賈洪燕，崔毓桂

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,南京 210029;2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬連云港市婦幼保健院,連云港 222000)

卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂及成熟過程中需要大量的能量,并為受精、早期胚胎發(fā)育積累大量能量,糖代謝是能量來源的一方面,而脂肪是其重要的能量儲(chǔ)存物質(zhì)[1]。一分子軟脂酸氧化可產(chǎn)生105個(gè)三磷酸腺苷(ATP),而一分子葡萄糖大約為31個(gè)ATP,因而認(rèn)為脂肪酸β氧化是卵母細(xì)胞成熟過程中重要的能量來源[2]。研究顯示,抑制脂肪酸β氧化則阻礙卵母細(xì)胞及早期胚胎的發(fā)育;促進(jìn)脂肪酸β氧化則提高卵母細(xì)胞成熟率及早期胚胎的發(fā)育[3]。也有研究表明,高脂飲食的肥胖小鼠模型,其內(nèi)分泌紊亂、卵巢儲(chǔ)備減少,卵母細(xì)胞內(nèi)高脂累積導(dǎo)致氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激升高,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙和胚胎發(fā)育潛能低下[4]?？梢?脂肪酸及脂肪酸穩(wěn)態(tài)對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的重要性。脂代謝在不同細(xì)胞中具有不同的作用,在免疫細(xì)胞中,脂代謝及其中間產(chǎn)物促進(jìn)組蛋白乙?；?并通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)多種淋巴細(xì)胞群的功能,在抗腫瘤和抗病毒感染中起免疫保護(hù)作用[5]。脂代謝對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟作用的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制是生殖生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。本文綜述卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中的脂代謝及其研究進(jìn)展,為不孕癥女性和高齡女性的個(gè)體化輔助生殖治療提供理論支持。

一、脂代謝的特征

脂質(zhì)是種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一類大分子物質(zhì)。人體的脂質(zhì)以甘油三酯的形式儲(chǔ)存,在多種生物功能中發(fā)揮重要作用,包括生物膜構(gòu)建、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、類固醇前體產(chǎn)生和代謝,也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源。脂質(zhì)分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,常見的飽和脂肪酸有棕櫚酸、硬脂酸、豆蔻酸等,常見的不飽和脂肪酸有亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸等[6]。

體內(nèi)多余的脂肪以甘油三酯的形式儲(chǔ)存,甘油三酯是機(jī)體重要的儲(chǔ)能及供能物質(zhì),當(dāng)脂肪動(dòng)員時(shí),甘油三酯分解成甘油和脂肪酸,脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化供能,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)以合成與分解平衡維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。脂肪動(dòng)員時(shí),長鏈脂肪酸在胞質(zhì)活化后經(jīng)肉堿協(xié)助進(jìn)入線粒體基質(zhì)中進(jìn)行β氧化產(chǎn)生ATP[7]。中短鏈脂肪酸可以直接進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化。除了供能,脂質(zhì)膽固醇是機(jī)體細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分,也是重要生物學(xué)功能的固醇化物如類固醇、膽汁酸、維生素D的前體[8]。

磷脂也是重要的生物膜組成成分,并且是機(jī)體很多重要信號(hào)通路的信號(hào)分子,也是重要的第二信使前體,如產(chǎn)生第二信使二酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸和花生四烯酸[9],這些第二信使促發(fā)多種信號(hào)通路的激活。

二、脂代謝在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的作用

人血清中的脂質(zhì)與卵泡液中的脂質(zhì)含量具有顯著相關(guān)性,尤其是膽固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸、載脂蛋白A1、肉堿,當(dāng)人體發(fā)生代謝紊亂時(shí),卵泡液中的代謝物成分也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[10]。例如,肉堿通過限速酶——肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT1)協(xié)助長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化,是長鏈脂肪酸β氧化的激動(dòng)劑。對(duì)體外受精(IVF)患者的卵泡液、卵丘細(xì)胞及卵母細(xì)胞檢測(cè),發(fā)現(xiàn)卵泡液中肉堿含量與IVF結(jié)局沒有關(guān)系;肉堿合成酶在卵母細(xì)胞中表達(dá)很低,在卵丘細(xì)胞中表達(dá)很高;CPT及參與脂肪酸β氧化的部分酶在卵母細(xì)胞中高表達(dá),也有參與脂肪酸β氧化的部分酶在卵丘細(xì)胞高表達(dá)[11]。

