謝澤慧，劉琳，，毛斌，郭亞榮，田琦民，馬曉玲，*

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,蘭州 730000)

成骨發(fā)育不全(osteogenesis imperfecta,OI)又稱脆骨病-藍(lán)鞏膜-耳聾綜合征,是由于編碼Ⅰ型膠原蛋白的基因發(fā)生突變從而導(dǎo)致的廣泛性結(jié)締組織疾病[1-3],是一種以骨骼發(fā)育不全和骨脆性增加為主要特點的單基因遺傳病[4],發(fā)病率約為1/15 000～1/20 000[5],是嚴(yán)重影響新生兒健康的出生缺陷疾病之一。有85%～90%的OI病例為常染色體顯性遺傳[5]。近年來隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,研究者們發(fā)現(xiàn)了19種導(dǎo)致OI的致病基因,其中常染色體隱性遺傳基因12種(SERPINF1、CRTAP、P3H1、PPIB、SERPlNH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、WNT1、CREB3L1、PLOD2、P4HB、SEC24D、SPARC等)[6]。SERPINFI突變型OI的特征表現(xiàn)為輕微外力下的反復(fù)骨折、長骨屈曲畸形、骨質(zhì)發(fā)育不良等[6],隨著疾病進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展,可能導(dǎo)致患者脊柱后、側(cè)凸及四肢嚴(yán)重畸形[7],除此之外,還有藍(lán)色鞏膜、牙質(zhì)發(fā)育不全和聽力損失等骨外表現(xiàn)[8]。

1979年,Sillence等[9]根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征和遺傳模式將OI分為Ⅰ～Ⅳ型,之后的研究者們又根據(jù)OI的致病機(jī)制及基因的不同將OI的分型擴(kuò)展為16型[10]。其中,SERPINF1基因編碼的色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性、影響骨骼礦化,PEDF水平低下會導(dǎo)致骨礦化不足和礦化時間延長[11],這一類OI在分類上被歸為Ⅵ型。Ⅵ型OI往往于兒童期發(fā)病,存在中至重度骨骼畸形[12],可見類骨、“魚鱗樣”板層骨的外觀[13],伴或不伴有藍(lán)色鞏膜,光鏡下可見骨質(zhì)魚鱗樣結(jié)構(gòu)伴礦化延遲,嚴(yán)重程度介乎于I型(輕型)和Ⅲ型(存活患者中最嚴(yán)重類型)之間[14-17]。目前廣為認(rèn)可的治療OI患者最有效的藥物是雙磷酸鹽(bisphosphonates,BPs)[18],可以增加骨密度、降低骨折率、有效改善患者生存質(zhì)量,但是該類藥物無法改善骨礦化不足,對Ⅵ型OI的治療效果不佳[19]。近年來研究顯示,RANKL抗體狄諾塞麥、骨硬化素單抗(Scl-Ab)和轉(zhuǎn)化生長因子β中和抗體等新型藥物對于Ⅵ型OI有著良好的治療前景[20]。

本文針對1例SERPINF1基因同義突變導(dǎo)致的Ⅵ型OI家系進(jìn)行全外顯子組基因測序,明確該家系的致病基因,分析其基因型、致病模式和基因型-表型相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對象

1.家系來源:該OI家系由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心采集,包括先證者、同胞弟弟和父親,母親因去世未能采集。血樣以及臨床資料的收集均符合知情同意原則。本項研究已通過蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號為LDYYSZLL2023-17)。

2.試劑及儀器:核酸純化試劑盒(Agencourt Ampure XP-Medium kit)、RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自深圳華大基因;Agilent 2100 Bioanalyzer分析儀(Agilent DNA 1000 Reagents,安捷倫,美國)、熒光定量儀(Qubit Fluorometer,BMG Labtech,德國)、MGISEQ-2000測序平臺(PE100/PE150,武漢華大智造科技有限公司)。

