白 超, 楊雯雯, 祁光偉, 楊柳雨, 羅 軍, 劉 濤

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1血管甲狀腺外科, 2干部保健中心綜合內(nèi)二科, 烏魯木齊 830054;新疆醫(yī)科大學(xué)3公共衛(wèi)生學(xué)院, 4公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)博士后科研流動站, 烏魯木齊 830017)

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤。近幾十年來,PTC的發(fā)病率在全球急劇上升,尤其是病變直徑≤1 cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)[1]。部分學(xué)者認為,PTMC患者病灶生長緩慢,甚至可以帶癌生存,對該類患者可進行隨訪觀察,但也有一部分學(xué)者認為,不是所有的PTMC都是惰性,有相當(dāng)一部分的PTMC很早就發(fā)生局部侵犯、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,甚至遠處轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象,威脅患者生命[1]。目前,臨床工作中術(shù)前的常規(guī)檢查無法區(qū)分甲狀腺腫瘤的侵襲能力,亟需在避免過度治療和對侵襲性強的腫瘤及時手術(shù)中尋找一個平衡點[2-4],致使判斷甲狀腺腫瘤的侵襲性變得至關(guān)重要。近年來,隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的發(fā)展,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)一系列非編碼RNA[5]。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)具有高度保守性、組織時序性和疾病特異性,是一種天然的生物學(xué)標(biāo)記物[6],它的產(chǎn)生受特定順式調(diào)節(jié)元件和反式作用因子的調(diào)控[7]。有研究表明,CircRNA與胰腺癌[8]、膀胱癌[9]、胃癌[10]和肺癌[11]等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),其在疾病的治療方面也取得了一定的進展[12]。CircRNA具有吸附miRNA的作用,miRNA作用于mRNA,最終形成CircRNA/miRNA/mRNA信號通路,調(diào)控疾病的發(fā)生與發(fā)展[13-14]。近年來,也有甲狀腺癌與circRNA相關(guān)的文獻報道[15-16]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),circRNA_000121在PTMC伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(中央?yún)^(qū))[ PTMC(L)]中呈高表達,并各選取10例標(biāo)本進行qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn),circRNA_000121有望成為PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記物。本研究旨在通過qRT-PCR檢測PTMC血標(biāo)本、組織標(biāo)本的circRNA、miRNA和mRNA,分析circRNA_000121在PTMC伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用,為臨床手術(shù)提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2022年1-4月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科住院的60例患者為研究對象。其中PTMC伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(中央?yún)^(qū))[PTMC(L)組]患者30例,PTMC不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(PTMC組)患者30例。收集所有患者術(shù)前外周血標(biāo)本、術(shù)中甲狀腺癌組織及一般資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理證實為病灶直徑≤1 cm的PTMC;(2)年齡>18歲;(3)首次手術(shù)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有明確甲狀腺病史的患者;(2)有甲狀腺手術(shù)史者;(3)術(shù)前口服甲狀腺藥物治療者;(4)妊娠期患者;(5)肝腎功能異?；颊?(6)其他惡性腫瘤患者。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批(審批號:S20211106-01)。已充分告知患者及家屬相關(guān)情況,并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)(美國Yeasen公司,批號:11202ES08);HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(批號:R323-01)、Ribonuclease Inhibitor(貨號:R301-03)、M-MLV Reverse Transcriptase(批號:R011-01)均購自美國Vazyme公司;dNTP Mix (10 mM each)(美國Fermentas公司,批號:R0192);One-Step gDNA Removal and cDNA(美國Transgene公司,批號:AT311-03);Q-PCR儀器(美國ABI公司,貨號:QuantStudio 5);PCR儀(美國BIO-RAD公司,貨號:mycycler);渦旋儀(貨號:MX-F)、掌上離心機(貨號:D1008E)購自美國SCILOGEX公司;微孔板振蕩器(貨號:MIX-1500)、微孔板迷你離心機(貨號:Mini-P25)購自杭州米歐儀器有限公司;GraphPad Prism軟件(美國CA公司,版本號:8.0)。

1.3 實驗方法采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在thermocycle儀器上進行cDNA合成,反轉(zhuǎn)錄條件:42℃,5 min;37℃,15 min;85℃,5 s。在ABI Quant Studio 5儀器上進行qPCR反應(yīng),95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火延伸1 min,共進行40個循環(huán)。每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參基因,進行標(biāo)準(zhǔn)化,使用RQ=2-ΔΔCt計算每個轉(zhuǎn)錄本mRNA的相對表達量。引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,見表1。