卵丘細(xì)胞中富集多種脂肪酸代謝相關(guān)的基因,可以調(diào)節(jié)卵泡液及卵母細(xì)胞中脂滴數(shù)量,保證卵母細(xì)胞有足夠的脂肪酸進(jìn)行β氧化,為減數(shù)分裂提供能量。當(dāng)卵泡液中脂肪酸濃度升高時(shí),過多的脂肪酸積聚在卵丘細(xì)胞中,避免了卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的過度累積。當(dāng)卵丘細(xì)胞失代償時(shí),卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過多,遭受脂毒性[12]。卵母細(xì)胞則通過卵丘細(xì)胞從卵泡液里獲得脂肪酸;卵泡液中脂肪酸含量過高或過低,對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎的早期發(fā)育均不利。與顆粒細(xì)胞相比,哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞線粒體一般比較圓,線粒體內(nèi)膜光滑,嵴較少,數(shù)量多,且卵母細(xì)胞和早期胚胎中線粒體mtDNA拷貝數(shù)很高,甲基化程度比顆粒細(xì)胞低[13]。這種形態(tài)提示卵母細(xì)胞和早期胚胎處于較低的能量代謝活動(dòng),維持較低水平的電子傳遞鏈以有效地滿足自身能量的需求,同時(shí)最低量產(chǎn)能可以減低與氧化磷酸化相關(guān)的活性氧(ROS)的形成,即所謂的安靜胚胎假說[14]。

研究發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞從生發(fā)泡(GV期)至第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ期)脂肪酸β氧化相關(guān)代謝物(如左旋肉堿、棕櫚酰左旋肉堿)逐漸增多,提示脂肪酸分解供能增多[15],也說明脂肪酸β氧化在卵母細(xì)胞成熟過程中具有重要作用,并為受精后的胚胎發(fā)育提供能量儲(chǔ)備。一些脂質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟的重要調(diào)控因子。脂肪酸β氧化對(duì)卵母細(xì)胞核成熟至關(guān)重要[16]。卵母細(xì)胞的能量代謝依賴線粒體,而受精卵的線粒體全部來自卵母細(xì)胞,所以,卵母細(xì)胞的能量代謝影響胚胎的代謝,也可能影響下一代的能量代謝。

通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,胚胎2細(xì)胞期有更多的蛋氨酸、多胺、谷胱甘肽的代謝,囊胚期具有更高的與線粒體三羧酸循環(huán)相關(guān)的代謝產(chǎn)物,說明隨著胚胎的發(fā)育,能量需求逐漸增高[17]。卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎耗氧量低于桑葚胚和囊胚,當(dāng)胚胎發(fā)育至桑葚胚和囊胚時(shí),除了糖類供能,脂肪酸氧化(FAO)也可塑性地提供能量滿足胚胎發(fā)育的能量需求[18]。有超過130種哺乳動(dòng)物的胚胎在囊胚期經(jīng)歷發(fā)育靜止階段,這對(duì)后續(xù)的分化發(fā)育具有重要的意義。然而這期間脂代謝沒有降低,反而是升高的,可能機(jī)制是囊胚停滯期存在一些基因的可變剪切異構(gòu)體,比如肝激酶B1(LKB1)有長和短兩種形式蛋白,在停滯期只表達(dá)長形式的蛋白,導(dǎo)致下游腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)不能被激活,進(jìn)而不能阻斷雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化通路,導(dǎo)致糖酵解和脂肪酸氧化增加[19]。該種機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

脂肪酸顯然在能量儲(chǔ)存中起著重要的作用,但它們也在生物膜的構(gòu)建中起著重要的作用,這是胚胎分裂過程中細(xì)胞膜表面積大幅增加的重要原因,僅在2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎階段,細(xì)胞膜就增加了74%,可推測(cè)在后期的胚胎植入前階段,細(xì)胞膜的增加幅度更大。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中,脂質(zhì)除了提供能量,也是不可缺少的信號(hào)分子,如磷酸肌醇信號(hào)通路控制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[20]。

三、脂質(zhì)代謝異常影響卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育

高脂喂養(yǎng)小鼠建立肥胖小鼠模型,發(fā)現(xiàn)卵巢明顯縮小、卵母細(xì)胞線粒體形態(tài)異常、減數(shù)分裂時(shí)非整倍體增加、早期胚胎丟失率增加,以及早期囊胚前出現(xiàn)的缺陷導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩和腦發(fā)育異常[21]。同時(shí),動(dòng)情周期縮短,GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞含較高的游離脂肪酸使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較高的ROS水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而減少囊胚的形成[4]。體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí),與添加低濃度(72 μmol/L)的游離脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和油酸混合)相比,添加高濃度(720 μmol/L)游離脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和油酸混合)對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育不利,且降低胚胎卵裂率和囊胚形成率;單純的高硬脂酸(140 μmol/L)、高油酸(210 μmol/L)均阻礙卵母細(xì)胞發(fā)育、顯著降低胚胎發(fā)育潛能[22]。較高濃度的飽和脂肪酸,如棕櫚酸,對(duì)卵母細(xì)胞及其早期胚胎有“脂毒性”,可抑制卵母細(xì)胞及其早期胚胎的發(fā)育,可能機(jī)制是棕櫚酸影響卵母細(xì)胞的組蛋白修飾,如H4K12乙?；虷3K9去甲基化,以及抑制與囊胚形成相關(guān)的OCT4、CDX2、粘蛋白等因子。相對(duì)而言,不飽和脂肪酸,如油酸,對(duì)卵母細(xì)胞及早期胚胎的發(fā)育有積極作用,在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞及胚胎過程中添加不飽和脂肪酸(油酸)可抵消卵母細(xì)胞暴露于棕櫚酸或硬脂酸的負(fù)面影響[23-25]。因此,飽和/不飽和脂肪酸的比值對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能有重要的影響。

