鄭愛燕，蒲艷，孟慶霞，王瑋，廖桂芝，李紅，丁潔

(南京醫(yī)科大學姑蘇學院,南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院,蘇州市立醫(yī)院,蘇州 215002)

體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)助孕過程中,胚胎發(fā)育潛能是影響妊娠成功與否的關鍵因素之一,因此如何篩選一枚最佳發(fā)育潛能的胚胎成為亟待解決的問題。盡管囊胚移植的出現使胚胎種植率有了一定提升,但囊胚移植需延長胚胎的體外培養(yǎng),可能會增加產科并發(fā)癥發(fā)生,損害圍產期結局[1-2],另外囊胚移植也可能導致胎兒出生性別比升高[3]。因此,我們期望找到能在胚胎發(fā)育早期階段預測胚胎發(fā)育潛能的指標和方法。

時差培養(yǎng)(Time-lapse)技術可以在維持胚胎培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定的條件下,連續(xù)觀察胚胎的整個發(fā)育狀態(tài),包括細胞分裂時間點和異常分裂行為。研究發(fā)現胚胎發(fā)育動力學參數和特殊分裂方式可以影響胚胎發(fā)育潛能[4-6]。而紡錘體對卵母細胞染色體的分配、運動、平衡以及極體的排列有著至關重要的影響。紡錘體實時觀察儀的出現,使人們可以進行活體紡錘體觀測。研究發(fā)現減數分裂紡錘體(MS)存在與否會影響卵母細胞正常受精和胚胎發(fā)育及妊娠結局[7-9]。因此本研究擬結合早期胚胎發(fā)育形態(tài)動力學參數和MS形態(tài),建立卵裂期胚胎篩選模型。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年8月至2022年6月在蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心行ICSI,同時行卵母細胞MS觀測和胚胎實時觀測培養(yǎng)患者的臨床資料。這些患者的正常受精胚胎均于Time-lapse時差培養(yǎng)箱(Embryoscope Plus,Vitrolife,丹麥)進行培養(yǎng)。納入標準:患者該周期的全部正常受精胚胎均行全囊胚培養(yǎng)。排除標準:(1)獲卵數<5枚;(2)夫妻雙方任意一方有染色體異常;(3)女方為贈卵周期;(4)子宮畸形,嚴重輸卵管積水等影響妊娠的因素。

本研究共納入46個周期,459枚成熟卵母細胞(MⅡ卵),行ICSI注射后最終獲得335枚卵裂期胚胎,均行囊胚培養(yǎng)。

二、研究方法

1.分組:根據ICSI注射時卵母細胞的MS形態(tài)分為MS正常組(239枚)和MS異常組(96枚);根據是否出現直接分裂(DC)分為無DC組(285枚)和DC組(50枚),其中DC組又分為DC1組(胚胎第1次卵裂時卵裂球一分為三,20枚)和DC2組(除第1次卵裂外,其余胚胎發(fā)育階段卵裂球一分為三,30枚);根據是否出現逆分裂(RC),分為RC組(9枚)和無RC組(326枚);根據傳統(tǒng)形態(tài)學評分將D3胚胎分為D3優(yōu)質胚胎組(209枚)和D3非優(yōu)質胚胎組(126枚)后,對D3優(yōu)質胚胎組和非優(yōu)質胚胎組按照胚胎發(fā)育結局分別分組,形成可利用囊胚的為囊胚組(分別為166枚和31枚),未形成可利用囊胚而丟棄的為廢棄組(分別為43枚和95枚)。

2.促排卵與取卵:根據患者基本情況,進行常規(guī)促排卵,當B超提示3枚優(yōu)勢卵泡直徑達18 mm或4枚優(yōu)勢卵泡直徑達17 mm時注射HCG(艾澤,默克,德國)扳機,扳機后36 h在陰道B超引導下取卵。獲得的卵丘卵母細胞復合體(COCs)漂洗干凈后置于含G-IVF Plus(Vitrolife,瑞典)的4孔皿。2～4 h后用透明質酸酶(Sage,美國)消化去除COCs周圍的顆粒細胞,將成熟卵母細胞(MⅡ卵)置于G1 Plus(Vitrolife,瑞典)中培養(yǎng)1～2 h等待授精。上述培養(yǎng)條件均為37℃、6.2%CO2、5%O2。