二、DNA提取和全外顯子測序

在進(jìn)行助孕前遺傳咨詢時,建議患者及其父母、弟妹接受基因檢測,經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查并取得患者同意后,對患者、患者父親和患者弟弟各采外周血2 ml,樣本送交深圳華大基因檢測中心測序。從受檢者血液中提取基因組DNA,并打斷制備文庫,然后通過Roche KAPA HyperExome芯片對目標(biāo)基因外顯子及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集,最后使用MGISEQ-2000測序平臺進(jìn)行變異檢測(測序數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)為:目標(biāo)區(qū)域平均測序深度≥180×,其中目標(biāo)區(qū)平均深度>20×的位點所占比例>95%)。測序片段通過BWA與UCSC hg19人類參考基因組進(jìn)行比對,去除重復(fù)。使用GAT進(jìn)行堿基質(zhì)量值校正SNV、INDEL和基因型檢測。使用ExomeDepth進(jìn)行外顯子水平的拷貝數(shù)變異檢測。測序由深圳華大基因檢測中心完成。

三、Sanger測序驗證

使用公共數(shù)據(jù)庫信息,查詢NCBI、UCSC或Ensembl數(shù)據(jù)庫上待測基因的序列信息,確定待測基因在染色體上的定位和編碼區(qū)大小,然后使用Primer軟件對其目標(biāo)區(qū)域的外顯子編碼區(qū)及其側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計,在引物設(shè)計完成以后使用在線的電子PCR模擬進(jìn)行特異性檢測和驗證,PCR擴(kuò)增體系使用2×TaqMastermix擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后使用瓊脂糖凝膠電泳,測序完成后使用DNAstar軟件中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果與參照序列進(jìn)行比對,分析測序結(jié)果。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物信息詳見表1。

表1 引物序列、退火溫度及擴(kuò)增產(chǎn)物信息

結(jié) 果

一、病例資料分析

患者,女,34歲,疑似患有先天性成骨不全,2021年求助于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心希望通過輔助生殖技術(shù)生育1名健康后代。該患者身高1.2米,體重50 kg,結(jié)婚5年,婚前與前任因個人因素流產(chǎn)1次,婚后工具避孕2年,后未避孕未孕3年。自述3歲前無明顯表型,3～15歲期間易發(fā)骨折,尤其近肢易發(fā),多次行手術(shù)治療,15歲后易發(fā)骨折癥狀消失至今,可蹲距行走,但近5年行動受限,出行需依靠輪椅。患者站立困難,查體見三角臉,脊柱側(cè)彎畸形,胸廓前凸,無智力障礙。該患者雖曾存在多發(fā)易發(fā)骨折情況,且體格檢查可見站立困難、脊柱側(cè)彎畸形等與OI高度符合的臨床癥狀,但患者未進(jìn)行過完整的臨床評估及基因檢測來確診OI。患者母親早年因疾病去世(非相關(guān)疾病),父親體健,其弟弟具有相似臨床表現(xiàn),妹妹體健且婚后育有1健康男嬰,否認(rèn)家族近親結(jié)婚史、家族遺傳病史及致畸因素接觸史?；颊哂?021年8月在我院行子宮輸卵管造影示:左側(cè)輸卵管通而欠暢,右側(cè)輸卵管通而不暢,盆腔輕度粘連。其丈夫2021年6月于我院行精液常規(guī)檢查示:精子濃度8.97×106/ml,前向運(yùn)動精子21%,形態(tài)正常精子百分?jǐn)?shù)1.35%,精子DNA碎片指數(shù)5.72%。

生殖中心經(jīng)過綜合評估后建議患者夫婦放棄妊娠,但患者及其家屬因生育需求強(qiáng)烈要求輔助生殖助孕,于是充分告知患者輔助生殖技術(shù)失敗風(fēng)險及成功妊娠后對母兒可能造成的不良后果等?；颊呒捌浼覍俦硎境浞种橥?愿意承擔(dān)妊娠及分娩的一切相關(guān)風(fēng)險及責(zé)任,并簽署知情同意書。

二、影像學(xué)結(jié)果分析

先證者全脊柱正側(cè)位片及胸部X光片顯示其有明顯胸廓畸形,雙側(cè)胸廓不對稱,呈現(xiàn)左低右高改變,氣管、縱膈左移,上縱膈增寬,肋骨走形扭曲,脊柱生理弧度消失,胸段向后突出,明顯向左側(cè)彎,椎體骨質(zhì)邊緣欠光整。骨盆不對稱,雙側(cè)股骨干側(cè)彎,雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)未見明顯異常,雙側(cè)股骨上段及股骨頭形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常(圖1)。

A:側(cè)面,脊柱胸段向后突出;B:正面,胸段明顯向左側(cè)彎;C:胸廓呈左低右高改變;D:骨盆不對稱,雙側(cè)股骨干側(cè)彎。圖1 先證者的影像學(xué)檢查結(jié)果

