張楠楠 周伊帆 朱燚 安明宇 鄧穎 李軍

摘要：探究銅死亡相關基因對肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的影響，并挖掘治療HCC的活性成分。通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE84402數(shù)據(jù)集，獲取肝癌差異表達基因，通過文獻檢索銅死亡相關基因，兩者取交集獲得肝癌相關銅死亡基因。進一步分析交集基因，使用UALCAN分析其差異表達，R語言分析其表達水平與臨床的相關性，Kaplan-Meier Plortter分析其預后價值，HCMDB分析其與肝癌轉移的關系，并使用THPA分析其與肝癌的病理關系。最后進行化合物預測與分子對接。結果表明，與正常組相比，銅死亡關鍵基因SLC31A1、DBT在腫瘤中表達水平下調(diào)，病理分析顯示其蛋白在HCC組織中表達增加，且與臨床相關性變量性別、腫瘤分期、淋巴結轉移顯著相關，其高表達與肝癌預后良好相關，其中SLC31A1低表達與肝癌向腎上腺、肺部轉移顯著相關。最后篩選出可能與SLC31A1、DBT結合的活性化合物，其中白藜蘆醇、葉酸對接分數(shù)高。研究認為銅死亡相關基因SLC31A1、DBT在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為HCC的診斷及治療藥物研究提供了新思路。

關鍵詞：肝細胞癌；銅死亡；SLC31A1；DBT

中圖分類號：R965.1?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2024）01-0039-12

Identification and compound screening of copper-induced cell death-related genes SLC31A1 and ‘DBT in hepatocellular carcinoma

Abstract∶This study aimed to investigate the effect of copper-induced cell death-related genes on hepatocellular carcinoma （HCC） and to explore active components for treating HCC. The GSE84402 dataset was downloaded from the Gene Expression Omnibus （GEO） database to obtain the differentially expressed genes associated with HCC， and copper-induced cell death-related genes were retrieved from past literature; the commonalities between the two were considered to obtain HCC-related copper-induced cell death genes. The genes in common were further analyzed for differential expression using the UALCAN （University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis） portal， the correlation between their expression levels and clinical levels was analyzed using the R language， prognostic value was determined using the Kaplan-Meier plotter， their relationship with HCC metastasis was examined using the Human Cancer Metastasis Database （HCMDB）， and their pathological relationship with HCC was explored using the ‘Treponema pallidum hemagglutination test. Lastly， compound prediction and molecular docking were performed. The results showed that compared with the normal group， expression levels of the key copper-induced cell death genes SLC31A1 and ‘DBT were downregulated in tumors， and pathological analysis showed that their proteins were increased in HCC tissues. In addition， these genes were significantly correlated with the clinical correlation variables of sex， tumor stage， and lymph node metastasis. Their high expression was correlated with a good HCC prognosis， whereas low expression of SLC31A1 was significantly correlated with the metastasis of HCC to the adrenal glands and lungs. Finally， the active compounds that may bind to ‘SLC31A1 ‘a(chǎn)nd ‘DBT ‘were screened， of which resveratrol and folic acid exhibited high docking scores. Hence， it could be concluded that copper-induced cell death-related genes SLC31A1 and ‘DBT play an important role in the development of HCC， and this study provides new theories for the diagnosis of HCC and therapeutic drug research.

Key words∶hepatocellular carcinoma; cuproptosis;SLC31A1; ‘DBT

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，我國新發(fā)HCC病例約占全球50%以上[1]。目前，HCC以其18% 的5年生存率成為僅次于胰腺癌的第二大致死癌癥[2]。HCC具有異質(zhì)性強、易轉移復發(fā)、預后差等特點，早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療、抗轉移復發(fā)、精準施治是改善患者生存率的關鍵。

銅死亡是一種新型的細胞死亡方式，由蛋白質(zhì)脂酰化介導且與線粒體代謝高度相關[3]。銅通過單獨或與配體結合促進血管生成，而銅螯合則抑制這一過程，這是腫瘤進展和轉移必不可少的因素[4-6]。銅直接與三羧酸循環(huán)（TCA）的脂?；煞纸Y合，導致毒性蛋白質(zhì)應激，最終導致細胞死亡[7]。細胞死亡是腫瘤研究的熱點領域，是癌癥起源和發(fā)展的基礎。

