KED碰撞模式-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測定血液、尿液中8種重金屬和準(zhǔn)金屬元素

吳澤清 張成龍 國 菲 劉番番 畢文姬 楊瑞琴* 李 鵬*

(1.中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院,北京 100038;2.淄博市公安局 刑偵支隊(duì),山東 淄博 255022)

重金屬和準(zhǔn)金屬元素常被不法分子用于投毒犯罪活動(dòng),涉及重金屬和準(zhǔn)金屬的中毒案件時(shí)有發(fā)生。相關(guān)案件中的血液、尿液取樣便捷且在人體內(nèi)含量豐富,能夠反映不同途徑元素暴露的體內(nèi)負(fù)荷信息[1-2]。血液、尿液中重金屬和準(zhǔn)金屬元素常見的檢測方法主要包括原子發(fā)射光譜(AES)、原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-AES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法。ICP-MS是20世紀(jì)80年代以來發(fā)展最快的多元素分析技術(shù),與AES、AAS和ICP-AES相比,檢出限更低、線性范圍更寬、分析速度更快,被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品分析、醫(yī)學(xué)診斷和法庭科學(xué)等領(lǐng)域。然而,ICP-MS在檢測血液、尿液中的重金屬和準(zhǔn)金屬元素時(shí)會(huì)受到基質(zhì)干擾、多原子離子干擾等因素的干擾,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,這就要求檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)選擇適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ê托?zhǔn)方法。血液、尿液樣品常用的前處理方法包括微波消解法和直接稀釋法等。微波消解法消解完全,密閉環(huán)境能夠有效避免揮發(fā)性元素的損失,避免外界污染[3],但樣品處理時(shí)間長、操作復(fù)雜,不適合批量測定;直接稀釋法操作簡單快速且無需前處理設(shè)備,能夠減少可能引入的污染。稀釋能有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng),避免樣品中的有機(jī)物和較高濃度的無機(jī)鹽堵塞進(jìn)樣毛細(xì)管[4],減少因霧化器和錐口上的固體沉積而引起的儀器漂移[5]。

由于血液、尿液樣品的基質(zhì)復(fù)雜且具有個(gè)體差異性,無法配制與血液、尿液樣品成分相似的標(biāo)準(zhǔn)溶液,難以獲得較好的準(zhǔn)確度[6]。外標(biāo)法、同位素稀釋法和標(biāo)準(zhǔn)加入法是定量分析中常用的校準(zhǔn)方法[7]。外標(biāo)法通過扣除本底值有效減少系統(tǒng)偏差,但不同樣品間基質(zhì)效應(yīng)的差異仍會(huì)顯著影響定量的準(zhǔn)確性;同位素稀釋法是校正ICP-MS中基質(zhì)效應(yīng)和信號(hào)漂移最有效的方法,但該方法耗時(shí)長、成本高,要求目標(biāo)元素至少有兩個(gè)不受光譜干擾的同位素,不適用于Co、As、Sb、Tl等只有一個(gè)同位素或者單同位素的元素[5];標(biāo)準(zhǔn)加入法應(yīng)用成本低,無需另外引入空白基質(zhì),克服了基質(zhì)效應(yīng)且被證明在生物基質(zhì)中具有極高的準(zhǔn)確性[8]。本實(shí)驗(yàn)在直接稀釋前處理方法的基礎(chǔ)上,通過標(biāo)準(zhǔn)加入法和稀釋劑改善血液、尿液樣品的基質(zhì)效應(yīng)和個(gè)體元素差異造成的誤差,再應(yīng)用動(dòng)能歧視(KED)檢測模式減少樣品中生物分子對(duì)測定產(chǎn)生的質(zhì)譜和非質(zhì)譜干擾,實(shí)現(xiàn)血液、尿液樣品中多元素的精準(zhǔn)和高通量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

iCAP Qc ICP-MS儀器(美國Thermo Fisher公司)、去離子純水處理系統(tǒng)(法國Merck公司)、HY-5 渦旋振蕩器(常州恒睿儀器設(shè)備制造有限公司)、CF16RN 落地式多功能離心機(jī)(日本日立公司)、AUW220D 電子天平(日本島津公司)、移液器(德國Eppendorf公司)。

