6種Mps分子和β-LG分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of six Mps and β-LG

由圖4(a)至圖7(a)可知,在同一pH值條件下,6種Mps分子與β-LG的同一區(qū)域相結(jié)合,這可能是因為Mps分子結(jié)構(gòu)具有相似性。從圖4(a)可知,在pH值為2.6時,EF Loop處于閉合狀態(tài),6種Mps分子主要結(jié)合在D鏈和E鏈附近的外表面。由圖5(a)可知,在pH值為6.2時,EF Loop仍處于閉合狀態(tài),6種Mps分子主要結(jié)合在A鏈和B鏈附近的外表面,這表明β-LG 結(jié)構(gòu)中Trp19至Arg124附近的外表面是6種Mps分子結(jié)合的一個主要位點。而當pH值大于7.0時,EF所形成的Loop打開,使得配體能夠進入疏水空腔內(nèi)的結(jié)合位點[25]。由圖6(a)和圖7(a)可知,在pH值為7.1和8.2時,6種Mps分子主要結(jié)合在β-桶狀結(jié)構(gòu)的開口端位置,這表明在中性以及偏堿性環(huán)境中,β-桶狀結(jié)構(gòu)的疏水空腔是6種Mps分子的主要結(jié)合位點。圖4(b)至圖7(b)分別顯示了β-LG的氨基酸殘基與Mps分子結(jié)合的相互作用力。在不同pH值條件下,6種Mps分子與β-LG的結(jié)合區(qū)域相互靠近,而參與結(jié)合作用的氨基酸殘基不同,同時維持復(fù)合物的相互作用力均涉及范德華力、疏水相互作用和氫鍵。由圖4(b)可見,在pH值為2.6時,只有一種Mps分子即R2與β-LG的Leu87形成了一個碳氫鍵;由圖5(b)可見,在pH值為6.2時,每種Mps分子均與β-LG之間形成氫鍵,參與氫鍵形成的主要氨基酸有Gly52、Lys75、Thr76和Lle12等;由圖6(b)可見,在pH值為7.1時,除了O1未與β-LG形成氫鍵,其他分子均形成2個以上氫鍵,參與氫鍵形成的主要氨基酸殘基有Asn109、Asn90和Asn88等;由圖7(b)可見,在pH值為8.2時,Mps分子與β-LG之間形成的氫鍵數(shù)量為1～4個,參與結(jié)合的氨基酸殘基有Asn88、Asn90、Ser116、Lys69和Lys60。除了氫鍵以外,疏水相互作用也是主要驅(qū)動力,包括烷基、π-烷基、π-σ等。本研究結(jié)果表明,β-LG 與Mps之間能夠形成非共價復(fù)合物,且Mps能夠結(jié)合到β-LG的疏水空腔上,但在pH值為2.6條件下形成的氫鍵數(shù)量較少,而在pH值為6.2、7.1、8.2條件下形成的氫鍵數(shù)量較多,這可能對復(fù)合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

圖4 pH值為2.6時6種Mps分子與β-LG分子的對接結(jié)果Fig.4 Docking results of β-LG with six Mps at pH 2.6

圖5 pH值為6.2時6種Mps分子與β-LG分子的對接結(jié)果Fig.5 Docking results of β-LG with six Mps at pH 6.2

圖6 pH值為7.1時6種Mps分子與β-LG分子的對接結(jié)果Fig.6 Docking results of β-LG with six Mps at pH 7.1

2.2 不同pH值條件下β-LG&Mps的抗氧化性及穩(wěn)定性分析

2.2.1抗氧化性分析

DPPH在乙醇溶液中呈現(xiàn)紫色,在517 nm處有特征吸收峰,當存在抗氧化活性成分時,其溶液顏色變淺,吸光度值降低,表明DPPH自由基被部分清除。因此,通過測定DPPH吸光值可對樣品的抗氧化能力進行定量分析。分別測定了pH值為2.6、6.2、7.1和8.2時,β-LG與Mps及二者復(fù)合后對DPPH自由基的清除能力,實驗結(jié)果如圖8。由圖8可見,在相同蛋白濃度、不同pH值條件下,β-LG(10 μmol/L)的DPPH自由基清除率分別為13%、19%、22%和16%,表明β-LG在中性環(huán)境中清除DPPH自由基的能力更強。隨著復(fù)合物中Mps質(zhì)量濃度從0.004 mg/mL增加到0.064 mg/mL,復(fù)合物的抗氧化能力也顯著增強(P<0.05),并呈濃度依賴性,這表明高質(zhì)量濃度的Mps,對復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響更為顯著。