3.紡錘體觀測與ICSI:ICSI時將MⅡ卵置于紡錘體觀測專用玻璃皿(D910400,OLYMPUS,日本),利用紡錘體觀測系統(tǒng)(IX-ROBOPola system,OLYMPUS,日本)觀察MS形態(tài)。若呈現明亮的橢圓形則為正常MS,其余狀態(tài)均為異常MS,包括MS形態(tài)異常、亮度異常和未見MS。ICSI時將MS置于12點鐘方向后進行注射,若未見MS,則將第一極體置于12點鐘方向后行注射。

4.胚胎培養(yǎng):ICSI后立即將卵母細胞按順序置于含G1 Plus的16孔培養(yǎng)皿(Vitrolife,丹麥),放入胚胎時差培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。于受精后第3天(D3)和第5天(D5)進行G2 Plus(Vitrolife,瑞典)半量更換,培養(yǎng)至受精后第6天(D6)。培養(yǎng)條件為37℃、6.2%CO2、5%O2。

5.Time-lapse系統(tǒng)和胚胎評分:時差培養(yǎng)箱拍攝平面11層,時間間隔為10 min。利用Time-lapse圖像分析軟件收集胚胎發(fā)育資料[10],包括各個細胞分裂時間點:原核形成(tPNa)、原核消失(tPNf)、2細胞(t2)、3細胞(t3)、4細胞(t4)、5細胞(t5)、8細胞(t8),以及特殊分裂模式:DC和RC。2細胞到3細胞的發(fā)育時間cc2=t3-t2,3細胞到5細胞的發(fā)育時間cc3=t5-t3,3細胞到4細胞的發(fā)育時間s2=t4-t3,5細胞到8細胞的發(fā)育時間s3=t8-t5。

D3胚胎卵裂球數目≥7,胚胎碎片≤20%,且卵裂球均勻者為形態(tài)學優(yōu)質胚胎,此外為非優(yōu)質胚胎。囊胚形態(tài)學評分采用Gardner評分體系[11],可利用囊胚為囊胚腔擴張≥3期,內細胞團細胞數≥B級,滋養(yǎng)層細胞數≥C級。囊胚形成率=可用囊胚數/卵裂胚胎數×100%。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、納入患者基本情況

本研究共納入46個周期,459枚成熟卵母細胞,行ICSI注射后最終獲得335枚卵裂胚胎。納入患者平均年齡為(35.1±4.9)歲,體質量指數(BMI)為(21.3±4.0)kg/m2,不孕年限為(3.4±2.7)年,FSH為(8.0±2.7)U/L,E2為(51.9±26.2)pmol/L、LH為(5.0±3.7)U/L,抗苗勒管激素(AMH)為(4.8±4.1)ng/ml,獲卵數為(12.4±5.7)枚,成熟卵數為(10.4±4.7)枚,正常受精數為(7.7±4.5)枚,形成可利用囊胚數為(4.4±3.7)枚。

二、MS形態(tài)對囊胚形成的影響

MS正常組囊胚形成率為63.6%,顯著高于MS異常組(46.9%)(P<0.05)(表1)。

表1 MS形態(tài)對囊胚形成的影響(%)

三、胚胎異常分裂模式對囊胚形成的影響

DC1組的囊胚形成率顯著低于DC2組和無DC組(P<0.05);與無RC組比較,RC組的囊胚形率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 異常分裂模式對囊胚形成的影響(%)

四、胚胎形態(tài)學評分對囊胚形成的影響

D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎的囊胚形成率顯著高于D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎(P<0.05)(表3)。D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎中,卵裂球數≥6個的胚胎其囊胚形成率顯著高于卵裂球數<6個的胚胎(P<0.05)(表4)。

表3 傳統(tǒng)形態(tài)學評分對囊胚形成的影響(%)

表4 D3非優(yōu)質胚胎的卵裂球數對囊胚形成的影響(%)