去離子水(18.2 MΩ·cm),1 g/L Cr、As、Cd、Pb單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(山東省冶金科學(xué)研究院),1 g/L Co、Ni、Sb單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心),1 g/L Tl單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(AccuStandard?),1 g/L In單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(壇墨質(zhì)檢,BW30046-100-N-50),超純濃硝酸(德國Merck公司),1 g/L Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U調(diào)諧液(美國Thermo公司),Triton X-100 試劑(Sigma-Aldrich?),99.9%乙醇溶液(德國Merck公司),志愿者血液、志愿者尿液各1份。

1.2 儀器參數(shù)

用美國Thermo公司儀器調(diào)諧液(S55602)調(diào)節(jié)儀器至最優(yōu)狀態(tài),并滿足氧化物產(chǎn)率CeO+/Ce+<3%,雙電荷離子Ba2+/Ba+<3%。通過調(diào)諧優(yōu)化后的儀器參數(shù)條件為:射頻(RF)功率1 550 W、載氣流速12 L/min、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速40 r/min、掃描次數(shù)20次、積分時(shí)間0.02 s、掃描方式跳峰、每個(gè)樣品連續(xù)重復(fù)測量3次,檢測模式KED模式、碰撞氣體He。

1.3 樣品前處理

將存儲(chǔ)于-22 ℃環(huán)境下的空白血液和尿液取出解凍,渦旋儀混勻后處理。血樣和尿液分別取5 mL空白樣品各自置于8個(gè)10 mL試管內(nèi),留1份空白樣品,向其余試管中分別添加0.05 mL的25、100、500、1×103、2×103、5×103、1×104μg/L梯度濃度溶液。移取200 μL血液至10 mL離心管,加入30 μL內(nèi)標(biāo)溶液后向內(nèi)加入稀釋劑(0.1%HNO3+0.05%Triton X-100)稀釋50倍至10 mL,渦旋1 min后4 500 r/min離心5 min,移液槍移取上清液后使用ICP-MS檢測;移取200 μL尿液至2 mL離心管,加入30 μL內(nèi)標(biāo)溶液后向內(nèi)加入稀釋劑(0.1% HNO3+1%乙醇)稀釋10倍至2 mL,渦旋1 min直接使用ICP-MS檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26.0對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 碰撞氣流量和載氣流速的優(yōu)化

檢測前通過自動(dòng)調(diào)諧達(dá)到儀器最佳實(shí)驗(yàn)狀態(tài),但為了提高儀器對(duì)檢材中單個(gè)目標(biāo)元素定性定量時(shí)的靈敏度,對(duì)能顯著影響元素響應(yīng)值的碰撞氣和載氣流速進(jìn)行了考察。KED模式下碰撞氣He流量的大小影響進(jìn)入質(zhì)量分析器中待測離子的數(shù)目,從而影響檢測靈敏度[9];進(jìn)樣過程中在霧化器處引入載氣,其流速大小能夠影響等離子體中樣品氣溶膠的電離效率和停留時(shí)間[10]。本實(shí)驗(yàn)通過考察1 μg/L的Cr、Co、Ni、As、Cd、Sb、Pb、Tl標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別研究He流量在1～6 mL/min,載氣流速0.4～1.3 L/min時(shí)各元素響應(yīng)值的變化,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,隨He流量的增大,Co、Cd、Sb、Pb元素的響應(yīng)值呈現(xiàn)先增大后減小然后再增大的趨勢,Cr、Ni、Tl元素的響應(yīng)值呈現(xiàn)整體增大的趨勢,As的響應(yīng)值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;隨載氣流速的增加,更多均勻的樣品氣溶膠顆粒進(jìn)入等離子體中,整體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。75As、208Pb的最佳He流量分別為4.0、2.0 mL/min,其余元素的響應(yīng)值在He流量為6.0 mL/min時(shí)最大;75As的最佳載氣流速為1.1 L/min,其余元素的最佳載氣流量為1.2 L/min。

圖1 He流量和載氣流速對(duì)8種重金屬和準(zhǔn)金屬元素響應(yīng)值的影響Figure 1 Effects of He flow rate and carrier gas flow rate on the response values of 8 heavy metals and quasi metallic elements.