β-LG為10 μmol/L,Mps和β-LG&Mps后括號內(nèi)數(shù)字表示Mps質(zhì)量濃度,單位為mg/mL。不同小寫字母表示DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05)。

當Mps質(zhì)量濃度達到0.064 mg/mL,在pH值為6.2和7.1時,復(fù)合物的DPPH自由基清除能力顯著高于未復(fù)合的Mps(P<0.05);而在pH值為2.6和8.2時差異不顯著(P>0.05)。這表明,復(fù)合物抗氧化能力的強弱主要與Mps自身抗氧化能力密切相關(guān)。在pH值為2.6、6.2和7.1時,復(fù)合物的DPPH自由基清除率達到了90%以上,而在pH值為8.2時,復(fù)合物的自由基清除率為51%。這可能是由于Mps中紅色素和橙色素具有很強的抗氧化活性,對DPPH自由基的清除能力要強于黃色素組分,而在弱堿性環(huán)境中,紅色素和橙色素在高pH值條件下自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,黃色素較為穩(wěn)定[30-31]。雖然復(fù)合物的抗氧化能力比單獨的β-LG和相應(yīng)質(zhì)量濃度的Mps強,但小于兩者抗氧化能力的總和,表明兩者之間產(chǎn)生了拮抗作用,這可能是由于Mps分子結(jié)構(gòu)中的某些基團與β-LG發(fā)生非共價相互作用,從而使復(fù)合物的抗氧化能力減弱[32]。

2.2.2熱穩(wěn)定性分析

由于Mps中紅、橙、黃色素都在400 nm左右有較高的吸光值,通常選用410 nm處的吸光度來表示色素濃度[31]。本實驗通過測定410 nm處吸光度值的變化來計算Mps的保留率,以此對熱穩(wěn)定性進行評價。測定了4、25、50 ℃時,復(fù)合物中的Mps和未復(fù)合的Mps保留率,實驗結(jié)果如圖9。由圖9可知,在不同pH值條件下,復(fù)合物中Mps的保留率均高于未復(fù)合的Mps,這表明Mps與β-LG復(fù)合后熱穩(wěn)定性的提高。由圖9(a)可知,在pH值為2.6,溫度為4 ℃和 25 ℃ 時,復(fù)合物中的Mps和未復(fù)合的Mps在10 h內(nèi)均發(fā)生快速降解,復(fù)合物中Mps的保留率為59.1%和54.3%,未復(fù)合的Mps的保留率則為36.3%和32.7%。

由圖9(a)和(b)可知,在溫度為50 ℃,pH值為2.6或6.2時,復(fù)合物在前2 h內(nèi)發(fā)生快速降解,隨著加熱時間延長,吸光度值變大,保留率增加。這可能是由于在強酸條件下,Mps發(fā)色團遭到破壞,結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而使溶液的顏色發(fā)生轉(zhuǎn)變[33],導(dǎo)致吸光度增大。這表明,色素在酸性條件下不穩(wěn)定,該結(jié)果與分子對接結(jié)果一致。圖4(b)的分子對接結(jié)果顯示,在pH值為2.6時,Mps與β-LG形成非共價復(fù)合物時生成的氫鍵數(shù)量較少,這使得復(fù)合物的穩(wěn)定性較差,因而形成的復(fù)合物對Mps的保護作用較弱。由圖9(b)、(c)、(d)可知,在pH值為6.2、7.1、8.2時,溫度為50 ℃的條件下,復(fù)合物中Mps的保留率均高于未復(fù)合的Mps,分別提高了58%、30%和24%,這表明Mps與β-LG復(fù)合后熱穩(wěn)定性提高,在 10 h 內(nèi)幾乎沒有損失。由圖9(b)可知,對于未復(fù)合的Mps,在pH值為6.2時,3個溫度下均發(fā)生快速降解,4 ℃和25 ℃下保留率在60%左右,50 ℃下保留率為42%;由圖9(c)和(d)可知,在pH值為7.1和8.2時,4 ℃下的保留率能夠保持在90%以上,而25 ℃和50 ℃加熱條件下,Mps的穩(wěn)定性雖然沒有在4 ℃時的穩(wěn)定性好,但保留率也能夠保持在70%以上。因此,本研究表明,Mps能夠在接近中性環(huán)境下與β-LG形成穩(wěn)定的非共價復(fù)合物,且熱穩(wěn)定性良好。