五、胚胎動力學參數對囊胚形成的影響

對于D3形態(tài)學優(yōu)質的胚胎,囊胚組的平均年齡、t2和s3均顯著小于廢棄組(P均<0.05),而t3、t5、cc2和cc3均顯著大于廢棄組(P均<0.05),其余參數在兩組間差異均無顯著意義(P均>0.05)(表5)。

表5 D3優(yōu)質胚胎的囊胚組與廢棄組間年齡及動力學差異(-±s)

對于D3形態(tài)學非優(yōu)質的胚胎,囊胚組的t2顯著小于廢棄組(P<0.05),而年齡、tPNa、tPNf在兩組間差異均無顯著意義(均P>0.05)(表6)。

表6 D3非優(yōu)質胚胎的囊胚組與廢棄組間年齡及動力學差異(-±s)

六、影響囊胚形成的多元Logistic回歸分析

在D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎中,將t2、t3、t5、cc2、cc3、s3均按照二分位分為兩類,t2、t3、t5、cc2、cc3、s3中位數分別為24.7、34.6、46.9、10.7、12.8和6.3;年齡根據高齡分類,分為≥38歲和<38歲兩類;MS按照形態(tài)分為正常和異常兩類,然后將上述參數進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示年齡、cc3、s3和MS形態(tài)與囊胚形成之間存在相關(統(tǒng)計學參數分別為OR=2.966,P=0.007;OR=0.240,P=0.017;OR=2.922,P=0.015;OR=2.448,P=0.028)(表7)。

表7 D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎囊胚形成率的多元回歸分析

在D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎中,將t2按照二分位分為兩類,其中位數為28.4;卵裂球數目分為<6個卵裂球的胚胎和≥6個卵裂球的胚胎兩類,然后將上述參數進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示僅卵裂球數目對囊胚形成有統(tǒng)計學意義(OR=4.161,P=0.003)(表8)。

表8 D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎囊胚形成率的多元回歸分析

七、卵裂期胚胎分層篩選模型的建立

在20枚DC1胚胎中,僅1枚形成可利用囊胚,其囊胚形成率為5.0%。因此,將DC1作為首要排除指標,將發(fā)生DC1的胚胎定義為K級。未發(fā)生DC1的胚胎按照D3胚胎形態(tài)學評分進行篩選,形態(tài)學優(yōu)質胚胎的等級高于形態(tài)學非優(yōu)質胚胎。在D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎中,根據Logistic回歸分析中3個意義指標的P值大小進行逐級分層選擇,依次為s3、cc3和MS形態(tài)。盡管年齡與該組囊胚形成存在相關,但胚胎篩選的目的是為同一患者胚胎進行排序,以選擇最具發(fā)育潛能的胚胎進行移植,提高患者的臨床妊娠率,因此建立胚胎篩選模型時將年齡排除。故,s3≤6.3 h、cc3>12.8 h的胚胎中,MS正常胚胎為A級,MS異常胚胎為B級;s3≤6.3 h、cc3≤12.8 h的胚胎中,MS正常胚胎為C級,MS異常胚胎為D級;s3>6.3 h、cc3>12.8 h的胚胎中,MS正常胚胎為E級,MS異常胚胎為F級;s3>6.3 h、cc3≤12.8 h的胚胎中,MS正常胚胎為G級,MS異常胚胎為H級。而在D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎中,根據卵裂球數目,≥6的為I級,<6的為J級。故D3胚胎分層篩選模型共分為11等級,A級為最佳,按字母依次降低,K級最劣(圖1)。

圖1 D3胚胎分層篩選模型

八、胚胎分層篩選模型的ROC曲線驗證

用D3胚胎分層篩選模型進行胚胎選擇并賦值,將其與是否形成囊胚作ROC曲線,求出曲線下面積。結果顯示ROC曲線的曲線下面積為0.857,95%CI為(0.816,0.899),P=0.000(圖2),表明D3胚胎分層篩選模型對囊胚形成有較好的預測價值。

