吳紅艷,尚學彬,劉婷利,蔚丹丹

(1.河南省職工醫(yī)院消化內(nèi)科,河南 鄭州 450000; 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科,河南 鄭州 450000)

胃癌是發(fā)生于胃壁黏膜層上皮細胞的惡性腫瘤,發(fā)病率居惡性腫瘤第2位,病死率居第4位,是常見的消化系統(tǒng)癌癥[1]。胃癌發(fā)病隱匿,早期診斷困難,大部分患者確診時已屬于中晚期?；熓峭砥谖赴┳钪匾闹委煼绞?但腫瘤細胞極易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性使治療效果不佳[2]。因此,亟需開發(fā)具有抗癌效用且毒副作用低的藥物。順鉑具有廣譜抗腫瘤效用,臨床療效明顯,單獨用藥或與其他藥物聯(lián)合使用已成為治療惡性腫瘤的常用藥物[3]。紅景天苷是中藥材紅景天的主要活性成分,具有消炎、抗腫瘤、抗病毒和提高免疫力等藥理作用[4]。近年來,多項研究報道,紅景天苷可促進腫瘤細胞凋亡,抑制細胞活性,對肺癌、宮頸癌[4]和卵巢癌[5]等均有良好效用,但其作用機制尚不明確。本研究采用紅景天苷與順鉑聯(lián)合處理體外培養(yǎng)的胃癌細胞HGC-27,研究其通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路對胃癌細胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響,從分子機制角度探討其對胃癌細胞HGC-27生物學行為的抑制作用,以期為臨床治療胃癌提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人胃癌細胞株HGC-27購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 試劑與儀器

紅景天苷,純度98%,上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品,批號B20504;順鉑標準品,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品,批號D8810;兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗鼠PI3K、Akt、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)、mTOR、磷酸化mTOR(phospho-mTOR,p-mTOR)、凋亡蛋白B細胞淋巴瘤因子-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-associated X protein,Bax)多克隆抗體、山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG),為北京雅安達生物科技有限公司產(chǎn)品,批號依次為BL005B、063578、80023、EIA06086H、l063572、20088、12228、2358412、H326551;RPMI細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶,為杭州百萊博科技有限公司產(chǎn)品,批號4478359、A3161001C、25200114。BD FACSAria Ⅱ型流式細胞儀,上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品;CFX384 Touch型實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)儀,美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)

將人胃癌HGC-27細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(含有100 mL /L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素),置于37 ℃、含有50 mL /L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱,隔天傳代,選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞分組與給藥

將人胃癌細胞分為空白組、紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組,顯微鏡下確認細胞生長良好且密度適宜后加藥。紅景天苷組加入含有40 μmol/L紅景天苷的培養(yǎng)液,順鉑組加入含有10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)液,聯(lián)合組加入含有40 μmol/L紅景天苷和10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)液,空白組為等量完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測指標

1.5.1 細胞活力

采用四甲基噻唑藍(MTT)法檢測。取對數(shù)生長期人胃癌HGC-27細胞進行實驗,以2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞,調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL,將細胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h。設(shè)置5個復(fù)孔,每孔加入20 μL MTT溶液,置入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。于酶聯(lián)免疫檢測儀540 nm處檢測各孔吸光(OD)值。每組實驗重復(fù)3次,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組OD值/空白組OD值)×100%

1.5.2 細胞周期

采用流式細胞儀檢測。用胰蛋白酶消化HGC-27細胞,制備細胞懸液(濃度為1×105個/mL),按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌細胞3次,將細胞接種于6孔板內(nèi),體積分數(shù)為750 mL /L乙醇固定,加入10 μL碘化丙啶溶液避光孵育60 min。在波長488 nm處檢測熒光強度,觀察并分析細胞各周期分布情況。每組實驗重復(fù)3次。

1.5.3 細胞遷移能力

采用劃痕實驗檢測。使用標記筆于6孔板背后均勻畫橫線(間隔約5 mm),將人胃癌細胞(濃度調(diào)整為5×105個/mL)接種于6孔板中,按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h,待細胞鋪滿后使用200 μL無菌移液槍頭對細胞垂直劃線(1 mm × 20 mm),沖洗散落細胞繼續(xù)培養(yǎng),于0、24 h拍照并計算遷移率。每組實驗重復(fù)3次。細胞遷移率(%)=(0 h邊緣距離-24 h邊緣距離)/0 h邊緣距離