三、全外顯子組測序結(jié)果

基因檢測結(jié)果顯示:先證者及其弟弟在SERPINF1基因上chr17:1678494(NM_002615.5)位點發(fā)生了突變c.786G>A,此突變并未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變p.Lys262Lys,故該突變?yōu)橥x突變。目前沒有該變異致病性的相關(guān)報道,根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南(附錄),該變異被判斷為意義未明變異。先證者及其弟弟基因型為純合突變,其父親為該致病基因的雜合攜帶者,根據(jù)該基因常染色體隱性遺傳的遺傳模式推測其過世的母親亦為該基因的雜合攜帶者,患者丈夫基因檢測結(jié)果正常。家系圖如圖2所示。

圖2 家系圖(Ⅱ-2為先證者)

利用ESP數(shù)據(jù)庫(http://olap.epsnet.com.cn/guidedetail1.html)、千人數(shù)據(jù)庫(https://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/data_collections/1000_genomes_project/data/)、EXAC數(shù)據(jù)庫(http://exac.broadinstitute.org)檢索發(fā)現(xiàn)該突變?yōu)檎φ杖巳褐形窗l(fā)現(xiàn)的變異(或隱性遺傳病中極低頻位點),通過保守性預(yù)測、進(jìn)化預(yù)測、剪接位點影響等多種統(tǒng)計方法預(yù)測出該變異會對基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響。

四、Sanger測序結(jié)果

為檢測c.786G>A位點對RNA剪切的影響,并明確先證者的助孕策略,提取先證者夫妻的RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后,利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,Sanger測序后將測序結(jié)果使用DNAstar軟件中的SeqMan程序比對參照序列。通過和參照序列比對可以看出先證者(Ⅱ-2)和其弟弟(Ⅱ-3)在SERPINF1基因上的NM_002615.5序列發(fā)生了c.786G>A的純合突變,其父親(I-1)在此處為雜合突變,但是均未導(dǎo)致該處賴氨酸的改變,屬于同義突變。而表型正常的先證者丈夫在此處并未發(fā)生改變(圖3)。

圖3 SERPINF1位點的Sanger測序峰圖[由上至下分別為先證者(Ⅱ-2)、其父(Ⅰ-1)、其弟(Ⅱ-3)、其丈夫(Ⅱ-1)]

五、輔助生殖結(jié)果

患者為該致病基因的純合攜帶者,其丈夫不攜帶該致病基因,因此夫妻雙方的子女必定為該致病基因攜帶者但不發(fā)病,因此在綜合評估該患者情況后認(rèn)為無需進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic testing,PGT),最后確定使用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)方法為其助孕。結(jié)合患者夫妻各項情況后使用拮抗劑方案促排卵,取卵11枚,獲得可移植胚胎3枚,全胚冷凍保存。2022年1月激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜后移植凍融胚胎1枚未孕,1個月后再次移植凍融胚胎1枚,患者成功懷孕,之后隨訪患者宮內(nèi)單胎妊娠,孕34+2周于本院剖宮產(chǎn)1女,女兒體健。

討 論

自2002年Ⅵ型OI首次被報道[21]以來,該類型疾病受到了更多的關(guān)注。近年來隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展,遺傳基因突變的檢測和對其編碼蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的預(yù)測等技術(shù)逐漸成熟,對于Ⅵ型OI的基因診斷也步入了新階段。本文報道了1例由于SERPINFI基因chr17:1678494(NM_002615.5)發(fā)生同義突變導(dǎo)致OI的家系,該突變位點此前從未被報道過,通過對該位點致病的研究,分析其對機(jī)體相關(guān)組織結(jié)構(gòu)和功能的影響,預(yù)測其致病性,豐富了Ⅵ型OI的表型。