本研究通過聯(lián)合癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中的轉錄組數(shù)據(jù)和基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中HCC的基因芯片數(shù)據(jù)，篩選HCC組織與周圍正常組之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），對關鍵基因的差異表達、臨床相關性、生存分析及腫瘤轉移分析以及免疫組化等進行綜合驗證，從而對HCC的治療及預后尋找潛在靶標，并進一步發(fā)掘治療HCC的化合物活性成分并進行分子對接。本研究旨在為HCC的發(fā)病機制研究和治療提供新思路和方法，為抗癌新藥及其靶點的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從文獻中收集獲得銅死亡基因。通過下載GEO數(shù)據(jù)庫（htpp： //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中來自于分析平臺GPL570，樣本數(shù)為28個的基因表達譜芯片GSE84402數(shù)據(jù)和HCC的轉錄組數(shù)據(jù)及其相應患者的臨床信息[8-9]。使用UCSC Xena 網(wǎng)站（https：//xena.ucsc.edu/）下載TCGA數(shù)據(jù)庫其余的32種腫瘤轉錄組數(shù)據(jù)，進行基因差異表達分析、臨床相關性分析、腫瘤轉移分析及生存分析。

1.2 分析差異基因

使用R語言（3.6.3版本）limma包中的izeBetweenArrays函數(shù)，對從GEO數(shù)據(jù)庫中下載的GSE84402數(shù)據(jù)集進行數(shù)據(jù)均一化處理，繪制箱式圖。以p<0.05， fold change （|log2 ‘FC|） >1作為篩選條件。利用limma包對正常組和癌癥組進行差異分析，所獲得的DEGs使用ggplot2包和ComplexHeatmap包分別繪制火山圖和聚類熱圖。運用Venny 2.1.0在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/），獲得并保留與銅死亡相關的交集基因，并將其定為關鍵基因做進一步分析。

1.3 關鍵基因差異表達分析

以TCGA數(shù)據(jù)庫為來源，使用UALCAN在線工具（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析關鍵基因表達量在HCC組織與非癌組織中的差異并探究其臨床研究意義[10]。篩選條件：（1）TCGA分析 ；（2）檢索基因DBT、SLC31A1 ；（3）TCGA數(shù)據(jù)集HCC；（4）分析索引為表達分析；（5）統(tǒng)計學意義p<0.05。

1.4 ROC（receiver operating characteristic）分析

以TCGA數(shù)據(jù)庫為來源，通過R語言（3.6.3版本）中pROC包進行數(shù)據(jù)分析，ggplot2包繪圖，ROC曲線下的面積值在0.5～1.0之間，在模型評估指標area under the curve（SAUC）>0.5的情況下，SAUC值越接近1，說明診斷效果越好，通過ROC曲線分析以評估SLC31A1、DBT在HCC診斷上的可行性。

1.5 關鍵基因與臨床相關性分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載格式為HTSeq-FPKM的HCC（肝細胞HCC）RNAseq數(shù)據(jù)和患者的臨床信息數(shù)據(jù)，將其轉化為TPM格式進行以2為底的對數(shù)轉化后，使用R語言（3.6.3版本）中ggplot2包對關鍵基因在HCC中的表達量進行臨床相關性可視化和統(tǒng)計分析。p<0.05則結果具有統(tǒng)計學意義。

1.6 生存分析

使用Kaplan-Meier Plortter在線工具（https：//kmplot.com/）進行Kaplan-Meier曲線和log rank檢驗分析，探索其表達量與HCC患者生存時間的關系[8]。p<0.05，風險率RH>0.05表示結果具有統(tǒng)計學意義。