1.5.4 細胞侵襲能力

采用Transwell小室實驗檢測。將人胃癌HGC-27細胞按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h,接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠稀釋液的Transwell小室上室中(無血清培養(yǎng)液100 μL),細胞濃度為1×105個/mL;再將500 μL含血清培養(yǎng)液加入下室,恒溫培育24 h。取出Transwell小室,磷酸鹽緩沖溶液清洗3次,用40 g/L多聚甲醛固定20 min,滴加1 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min,光學顯微鏡下拍照觀察并計數(shù)細胞數(shù)目。每組實驗重復(fù)3次。

1.5.5 PI3K、Akt和mTOR mRNA表達

采用實時PCR法檢測。取對數(shù)生長期人胃癌HGC-27細胞,按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h,按照TRIzol試劑盒說明書操作提取總RNA,再進行反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補DNA。配制PCR反應(yīng)體系20 μL,設(shè)置反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性25 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。根據(jù)2-△△CT法計算目的基因與內(nèi)參基因的相對表達量。每組實驗重復(fù)3次,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.6 PI3K、Akt和mTOR蛋白表達

采用免疫蛋白印跡法檢測。收集對數(shù)生長期人胃癌HGC-27細胞,按照1.4項下方法給藥并培養(yǎng)24 h,接種于培養(yǎng)皿中,貼壁培養(yǎng),加入500 μL 細胞裂解液提取總蛋白。蛋白定量法檢測蛋白濃度,蛋白上樣量40 μg,加入配制好的分離膠與濃縮膠,恒壓80 V電泳至Marker條帶分離清晰,恒壓120 V電泳至溴酚藍到達底部。轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上,加入5%脫脂奶粉搖床封閉2 h,TBST沖洗后加入1∶1 000稀釋一抗,4 ℃孵育過夜,再次使用TBST沖洗后加入1∶3 000稀釋二抗搖床封閉2 h,清洗,滴加化學發(fā)光劑顯影。每組實驗重復(fù)3次,采集圖像,以β-actin為內(nèi)參,觀察并分析條帶上相應(yīng)的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞活力對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組的人胃癌HGC-27細胞存活率均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組的細胞存活率降低(P<0.05)。紅景天苷組的人胃癌HGC-27細胞存活率與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組人胃癌HGC-27細胞活力對比

2.2 各組細胞凋亡率對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞凋亡率均升高(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞凋亡率升高(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞凋亡率與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

圖1 各組胃癌HGC-27細胞凋亡對比

表3 各組人胃癌HGC-27細胞凋亡率對比

2.3 各組細胞遷移率對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞遷移率明顯降低(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞遷移率降低(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞活力與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

圖2 各組人胃癌HGC-27細胞遷移情況(×200)

表4 各組人胃癌HGC-27細胞遷移率對比

2.4 各組侵襲細胞數(shù)目對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞侵襲數(shù)目減少(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞侵襲數(shù)目與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5、圖3。

表5 各組人胃癌HGC-27細胞侵襲數(shù)目對比

空白組:受到侵襲的細胞數(shù)目最多。紅景天苷和順鉑組:細胞侵襲數(shù)目明顯減少。聯(lián)合組:細胞侵襲數(shù)目最少。圖3 各組人胃癌HGC-27細胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色,×100)

2.5 各組PI3K、Akt、mTOR mRNA水平對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA水平降低(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA水平與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組人胃癌HGC-27細胞中PI3K mRNA、Akt mRNA和mTOR mRNA水平對比

2.6 各組PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平明顯降低(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7、圖4。

A.空白組;B.紅景天苷組;C.順鉑組;D.聯(lián)合組圖4 各組人胃癌HGC-27細胞PI3K/Akt/mTOR通路蛋白Western blot條帶圖

表7 各組人胃癌HGC-27細胞中PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平對比

2.7 各組凋亡蛋白水平對比

與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)。與紅景天苷組和順鉑組對比,聯(lián)合組人胃癌HGC-27細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)。紅景天苷組人胃癌HGC-27細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達水平與順鉑組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表8、圖5。