2.2 稀釋劑的選擇

血液、尿液基質(zhì)成分復(fù)雜[11-12],稀釋能夠有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)。相對(duì)于堿性稀釋劑,Mn、As等元素在酸性條件下更加穩(wěn)定。HNO3對(duì)大多數(shù)金屬及痕量元素的溶解性好且譜圖干擾小[6],是目前常用的稀釋劑,但過高濃度HNO3可能導(dǎo)致樣品中的蛋白質(zhì)變性,使得儀器進(jìn)樣管和霧化器堵塞[13],因此選擇低濃度HNO3(0.1%)作為基本稀釋劑,同時(shí)對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)ICP-MS增敏劑Triton X-100和乙醇的效果進(jìn)行考察。不同體積分?jǐn)?shù)的Triton X-100、乙醇對(duì)8種重金屬和準(zhǔn)金屬元素信號(hào)響應(yīng)的影響見圖2。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的Triton X-100和乙醇溶液對(duì)8種重金屬和準(zhǔn)金屬元素信號(hào)響應(yīng)的影響Figure 2 Effects of Triton X-100 and ethanol solutions with different volume fractions on signal response of 8 heavy metals and quasi metallic elements.

未經(jīng)消解的血液中基質(zhì)成分復(fù)雜,大約含有60～80 g/L蛋白質(zhì)和10 g/L無機(jī)鹽。非離子型表面活性劑Triton X-100具有溶血作用,經(jīng)常應(yīng)用于生化以溶解蛋白質(zhì)[14],相比于乙醇更適合作為血液稀釋劑。由圖2可知,同質(zhì)量濃度的Cr、As、Sb標(biāo)準(zhǔn)溶液在體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-100溶液中獲得最高信號(hào),但其他元素信號(hào)響應(yīng)值均較低;在0.05%Triton X-100溶液中,Co、Ni、Cd和Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)響應(yīng)最高,同時(shí)其他元素也具有較高的信號(hào)響應(yīng)值。故實(shí)驗(yàn)選用0.05% Triton X-100溶液作為增敏劑,采用0.1% HNO3-0.05% Triton X-100混合溶液作為血液稀釋劑。

乙醇簡單易得,對(duì)工作環(huán)境及人員無毒害,適合作為大批量樣品的ICP-MS增敏劑[6]。由圖2可知,Cr、Co、Ni等低質(zhì)量數(shù)元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在體積分?jǐn)?shù)為1%乙醇溶液中獲得最高信號(hào),As、Cd、Sb、Tl和Pb等高質(zhì)量數(shù)元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在體積分?jǐn)?shù)為4%乙醇溶液中獲得最高信號(hào),其余體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)元素信號(hào)的增強(qiáng)和抑制不明顯,響應(yīng)值差別較小。樣品離子束進(jìn)入提取透鏡后受空間電荷效應(yīng)的影響,輕質(zhì)量數(shù)離子受影響偏轉(zhuǎn)甚至逃逸,導(dǎo)致輕質(zhì)量數(shù)元素的靈敏度偏低[7]。因此在同等濃度下,Cr、Co、Ni元素標(biāo)準(zhǔn)溶液信號(hào)響應(yīng)相對(duì)As、Cd、Sb、Tl和Pb元素更低,1%乙醇溶液能夠有效提高低質(zhì)量數(shù)元素的信號(hào)響應(yīng),同時(shí)其他元素也具有較高的信號(hào)響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)選用1%乙醇溶液作為增敏劑,采用0.1% HNO3-1%乙醇混合溶液作為尿液稀釋劑。

2.3 干擾來源與消除

ICP-MS測定血液和尿液樣品中元素時(shí)受多原子離子干擾、雙電荷干擾、拖尾干擾等影響,此外空白樣品和檢材樣品間基質(zhì)的差異也會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成干擾。血液、尿液樣品中含有的生物分子、有機(jī)物和鹽類物質(zhì),使得樣品基質(zhì)更加復(fù)雜,容易在離子化過程中與氬氣結(jié)合形成如40Ar14N+、ArCl+、40Ar12C+等復(fù)雜的干擾物[15],這是造成多原子離子干擾的原因之一。KED模式在四極桿濾質(zhì)器中的四極桿上形成電勢柵欄,從而區(qū)分動(dòng)能有所差別而質(zhì)荷比相同的離子,通入碰撞氣He抑制多原子離子干擾以達(dá)到減低質(zhì)譜干擾的目的[15-16]。雙電荷干擾在ICP-MS中并不是主要的干擾類型,同時(shí)對(duì)生物樣品檢測的影響較小,在檢測開始前使用含有Ce2+或Ba2+的調(diào)諧液檢測雙電荷離子的形成[5]。拖尾干擾的大小取決于儀器的豐度靈敏度,血液等液體檢材中的55Mn容易受54Fe和56Fe的影響導(dǎo)致不真實(shí)的高響應(yīng)值。檢測中標(biāo)準(zhǔn)加入法的引入避免了使用空白樣品量化檢材中的目標(biāo)物,使得樣品基質(zhì)保持一致[17]。