1.7 腫瘤轉移分析

使用HCMDB數(shù)據(jù)庫（http：//hcmdb.i-sanger.com/）對關鍵基因在HCC轉移中的沉積量進行分析，探索關鍵基因沉積量在腫瘤轉移中的變化[11]。p<0.05表示結果具有統(tǒng)計學意義。

1.8 免疫組織化學分析

通過THPA數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）獲取含有關鍵基因的正常組織與病理組織圖譜，分析對比正常組織與癌癥組織的差異[12]。

1.9 活性化合物篩選

通過內(nèi)置于 CTD 數(shù)據(jù)庫 （http：//ctdbase.org/）的 PTS 網(wǎng)絡服務器，分析與靶基因相互作用的分子結構，并進一步檢索與關鍵基因相互作用的活性化合物[9]。

1.10 分子對接

根據(jù)CTD數(shù)據(jù)庫獲得關鍵基因的活性化合物成分，通過PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.pdbus.org/）查找獲得人源蛋白的3D結構，聯(lián)合TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph）和PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 獲取關鍵基因相對應活性化合物的分子3D結構[13]，將蛋白及化合物的結構導入BIOVIA Discovery Studio （DS） 2016軟件進行分子對接，檢驗蛋白與活性成分的親和性。

1.11 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞（HepG2，購自中國科學院上海細胞庫，編號SCSP-510），在含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素混合物的低糖DMEM培養(yǎng)液（gibico，批號8123299）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%～90%時，分別以0、50、100、200 μmol/L的葉酸（MedChemExpress，貨號HY-6637）處理細胞24 h后，每孔加入60 μL含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Solarbio，貨號R000）提取細胞中的蛋白。

1.12 蛋白免疫印跡

提取HepG2細胞中的蛋白進行蛋白免疫印跡（western blot，WB）分析。使用 BCA蛋白檢測試劑盒（Solarbio， 貨號PC0020，規(guī)格500微孔）定量后，用SDS-PAGE 凝膠（Solarbio，貨號P1200-1/P1200-2）分離出等量的蛋白質(zhì)，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶阻斷膜2 h，DBT抗體（Bioswamp，#PAB48456）和Anti-beta Actin Rabbit mAb（PTM BIO，#PTM-5436）孵育過夜，再用山羊抗兔IgG（H&L）-HRP（Bioworld，#bs13278）孵育2 h，而后使用ECL試劑盒（Millipore，批號2201215）進行顯影，最后通過Image Lab軟件分析WB條帶的灰度值，將目標蛋白與β-actin的灰度值比對進行蛋白的定性及半定量分析。

1.13 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)來自3次重復實驗，數(shù)據(jù)分析和圖片制作通過 SPSS 25.0 和 GraphPad Prism 9.0 軟件進行。數(shù)據(jù)以x[TX-*4]±s表示，多組間比較當滿足正態(tài)及方差齊性時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD；兩組間比較當滿足正態(tài)時，采用獨立樣本t檢驗分析；以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC相關銅死亡差異基因篩選

通過limma包的數(shù)據(jù)處理分析結果顯示，26個樣本數(shù)據(jù)的中位數(shù)基本處于一條直線上，表明數(shù)據(jù)集質(zhì)量可靠、樣本歸一化程度好，如圖1（a）所示，可對HCC組和相應的非癌組中的DEGs進行下一步分析。將GSE84402芯片中的14例HCC組設為實驗組，14例非癌組織設為對照組，對其數(shù)據(jù)進行分析。以閾值為|log2 ‘FC|>1和p<0.05作為初步篩選條件，通過火山圖可直觀地觀察到總體差異基因的分布情況，其中紅色小點代表上調(diào)基因，藍色小點代表下調(diào)基因（圖1（b））；再對其進行聚類分析（圖1（d））；圖中藍色小塊代表下調(diào)基因，紅色小塊代表上調(diào)基因，方塊顏色越深表示差異表達的倍數(shù)越高。運用Venny 2.1.0在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/），獲得2個交集基因（圖1（c）），分別為SLC31A1、DBT。