A.空白組;B.紅景天苷組;C.順鉑組;D.聯(lián)合組圖5 各組HGC-27細胞凋亡蛋白Western blot條帶圖

表8 各組人胃癌HGC-27細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達水平對比

3 討 論

目前胃癌的發(fā)病機制尚未明確,因早期癥狀多表現(xiàn)為燒心、進食后腹脹不適、劍突下隱痛、大便發(fā)黑等易被忽略的癥狀,常被患者忽略導致錯過最佳治療時期[6]。目前有手術(shù)、放療、化療和中藥治療等多種治療方式,其中手術(shù)和放化療雖效果明顯,但有風險高和并發(fā)癥多等弊端,抗腫瘤藥物更是因毒副作用給患者帶來很大壓力。因此探究該病的發(fā)病機制,尋找更為有效且毒副作用小的藥物對胃癌治療有著重大意義。

順鉑可以抑制細胞增殖并促進凋亡,在多種惡性腫瘤的治療中起著關(guān)鍵作用,與天然藥物聯(lián)用療效顯著[7]。紅景天是景天科紅景天屬草本植物,屬補虛藥物,具有益氣活血、通脈平喘、清肺止咳等功效[8-9]。紅景天的有效成分包括紅景天苷、苷元酪醇、紅景天素等,其中紅景天苷已被廣泛用于抗腫瘤的研究中[10]。紅景天苷可以通過激活腫瘤細胞自噬相關(guān)通路而提高自噬水平[11],調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路抑制細胞增殖活性[12],從而發(fā)揮抗癌作用。本研究結(jié)果顯示,在MTT實驗、流式細胞術(shù)、劃痕實驗、Transwell小室實驗中,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組細胞的細胞活力、細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)與空白組對比均處于下降趨勢,細胞凋亡率升高,提示紅景天苷和順鉑抑制胃癌細胞HGC-27生長活性并促進其凋亡,兩者聯(lián)用時抑制作用更為明顯。這與孫新利等[13]發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以抑制胃癌細胞增殖結(jié)論一致。

細胞凋亡過程是細胞內(nèi)一系列基因的激活、表達及調(diào)控共同作用的結(jié)果,其中凋亡誘導因子與抗凋亡因子發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路是細胞內(nèi)重要轉(zhuǎn)導途徑,參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學功能,當其相關(guān)分子水平異常時對腫瘤細胞的發(fā)展與凋亡影響顯著[14]。正常生理條件下,Akt并無活性,在受到信號刺激后其磷酸化蛋白高度表達,促進上游因子PI3K磷酸化高度表達并募集到細胞膜,激活下游mTOR蛋白,通過PI3K/Akt/mTOR信號通路提高凋亡因子Bal-2表達水平,并通過Bal-2/Bax比例影響抗凋亡因子Bax水平,從而提高腫瘤細胞生存活力,減少凋亡的發(fā)生[15]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt與胃癌細胞遷移和侵襲息息相關(guān),抑制該信號通路可有效降低腫瘤轉(zhuǎn)移[16];PI3K/Akt信號通路的異常激活與腫瘤的多種生物學行為有關(guān)[17]。在本研究中,與空白組對比,紅景天苷組、順鉑組和聯(lián)合組細胞中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達水平及PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平均降低,而凋亡蛋白Bal-2水平降低,抗凋亡蛋白Bax水平升高。表明紅景天苷和順鉑可能通過抑制HGC-27細胞內(nèi)Akt、mTOR蛋白磷酸化水平,阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路,結(jié)合細胞中Bal-2、Bax蛋白表達水平,說明紅景天苷和順鉑可以誘導胃癌細胞凋亡,與以上報道結(jié)果一致。

綜上所述,紅景天苷對胃癌細胞HGC-27增殖、遷移和侵襲有一定的抑制作用,并能有效促進細胞凋亡,聯(lián)合順鉑可以提高療效,可能是通過抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化水平阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮作用。