此外,儀器在分析高濃度樣品后對(duì)低濃度樣品的測定會(huì)出現(xiàn)記憶效應(yīng),應(yīng)當(dāng)按照濃度升序檢測樣品,同時(shí)設(shè)置合適的清洗時(shí)間以降低記憶效應(yīng)。根據(jù)上述儀器條件測定8種元素的50 μg/L高濃度樣品溶液,分別將樣品測定完成后的清洗時(shí)間設(shè)定為10、30、60和120 s,當(dāng)清洗時(shí)間為60 s時(shí),各元素響應(yīng)值已經(jīng)接近空白樣品水平的響應(yīng)值,有效消除了各元素測定過程中引入的記憶效應(yīng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)加入法測定樣品中重金屬和準(zhǔn)金屬

表1 血液和尿液樣品中8種元素的線性關(guān)系及含量Table 1 Linear relationship and contents of 8 elements in blood and urine samples

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 檢出限及定量限

通過對(duì)空白溶劑的測量,計(jì)算出檢出限和定量限。使用ICP-MS連續(xù)檢測11次,檢出限LOD=3SD,其中SD表示測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)IUPAC指南計(jì)算定量限,定量限LOQ為標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,即LOQ=10SD,結(jié)果如表2所示。

表2 8種元素的檢出限和定量限Table 2 Detection limits and quantification limits of 8 elements

2.5.2 加標(biāo)回收率及精密度

表3 標(biāo)準(zhǔn)加入法下8種元素的低、中、高濃度溶液在血液和尿液中的回收率Table 3 Recoveries of low,medium and high concentration solutions of 8 elements in blood and urine under the standard addition method /%

選取血液、尿液樣品的低、中、高(血液:10、50、100 μg/L;尿液:5、50、100 μg/L)濃度消解后溶液,連續(xù)測定11次,連續(xù)測定3 d,得到8種元素的日內(nèi)和日間精密度。如表4所示,血液中各元素的日內(nèi)和日間精密度為0.90%～8.7%和0.73%～1.9%;尿液中各元素的日內(nèi)和日間精密度為0.30%～3.0%、1.5%～7.7%,說明該方法對(duì)血液和尿液中重金屬和準(zhǔn)金屬元素的測定值準(zhǔn)確可靠。

表4 血液和尿液中8種元素的日內(nèi)和日間精密度Table 4 Intra-day and inter-day precision of 8 elements in blood and urine(n=11) /%

3 結(jié)論與展望

建立了采用直接稀釋方法對(duì)血液、尿液樣品進(jìn)行前處理,并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)加入法和KED模式定量的ICP-MS檢測方法,靈敏準(zhǔn)確、快速便捷、準(zhǔn)確性高,適用于血液、尿液中多種重金屬和準(zhǔn)金屬元素的檢測。本文比較了不同濃度和種類的ICP-MS增敏劑的效果,調(diào)整了清洗時(shí)間,有效避免了測定過程中的記憶效應(yīng),引入內(nèi)標(biāo)元素In調(diào)節(jié)儀器信號(hào)漂移并補(bǔ)償基體干擾,同時(shí)KED模式使用He作為碰撞氣與多原子離子碰撞裂解,利用電壓差過濾低動(dòng)能離子,有效抑制了檢測過程中的多原子離子干擾,相關(guān)方法驗(yàn)證結(jié)果均能滿足測定要求。應(yīng)注意為避免樣品中未消解的有機(jī)物在霧化器和錐口上沉積導(dǎo)致儀器信號(hào)漂移,使用時(shí)應(yīng)當(dāng)在靈敏度允許的范圍內(nèi),根據(jù)實(shí)際情況和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道盡量以大倍數(shù)稀釋樣品,以減少樣品基質(zhì)對(duì)儀器的影響。