2.2 關鍵基因差異表達分析

使用UALCAN在線工具以交集基因SLC31A1和DBT為關鍵基因，進行差異表達分析。其結果見圖2，與正常組相比，關鍵基因SLC31A1和DBT在HCC腫瘤中均顯著下調(diào)。

2.3 ROC分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫，用R語言中的pROC包進行ROC分析，ROC曲線下的面積值在0.5～1.0之間，在SAUC＞0.5的情況下，SAUC越接近于1，說明診斷效果越好。SAUC在 0.5～0.7時有較低準確性，SAUC在0.7～0.9時有一定準確性，SAUC在0.9以上時有較高準確性。SAUC＝0.5時，說明診斷方法無診斷價值。根據(jù)圖3可知，SLC31A1對應的SAUC=0.685，DBT對應的SAUC=0.694，SAUC值均高于0.5，說明SLC31A1、DBT對HCC的診斷價值有準確性。

2.4 臨床相關性分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫探索SLC31A1、DBT在HCC患者不同亞型中的表達與性別、淋巴結轉移狀態(tài)和癌癥分期間的關聯(lián)，性別分析如圖4（a）所示，與正常組相比，SLC31A1和DBT在男性和女性患者腫瘤中表達均顯著下調(diào)；N分期是腫瘤-結節(jié)-轉移（TNM）分期系統(tǒng)中的重點分期，N分期系統(tǒng)有5個階段，包括NX、N0、N1、N2和N3。N的后綴代表淋巴結轉移的程度。NX表示不能評估區(qū)域淋巴結；N0表示沒有區(qū)域淋巴結轉移，N1～N3表示區(qū)域淋巴結受累程度逐漸遞增。淋巴節(jié)轉移分析如圖4（b）所示，SLC31A1和DBT與正常組相比，N0組顯著降低（p<0.001），N1組顯著降低不明顯，表明SLC31A1、DBT和局部淋巴結受累關系均不明顯。腫瘤分期分析如圖4（c）所示，與正常組相比，SLC31A1和DBT在I、II、III期患者腫瘤中的表達均顯著下調(diào)。

2.5 預后分析

將2個關鍵基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中進行5年生存預后分析，紅色線條代表基因高表達的生存情況，黑色線條代表低表達的生存情況，縱坐標根據(jù)基因表達的高低，分為高、低表達組，數(shù)值代表隨時間變化存活的患者例數(shù)，為風險數(shù)字表，橫坐標代表生存時間，OS表示總生存期，PFS表示無進展生存期，其結果如圖5所示，關鍵基因p值均小于 0.05，RH>0.05表示統(tǒng)計值具有意義，SLC31A1、DBT高表達說明HCC預后良好。

2.6 腫瘤轉移分析

通過HCMDB數(shù)據(jù)庫分析在HCC腫瘤轉移中關鍵基因SLC31A1、DBT沉積量的表達，觀察到SLC31A1的沉積量在腎上腺和肺部的轉移中表達量均具有統(tǒng)計意義，見圖6（a），但DBT轉錄物在腎上腺、肺部、淋巴結轉移中統(tǒng)計差異不顯著，見圖6（b）。

2.7 病理分析

通過The human protein atlas project數(shù)據(jù)庫比較人類正常組織和癌癥組織之間不同蛋白質(zhì)的表達，結果如圖7所示，結果表明SLC31A1在肝癌組織中的表達低于正常肝組織。但DBT未在正常肝組織中探測到，在肝癌組織中表達量低。

2.8 分子對接和活性化合物篩選

根據(jù)CTD數(shù)據(jù)庫獲得SLC31A1、DBT相對應的活性化合物成分，所獲化合物主要成分見表1，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。聯(lián)合TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫篩選并獲得SLC31A1、DBT相對應化合物的2D結構，并從PDB數(shù)據(jù)庫中下載上述關鍵基因編碼的蛋白結構，再使用BIOVIA Discovery Studio （DS） 2016進行分子對接，SLC31A1與所篩選藥物無法對接，DBT與葉酸和白藜蘆醇均能對接，結果見表2，其中對接效果最好的小分子化合物為葉酸（對接分數(shù)134.542，圖8）。