圖2 胚胎分層篩選模型對胚胎發(fā)育結局預測的ROC曲線

討 論

在對卵裂期胚胎進行選擇時,許多生殖中心依然沿用傳統(tǒng)的形態(tài)學評分,這種分類方法通過特定時間點的參數來區(qū)分胚胎優(yōu)劣,其信息是點狀的,不能代表胚胎發(fā)育全貌。因此,我們期望通過增加卵母細胞和胚胎早期生長發(fā)育過程中的額外關鍵信息,以獲得更精準、有效的胚胎選擇方法。Time-lapse不僅可以維持胚胎培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定,而且可以實時觀測胚胎生長發(fā)育全過程,捕獲胚胎異常分裂行為。同時,卵母細胞質量也是影響胚胎早期質量的關鍵,紡錘體在胚胎分裂過程中起著重要作用,且大量研究證實紡錘體形態(tài)與囊胚形成相關[12-13]。

本研究中DC1的發(fā)生率為6.0%(20/335),其囊胚形成率顯著低于DC2和無DC的胚胎(5.0% vs. 46.7% vs. 63.9%,P<0.05)。以往研究證實DC可導致分裂過程中染色體分離異常[14]。本研究中發(fā)生DC1的20枚胚胎僅1枚形成囊胚,且為非優(yōu)質囊胚。因此,推測DC1可使胚胎發(fā)育潛能受損,故將DC1作為D3胚胎分層篩選模型的首層排除指標。

胚胎的形態(tài)學評分也是影響囊胚形成的一個重要指標。有研究表明胚胎形態(tài)和發(fā)育階段與胚胎發(fā)育能力密切相關[15]。本研究中D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎的囊胚形成率顯著高于D3形態(tài)學非優(yōu)質胚胎(79.4% vs. 24.6%,P<0.05)?？梢?形態(tài)學評分對胚胎發(fā)育潛能的預測有意義。對于胚胎生長發(fā)育緩慢或碎片較多的胚胎,常常因為細胞分裂時間點難以評判或獲得,而導致胚胎動力學參數標記不全。因此,本文在研究動力學對胚胎發(fā)育潛能影響時,將D3胚胎按照形態(tài)學分類后進行。故D3胚胎的形態(tài)學分類歸為第二層篩選指標,且優(yōu)質胚胎的分級高于非優(yōu)質胚胎。

在D3形態(tài)學優(yōu)質胚胎中,s3、cc3和MS形態(tài)與囊胚形成之間存在相關(P<0.05),根據P值大小將s3、cc3和MS形態(tài)作為模型的第一、第二和第三亞篩選參數;而在D3非優(yōu)質胚胎中,僅卵裂球數目與囊胚形成之間存在相關(P<0.05),故卵裂球數目為第一亞篩選參數。由此經過逐層篩選,建立了預測囊胚形成的D3胚胎分層篩選模型,該模型分為A級～K級11個等級,且評分由A級到K級依次遞減。該模型對囊胚形成預測ROC曲線的曲線下面積為0.857,95%CI為(0.816,0.899),P=0.000,具有較好的預測價值。

既往關于囊胚預測模型的研究中,Cruz等[4]利用Time-lapse動力學特征,以t5為主要變量,s2為次要變量,將胚胎分為A～D 4個等級,結果顯示囊胚形成率由A到D級分別為77.0%、72.0%、64.9%和53.6%,呈遞減趨勢。該模型中t5和s2(即t4-t3)均為較早期的分裂指標,但各級胚胎囊胚形成率之間差異不大。Motato等[5]以tM為主要變量,s3為次要變量,將胚胎分為A～D 4個等級,結果顯示囊胚形成率由A到D級分別為84.4%、75.0%、28.2%和13.8%,呈遞減趨勢。該模型中主要選擇參數tM是開始形成桑椹胚的時間,該時間一般發(fā)生于受精后第4天(D4),出現時間較晚,進而削弱了模型在早期卵裂期胚胎選擇的意義。Yang等[16]以細胞碎片、DC、RC和細胞發(fā)育阻滯為主要變量,以tPNF、t2和t4為次要標量,將胚胎分為A～D 4個等級,結果顯示A、B、C、D級的囊胚形成率分別為80.0%、77.8%、53.7%和22.2%(P<0.001)。該模型建立在138枚胚胎的小樣本基礎上,且參數的劃分較粗略,一個分層選擇涉及多項變量。而本研究將特殊分裂模式DC、形態(tài)學評分、動力學評分和紡錘體形態(tài)評分聯合應用,模型建立的指標分類更為全面。特別是將D3形態(tài)學優(yōu)質和非優(yōu)質胚胎的動力學參數進行精細化分類評估,將那些動力學參數標記不全或動力學參數評估模糊的胚胎歸為一類,僅進行tPNa、tPNf和t2的評估。而對于D3形態(tài)學優(yōu)質的胚胎,進行全部的胚胎早期細胞分裂時間點、細胞分裂周期和細胞分裂同步性分析,從而為進一步鑒別常規(guī)形態(tài)學優(yōu)質胚胎的等級找到了評定指標。