肥胖女性容易發(fā)生不孕,懷孕后胎兒及新生兒出現(xiàn)問題的概率偏高。研究表明,肥胖女性的卵母細(xì)胞中調(diào)控氧化應(yīng)激、脂代謝和炎癥等基因高表達(dá),亞油酸和硬脂酸濃度增高[26]。一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究顯示,體質(zhì)量指數(shù)(BMI)越高,MⅡ期卵母細(xì)胞越少、優(yōu)胚率越低;經(jīng)輔助生殖技術(shù)(ART)助孕而沒有妊娠的女性,其卵泡液中的棕櫚酸顯著增高[27]。國內(nèi)也有研究表明,肥胖的女性血脂升高,卵泡液中氧化應(yīng)激水平升高,通過體重管理后,血脂及卵泡液氧化應(yīng)激水平下降,優(yōu)胚率及累計(jì)妊娠率均顯著提高[28]。但是,另有研究檢測(cè)ART取卵時(shí)獲得的卵泡液發(fā)現(xiàn),不同BMI人群的卵泡液中脂代謝中間物并沒有顯著差別[10]。以上研究結(jié)果并不能說明BMI跟卵母細(xì)胞生長的微環(huán)境沒有關(guān)系,首先是研究樣本量有限,其次大部分超重或肥胖女性在進(jìn)行ART前都進(jìn)行了體重管理,進(jìn)而改善了自身的代謝,卵泡液代謝物成分也隨之發(fā)生改變。更多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,平衡肥胖女性卵泡液中飽和和不飽和脂肪酸組成成分,改變體外成熟(IVM)培養(yǎng)液中脂質(zhì)組成比,將改善肥胖女性的卵母細(xì)胞及早期胚胎的發(fā)育潛能[23-25]。

卵巢低反應(yīng)(POR)人群卵巢儲(chǔ)備減少,獲卵數(shù)少,臨床妊娠率低。分析卵泡液代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn),與正常女性相比,POR女性的卵泡液中脂代謝相關(guān)代謝中間物(亞油酸、油酸、花生四烯酸、二十六碳六烯酸等)顯著下調(diào),提示這些脂質(zhì)代謝物可以作為POR的生物標(biāo)志物[29]。與年輕人群相比,高齡人群在ART治療過程中檢測(cè)卵泡液提示,糖代謝、脂代謝相關(guān)產(chǎn)物減少,氨基酸代謝升高,與卵巢功能減退、卵母細(xì)胞質(zhì)量差相關(guān)[30]。卵巢功能減退與血清中不飽和脂肪酸的濃度呈正相關(guān),但改善脂代謝能否提高卵巢功能尚不明確[31]。多囊卵巢綜合征(PCOS)人群是典型的卵巢高反應(yīng),卵巢呈多囊樣改變,但是很少排卵,卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能低下、著床率低、流產(chǎn)率高,代謝組學(xué)分析提示肥胖的PCOS女性血清及卵泡液中棕櫚酸和油酸含量顯著升高[32]。上述結(jié)果提示,POR、高齡、PCOS等人群的卵母細(xì)胞線粒體中糖代謝與脂代謝失去了平衡,導(dǎo)致卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量下降。

四、改變卵母細(xì)胞脂代謝與胚胎發(fā)育結(jié)局

卵母細(xì)胞FAO相關(guān)基因受LH峰值的調(diào)節(jié),但是在IVM條件下,FSH和表皮生長因子使卵母細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)失調(diào),且體內(nèi)成熟卵泡液中脂質(zhì)成分與IVM培養(yǎng)液血清中脂質(zhì)成分不同,均導(dǎo)致IVM時(shí)脂代謝基因表達(dá)失調(diào),FAO存在缺陷[1]。以上研究結(jié)果表明,優(yōu)化IVM培養(yǎng)液中脂質(zhì)成分,對(duì)改善ART結(jié)局非常重要。