2.9 Western Blot

采用 WB 檢測蛋白表達情況，實驗結果如圖9所示。與未給藥干預組相比，HepG2細胞在50和100 μmol/L葉酸的干預下，DBT蛋白表達無明顯變化，但在200 μmol/L葉酸干預下，DBT蛋白表達升高（p＜0.005）。

3 討論

據(jù)國際癌癥研究機構估計，2018年HCC患者超過841 080例[1]?；颊叩幕疾÷逝c發(fā)病率密切相關，這反映其具有典型的晚期表現(xiàn)、有限的治療選擇、侵襲性和極差的總體生存率[14]。癌癥治療成本較高，治療費用可能隨著越來越多的病人接受肝移植而上升[14-15]。因此，探索診斷HCC的腫瘤標志物與治療HCC的藥物靶標關重要。

銅死亡取決于細胞中銅的積累，是一種獨特的細胞死亡途徑。研究表明[4-6]，與正常組相比，許多惡性腫瘤中的銅含量更高，尤其在乳腺癌、肺癌、胃癌等不同癌癥患者的血清和腫瘤中，都發(fā)現(xiàn)了銅水平的高表達。同時，銅的積累與增殖和生長、血管生成和轉移有關[16]。銅離子載體（如Elesclomol）是銅離子的小分子轉運蛋白，可以探索銅離子細胞毒性機制。銅水平的穩(wěn)定在各生理過程中至關重要，細胞內(nèi)銅的生物利用度失調(diào)可誘發(fā)氧化應激和細胞毒性[17]。因為腫瘤的生長和轉移對這種金屬營養(yǎng)的要求更高。除此之外，銅除了作為活動性位點代謝輔助因子外，也是一種動態(tài)信號金屬和金屬變異體調(diào)節(jié)因子[18]，其在脂肪分解中依賴銅的磷酸二酯酶3B（PDE3B），在細胞生長和增殖中依賴絲裂原激活蛋白激酶激酶1（MEK1）和MEK2以及在自噬中依賴激酶ULK1和ULK2。

本研究首先通過 GEO 數(shù)據(jù)庫獲得HCC及周圍正常組基因芯片數(shù)據(jù)集 GSE84402，對非癌組織和HCC組織進行 DEGs 分析。將DEGs與已知的銅死亡基因取交集，獲得兩個重疊基因SLC31A1、DBT，并將其鎖定為進一步研究的關鍵基因。為了進一步明確SLC31A1、DBT在HCC中的臨床意義，本研究對SLC31A1、DBT在HCC中的差異表達水平與臨床分期、ROC、預后、腫瘤轉移、免疫組化的相關性進行分析，并進一步挖掘SLC31A1、DBT相對應的活性化合物。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結果表明，SLC31A1和DBT基因在HCC中顯著低表達，這提示SLC31A1、DBT的低表達可能促進HCC的發(fā)展進程。ROC分析結果表明， SLC31A1和DBT對HCC的診斷具有一定的準確性。為了進一步驗證SLC31A1和DBT與HCC的相關性，進行了臨床相關性分析，性別和癌癥分期分析結果表明， SLC31A1和DBT的表達下調(diào)可能是HCC發(fā)生進展的重要影響因素；淋巴結轉移分析表明，SLC31A1和DBT與淋巴結轉移相關性不顯著。Kaplan-Meier Plortter數(shù)據(jù)庫mRNA RNA-seq預后分析結果顯示，SLC31A1和DBT的擴增狀態(tài)影響HCC的預后狀態(tài)。HCMDB數(shù)據(jù)庫分析結果表明，SLC31A1轉錄物在肝腫瘤轉移至腎上腺、肺臟中存在差異表達，但DBT在肝腫瘤至腎上腺、肺部、淋巴結轉移中表達量無顯著差異，這提示在腫瘤轉移過程中SLC31A1的差異表達有作為預測因子的潛在可能。THPA數(shù)據(jù)庫免疫組化分析結果顯示SLC31A1在HCC病理組織中低表達，提示其在HCC中的表達下調(diào)可能標志著HCC的發(fā)生。