另外,本模型中引入了MS形態(tài),且MS形態(tài)與囊胚形成相關,可作為胚胎篩選的參數。Holubcová等[12]將MS按照形態(tài)分為雙極紡錘體(A級)、畸形/半透明紡錘體(B級)、未見雙折射紡錘體(C級)和微管橋紡錘體(D級)四類,結果發(fā)現B、C、D級紡錘體胚胎囊胚形成率顯著低于A級。Asa等[13]也發(fā)現MS形態(tài)與胚胎形態(tài)呈正相關,且MS形態(tài)不佳的卵母細胞,其形成的胚胎碎片程度較高。MS改變可能會引起染色體完整性的改變,促使染色體不分離導致非整倍體,不平衡的染色單體連接產生結構異常,以及染色體缺失,進而影響胚胎發(fā)育能力[17]。而Alegre等[18]在胚胎形態(tài)動力學基礎上引入胚胎培養(yǎng)液氧化狀態(tài)(H2sm),建立了胚胎質量分級模型(A～F級),從A級到F級種植率在76.5%到29.2%之間,且依次遞減。因此,認為形態(tài)學、動力學和胚胎培養(yǎng)基氧化狀態(tài)相結合的評估模型可能有助于改進現有的胚胎選擇方法;胚胎形態(tài)動力學與其它指標相結合可用于胚胎選擇模型的建立。

各中心以胚胎形態(tài)動力學為基礎建立的胚胎選擇模型均可有效地預測本中心胚胎的發(fā)育潛能,但是由于胚胎發(fā)育對環(huán)境條件(如培養(yǎng)液種類、溫度及氣體濃度等)十分敏感[19-21],各中心的選擇參數不盡相同。因此到目前為止并沒有適用于各實驗室的通用模型。Barrie等[21]根據已發(fā)表的6個胚胎選擇模型,對來自884個治療周期的977枚已知種植結局的胚胎進行回顧性分析,結果顯示并不能獲得理想的預測效果,提示這些模型進行外部應用時可能會失去應用價值,因此開發(fā)針對患者、治療和環(huán)境的內部模型十分重要。

此外,本研究以是否形成囊胚為模型的最終指標,而非胚胎種植結局,是考慮到胚胎能否種植受胚胎質量、子宮內膜狀態(tài)和患者自身情況等多種因素共同作用;即便整倍體胚胎也會出現種植失敗的情況。另外,大部分以種植為結局的研究,并非建立在單胚胎移植基礎上,對于移植兩枚胚胎僅單胎妊娠的患者,會因無法明確具體種植的胚胎而被排除在統(tǒng)計之外,進而可能會引起數據的嚴重偏移[22]。

最后,本研究中MS異常卵母細胞形成的胚胎數量較少,故MS形態(tài)僅分為正常和異常,實際上在異常的MS中又可詳細分為諸如形狀異常、亮度異常和未見紡錘體等。且文章僅將胚胎結局分為廢棄組和囊胚組,實際上囊胚組還可細分為優(yōu)質囊胚和非優(yōu)質囊胚。因此,本研究可積累數據后進行進一步深入分析。

綜上,本研究中以胚胎形態(tài)學、動力學聯合MS形態(tài)分析建立的D3胚胎分層篩選模型,對胚胎發(fā)育潛能具有較好的預測能力。