OI是一種由于基因突變導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白發(fā)生含量或結(jié)構(gòu)改變[22]所引起的一種單基因遺傳疾病,主要特點為骨量減少和骨骼脆性增加,常表現(xiàn)為反復(fù)輕微外力下骨折和骨骼畸形[23]。OI多數(shù)表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳[6],近年來常染色體隱性遺傳和X染色體遺傳等遺傳模式也被報道[22]。本文中導(dǎo)致先證者及家系致病的基因SERPINF1即為常染色體隱性遺傳模式,該基因位于染色體17p13.3,它與OI常見致病基因COL1AI和COL1A2影響成骨細(xì)胞的膠原形成和分化不同,而是會增加骨吸收。SERPINF1基因編碼PEDF蛋白,該蛋白通過RANK-RANKL-OPG途徑上調(diào)骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)的表達(dá),通過阻斷RANKL來抑制破骨細(xì)胞成熟;當(dāng)SERPINF1基因突變時,由于RANK-RANKL-OPG途徑的錯誤調(diào)節(jié),破骨細(xì)胞分化與激活增加,導(dǎo)致PEDF含量下降,OPG濃度降低,破骨細(xì)胞數(shù)目增加,骨骼礦化不足,骨降解增加,從而導(dǎo)致了Ⅵ型OI的發(fā)生[24]。Ⅵ型OI患者的骨骼脆性及畸形程度從生活質(zhì)量不受影響到嚴(yán)重身體機(jī)能不全不等[25],患者通常沒有圍產(chǎn)期骨折,第1次骨折一般發(fā)生在出生后4～18個月,之后的骨折頻率和嚴(yán)重程度是循序漸進(jìn)的,多不伴有藍(lán)色鞏膜、聽力障礙和牙質(zhì)發(fā)育不全等骨骼外表現(xiàn)。這使得RANKL抗體狄諾塞麥獲批用于成人的骨質(zhì)疏松癥,并且對于SERPINF1基因突變引起的兒童Ⅵ型OI也有較好作用。

在該家系中,先證者和其弟弟SERPINF1基因純合突變,幼時曾反復(fù)骨折,成年后有站立困難、脊柱側(cè)彎畸形和胸廓前凸等典型臨床癥狀,其父親為該突變的雜合子攜帶者;根據(jù)該基因的遺傳模式推測先證者已過世的母親同為該突變雜合子攜帶者,通過該家系的遺傳模式和臨床發(fā)病情況分析,我們認(rèn)為這種基因突變是致病的,可能導(dǎo)致中重度的Ⅵ型OI。

本研究在該家系中發(fā)現(xiàn)了兩名由于SERPINF1基因突變導(dǎo)致的Ⅵ型OI患者及1名雜合攜帶者,此突變?yōu)橐粋€從未被報道的新突變,在任何公開數(shù)據(jù)庫中未能檢索到該突變的報道。對該家系進(jìn)行了基因檢測和分析,由于該先證者求助于我們生育健康后代,根據(jù)基因測序結(jié)果為她提供遺傳咨詢和助孕建議,最終先證者生育了1名推測攜帶該變異基因但是并不發(fā)病的健康女嬰;要讓該突變基因在此家系中完全阻斷,這名女嬰在未來的生育中仍然需要進(jìn)一步遺傳咨詢和干預(yù)。

本文對于此家系的研究仍然存在一定局限性,首先,我們并未取得先證者母親的血樣,沒有對包括先證者祖父母在內(nèi)的所有家族成員進(jìn)行基因測試,無法繪制出完整的遺傳模式圖;另外,我們暫時沒有對該新發(fā)突變進(jìn)行功能驗證和進(jìn)一步實驗研究;此外,Ⅵ型OI在全球的報道病例十分稀少[26],因此無法嚴(yán)格確定其基因型-表型的相關(guān)性,該基因突變對于臨床表現(xiàn)的影響無法嚴(yán)格界定。本病例的結(jié)論并不具有完全的代表性,但是該病例的報道也進(jìn)一步補(bǔ)充了該類疾病的變異位點和臨床表型等資料。該基因突變的致病性分類為“意義未明變異”。因此在未來的研究中,不論是功能試驗、家系研究還是動物模型的建立,都需要更深一步探索該基因突變的意義和致病性。

綜上,本文報道了1例純合SERPINF1基因c.786G>A(p.Lys262Lys)突變的患者通過輔助生殖技術(shù)成功妊娠的臨床資料以及她的家系資料,該突變?yōu)橥x突變,同義突變既往常常被認(rèn)為是不致病的,但近年來的研究顯示其可能具有致病性,在未來的單基因遺傳病研究中需要被重視。本文豐富了OI的表型,補(bǔ)充了人類SERPINF1基因的突變數(shù)據(jù)庫,為進(jìn)一步研究Ⅵ型OI的基因型-表型相關(guān)性和未來對于此疾病的遺傳咨詢等提供了新的依據(jù)。