表1 引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料的比較PTMC組和PTMC(L)組患者在性別、年齡方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料的比較

2.2 兩組患者circRNA_000121、miRNA-146b-3p及MMP2的表達水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示,與PTMC組患者比較,PTMC(L)組患者外周血和組織標(biāo)本中circRNA_000121、MMP2呈高表達,miRNA-146b-3p呈低表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),見表3。

表3 circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平比較

2.3 兩組患者circRNA_000121對PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測經(jīng)ROC分析結(jié)果顯示,外周血曲線下面積(AUC)為0.964,置信區(qū)間(95%CI)0.915～1.000,靈敏度0.933,特異度1.000,約登指數(shù)0.933。組織標(biāo)本AUC為0.943,置信區(qū)間(95%CI)0.874～1.000,靈敏度0.900,特異度0.967,約登指數(shù)0.867,見圖1。

外周血

2.4 circRNA_000121、miRNA-146b-3p、MMP2與PTMC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示,circRNA_000121、miRNA-146b-3p、MMP2在外周血和癌組織中的表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),見表4。

表4 外周血與PTMC組織中circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平的Logistic回歸分析

3 討論

本課題組在前期研究中納入3例PTMC和PTMC(L)患者術(shù)前外周血標(biāo)本,通過circRNA芯片檢測,篩選出差異顯著且差異倍數(shù)>2的circRNA,并在原實驗標(biāo)本上進行qRT-PCR驗證。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示,與PTMC患者比較,circRNA_000121和MMP2在PTMC(L)患者的外周血和甲狀腺癌組織的表達升高,miRNA-146b-3p在PTMC(L)患者的外周血和甲狀腺癌組織的表達降低,組織與外周血標(biāo)本中表達一致。提示PTMC患者可在外周血標(biāo)本中篩查circRNA_000121是否發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本研究初步驗證了circRNA_000121有望成為甲狀腺腫瘤侵襲性的標(biāo)志物,ROC曲線檢測說明外周血中其表達水平可初步判斷PTMC的侵襲性。實驗結(jié)果表明,miR-146b-3p在PTMC(L)呈低表達,下游的MMP2在PTMC(L)呈高表達狀態(tài)。二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示,外周血和甲狀腺癌標(biāo)本中circRNA_000121、miRNA-146b-3p和MMP2表達水平與PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。說明上述分子可作為PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的明星分子,為臨床提供指導(dǎo)。然而,關(guān)于miR-146b-3p及其下游靶基因的研究很少。

有研究顯示,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用,是癌癥的治療靶點之一[17]。MMPs屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶家族,能夠降解細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的成分。MMPs在ECM重塑中具有組織形態(tài)發(fā)生、生長、組織修復(fù)和血管生成等作用,參與細胞增殖、遷移、分化、血管生成和凋亡等生理環(huán)節(jié)[18]。有研究顯示,在多種癌癥亞型中,MMP的失調(diào)在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中具有雙重作用,在侵襲性癌癥中具有治療潛力,其表達譜是多種人類疾病的一種新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[19]。因此,調(diào)控MMP2的表達水平或其功能可能是包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的潛在治療靶點。Bai等[20]研究發(fā)現(xiàn),circRNA_ 004183在PTMC(L)血標(biāo)本中呈高表達,后期小樣本驗證亦表明circRNA_ 004183可作為PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的明星分子,為PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分子機制研究提供支持。Dai等[21]通過體內(nèi)、外實驗研究circAGTPBP1在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)進展中的生物學(xué)功能后發(fā)現(xiàn),在PTC組織和細胞中,circAGTPBP1呈上調(diào),其表達與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期呈正相關(guān),敲除circAGTPBP1可抑制PTC細胞系的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移,抑制體內(nèi)PTC的生長。表明circAGTPBP1可能是PTC腫瘤的促進因子,可以成為PTC的潛在治療靶點。

綜上所述,PTMC(L)組患者外周血和組織標(biāo)本中circRNA_000121均呈高表達,可能是其下游的miRNA與mRNA。本研究不足之處是未進行相關(guān)細胞表型實驗、雙熒光素酶實驗等。后期將開展相關(guān)研究,明確PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的信號通路,為PTMC發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及治療靶點提供分子機制的支持。