肉堿協(xié)助活化的脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化產(chǎn)生ATP,近年來被應(yīng)用于改善生殖細(xì)胞功能。肉堿改善能量代謝和卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究,肉堿可能通過抗凋亡、抗糖、抗氧化、抗炎等信號(hào)通路改善卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育潛能[33]。在IVM培養(yǎng)液中加入肉堿,卵母細(xì)胞第一極體排出率增加,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,降低ROS,增加ATP,同時(shí)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞旁分泌因子,增加類固醇激素的產(chǎn)生,從而提高卵母細(xì)胞成熟率及早期胚胎的發(fā)育潛能[34]。給PCOS小鼠模型灌胃肉堿,可通過抗氧化、抗糖化等路徑和增加線粒體功能改善PCOS癥狀[35]。研究發(fā)現(xiàn),214例接受IVF-ET未獲得妊娠的女性口服左旋肉堿后,獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率及受精率無顯著變化,但胚胎質(zhì)量顯著改善[36]。

豬卵IVM過程中,在培養(yǎng)液中分別添加150 μmol/L硬脂酸、油酸,均未影響卵母細(xì)胞成熟率,加入硬脂酸也沒有影響囊胚形成率,而加入油酸則提高了囊胚形成率,同時(shí),顆粒細(xì)胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因(ACACA、PLIN2、SCD、FADS1、FADS2)均上調(diào),且細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量及所占容積均增加[37],說明顆粒細(xì)胞通過增加自身的脂質(zhì)儲(chǔ)存降低了卵泡液中高濃度的脂肪酸對(duì)卵母細(xì)胞的“脂毒性”作用,維持了卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。但是,高濃度的脂肪酸超出了顆粒細(xì)胞的代償能力,間接地使卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡,損害卵母細(xì)胞的發(fā)育。在IVM培養(yǎng)基中加入高濃度棕櫚酸(468 μmol/L)、硬脂酸(194 μmol/L)、油酸(534 μmol/L),通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀遺傳學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)高濃度脂肪酸降低卵母細(xì)胞成熟率和囊胚形成率,其機(jī)制主要涉及炎癥、細(xì)胞凋亡、代謝紊亂及氧化應(yīng)激等相關(guān)的信號(hào)通路[38]。

將CPT1抑制劑-依托莫西加入IVM培養(yǎng)液中并培養(yǎng)24 h后,可以延遲牛的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COC)中卵母細(xì)胞及裸卵的減數(shù)分裂,將其阻滯在MⅠ期前,并且依托莫西可以降低卵丘細(xì)胞和COC的活性,但不影響裸卵的活性,說明卵丘細(xì)胞中FAO對(duì)維持代謝穩(wěn)態(tài)具有重要作用,且可能影響COC中卵母細(xì)胞的活性及減數(shù)分裂[39]。脂肪合成對(duì)胚胎的發(fā)育至關(guān)重要,敲除脂肪酸合成酶(FAS)基因的小鼠胚胎在種植前死亡,提示應(yīng)用抑制FAS功能進(jìn)行減肥或者控制腫瘤生長是非常危險(xiǎn)的[40]。在IVM培養(yǎng)基中加入脂肪合成的抑制劑-淺藍(lán)菌素,可以促進(jìn)COC中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù),但不能促進(jìn)裸卵的成熟。加入藥物C57促進(jìn)FAO同時(shí)抑制脂肪酸的合成,可以促進(jìn)COC和裸卵的減數(shù)分裂恢復(fù)。這些體外實(shí)驗(yàn)證明了FAO在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)過程中的作用大于脂肪酸的合成[41]。

五、結(jié)語及展望

游離脂肪酸進(jìn)入線粒體β氧化產(chǎn)生ATP是卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育的重要能量來源,但高濃度的脂肪酸或者多種脂肪酸比例失調(diào)產(chǎn)生較多的ROS及代謝產(chǎn)物堆積,對(duì)細(xì)胞有一定的脂毒性。卵母細(xì)胞可通過卵丘細(xì)胞從卵泡液里獲得脂肪酸,所以卵泡液里飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的組成比例對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育很重要。肥胖、POR、POCS等人群卵泡液中脂質(zhì)組成比不同,卵母細(xì)胞中脂代謝亦不同,從而影響受精及胚胎的發(fā)育。對(duì)有生育需求的人,控制飲食、體重,改善脂代謝,對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)胚胎至關(guān)重要。ART過程中調(diào)整不同人群培養(yǎng)液中脂質(zhì)成分比,或加入促進(jìn)脂肪酸β氧化的藥物,將有利于改善ART結(jié)局,尤其是IVM結(jié)局。