通過上述分析，驗證銅死亡基因SLC31A1和DBT是影響肝癌進展的重要因子，進一步通過CTD數(shù)據(jù)、TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem挖掘SLC31A1和DBT相對應的活性化合物，其中分子對接最佳化合物為葉酸和白藜蘆醇，對接分數(shù)分別為134.542和79.635 5。WB實驗驗證結果表明，200 μmol/L葉酸干預下的HepG2細胞中DBT的蛋白表達量增加，其在HCC中表達的下調(diào)可能標志著HCC的發(fā)生，這提示DBT有作為HCC預測因子及治療靶標的潛在可能。白藜蘆醇是一種多酚有機化合物，不僅可抑制HEPG2細胞增殖，還通過抑制G1期和G2/M期的細胞周期從而抑制肝細胞生長進而導致細胞凋亡[19]。此外，白藜蘆醇通過抑制活性氧的產(chǎn)生，并增加NOS的活性和NO生產(chǎn)來調(diào)節(jié)NO/NOS系統(tǒng)[18]。已有研究表明，白藜蘆醇可以通過激活p53，而抑制PI3K/AKT信號傳導途徑，從而導致beclin 1表達并抑制HCC細胞的增殖，侵襲和遷移[20]。白藜蘆醇使有氧糖酵解的HCC細胞凋亡，糖酵解抑制劑可減輕這種效應[21]。白藜蘆醇誘導線粒體凋亡與HCC細胞HK2表達的降低有關[21]。此外，白藜蘆醇增強了索拉非尼誘導的有氧糖酵解HCC細胞生長抑制作用。這兩種試劑聯(lián)合治療可抑制HCC小鼠的生長并促進其凋亡[21]。研究表明，葉酸在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，葉酸修飾的TPGS-FA可作為NCet等藥物的有效載體，并有望成為治療HCC的一種有效、安全的藥物[22-23]。實驗研究表明，將葉酸摻入HKUST-1可使銅離子緩慢釋放，從而降低細胞毒性，增強細胞體外遷移[24]。

SLC31A1、DBT是與銅死亡相關的基因，研究發(fā)現(xiàn)銅可通過單獨或與配體結合促進血管生成從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉移[16]。銅參與多種細胞過程，包括線粒體呼吸、抗氧化劑防御、氧化還原信號、激酶信號、自噬和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制[17]。銅過量易導致細胞毒性，在生理濃度下細胞對銅離子的敏感性更高，各種金屬離子能以獨立的凋亡方式引發(fā)細胞死亡，如磷脂過氧化引發(fā)的鐵中毒[14，17]。銅可被溶質(zhì)載體家族31號成員1基因跨膜銅轉運蛋白SLC31A1吸收，再由超氧化物歧化酶（CCS）的銅伴侶傳遞給SOD1，發(fā)揮抗氧化作用[17，25]。SLC31A1是主要的銅流入轉運體，其表達的變化能夠誘發(fā)細胞銅積累的改變，而降低SLC31A1的表達可以抑制癌細胞的增殖[26-28]。因此，SLC31A1是癌癥診斷和治療值得注意的基因。DBT是哺乳動物激酶CKIε和CKIδ的同源激酶[29]，也是時鐘基因之一，參與許多不同的功能，包括晝夜節(jié)律、平面細胞極性、程序性細胞死亡和生長等。DBT通過阻滯G2/M期細胞并誘導細胞死亡來抑制HepG2細胞的增殖[30]。因此，葉酸與白藜蘆醇可能通過促進DBT的表達，從而促進肝癌細胞的銅離子的釋放，降低SLC31A1的表達抑制癌細胞的增殖。

本研究為進一步了解銅死亡相關基因SLC31A1、DBT與HCC進程的相關性提供了初步依據(jù)，同時進行了與之對應的活性成分篩選，為HCC提供了新的診療思路，但其具體的生物學作用及機制還需進一步實驗驗證。

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