2.2.3光穩(wěn)定性分析

測定了Mps與β-LG復(fù)合前與復(fù)合后的光穩(wěn)定性,設(shè)定光照條件為600 Lux和避光,溫度為25 ℃,實驗結(jié)果如圖10。由圖10可知,在光照強度為 600 Lux 條件下,未復(fù)合的Mps在12 h內(nèi)快速降解。隨著時間的延長,在光照60 h,Mps的保留率分別下降至16.8%、22.1%、31.7%和39%,這表明Mps在光照條件下不穩(wěn)定。避光條件下未復(fù)合的Mps的保留率雖高于光照條件,但都低于復(fù)合物中Mps的保留率,說明復(fù)合物的形成可改善Mps的光不穩(wěn)定性。

圖10 不同pH值和光照條件下Mps及β-LG&Mps的穩(wěn)定性變化Fig.10 Stability of Mps and β-LG&Mps under different light conditions at different pH values

由圖10(b)、(c)、(d)可知,在pH值為6.2、7.1、8.2時,復(fù)合物中Mps在避光和光照條件下?lián)p失較少,仍具有較高的保留率。由圖10(b)、(c)、(d)可知,在光照36 h后,復(fù)合物中Mps的保留率分別提高了65%、43%和43%。對于復(fù)合物中的Mps,在pH值為6.2、7.1和8.2時,放置36 h后,保留率增大這一現(xiàn)象,可能是由于長時間放置,復(fù)合物溶液的顏色發(fā)生變化,較剛反應(yīng)時顏色偏紅;隨著pH值的升高,顏色轉(zhuǎn)變更為明顯,這可能是由于混合物中橙色素的內(nèi)酯鍵斷裂以及生色團上的共軛雙鍵發(fā)生重排導(dǎo)致的[31]。陳莎等[34]對紅曲橙、黃色素穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象,在pH值為5～9時,紅曲黃色素和紅曲橙色素的顏色較pH值為 2～4時明顯偏紅。有研究發(fā)現(xiàn),pH值大于6的環(huán)境,有助于使紅曲橙色素發(fā)生親氨反應(yīng)生成紅曲紅色素[35-36]?？傮w而言,非共價復(fù)合物的形成對Mps的光穩(wěn)定性起到了有效的保護作用。

3 結(jié) 論

本研究表明,在實驗的pH值范圍內(nèi),β-LG與Mps之間可以通過非共價相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Mps所引起的β-LG內(nèi)源熒光猝滅,證實了β-LG&Mps的形成,Mps與β-LG的相互作用使β-LG的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化,且兩者主要借助范德華力、疏水相互作用以及氫鍵進行非共價結(jié)合。與未復(fù)合的Mps相比,復(fù)合物中Mps的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性均顯著提高。本研究結(jié)果旨在為Mps穩(wěn)態(tài)化研究提供理論依據(jù),為基于β-LG的Mps產(chǎn)品在功能性食品開發(fā)中的應(yīng)用提供有益參考。后期可利用β-LG為載體,通過單因素實驗優(yōu)化形成復(fù)合物的條件,并對復(fù)合物的其他功能特性進行探究,為提高色素的生物利用度提供理論支撐。