王曉娟, 熊文娟, 宮海燕

(1新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院檢驗科, 烏魯木齊 830011; 2廣東醫(yī)科大學附屬東莞第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心, 廣東 東莞 523000)

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的一種發(fā)病率高、傳染性強、致死率高的慢性傳染病,主要通過呼吸道傳播,潛伏期長,易于傳播,是全球第二大因單一傳染病原導致的致死性傳染病,嚴重威脅人類健康[1]。WHO發(fā)布的《2023年全球結核病報告》顯示截至2022年全球約有1 060萬人(95%UI:990～1 140萬)患結核病,新診斷并報告結核病患者數(shù)為750萬例,比2021年和2020年分別增長17.2%和29.3%[2]。由于MTB有天然的細胞壁屏障和藥物外排泵系統(tǒng),治療過程中存在治療周期長、患者依從性差及用藥不規(guī)范等問題,使得MTB的治療十分困難,加之編碼藥物靶標的基因突變導致全球結核病控制面臨極大的挑戰(zhàn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)MTB生物被膜的形成是MTB出現(xiàn)耐藥性的一個重要因素,MTB可在肺組織的干酪樣壞死空洞中及臨床生物材料上形成生物被膜,導致臨床治療有效率下降[4]。Rv0024基因參與MTB生物被膜的形成,增加MTB細胞壁表面疏水性,通過表面粘附定殖后分泌大量細胞外基質(zhì)、胞外多糖,形成不利于抗生素擴散的不滲透層,從而增強MTB的耐藥性[5]。Rv2872基因通過調(diào)控生物被膜合成相關基因的轉(zhuǎn)錄而影響生物被膜的合成,同時改變胞內(nèi)氨基酸含量和細胞壁結構,調(diào)控MTB的生長[6-7]。Ra1362基因編碼二鳥苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclase,DGC)合成環(huán)二鳥苷酸(Cyclic diguanylate monophosphate, c-di-GMP),通過感應缺氧或氧化還原壓力調(diào)控生物被膜的發(fā)育[8-9]。本課題組前期研究表明,新疆藿香揮發(fā)油的主要成分(R)-(+)-長葉薄荷酮,可顯著抑制耐藥大腸埃希菌的生長及其生物被膜的形成[10-13]。本研究探索(R)-(+)-長葉薄荷酮對耐藥MTB的抑菌活性及其生物被膜調(diào)控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的影響,為生物被膜介導的耐藥MTB的防治提供研究基礎,現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器Tanon 2500型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);DYY-6C型電泳儀電源(北京市六一儀器廠);DYCZ-21型電泳槽(北京市六一儀器廠);GL-88B型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Nano-100型微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司);MyCycler Thermal CyclerPCR儀(美國Bio-Rad公司);7500 FastReal Time PCR instrument(美國應用生物系統(tǒng)公司);BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀(美國BD公司)。

1.2 菌株以臨床篩選的耐藥性MTB-1作為試驗菌株,保存于烏魯木齊市疾病預防控制中心實驗室。

1.3 材料瓊脂糖(上海生工公司,批號A610013-0250);核酸染料(上海生工公司,批號NB6695);2X SanTaq PCR Mix (上海生工公司,批號B532061);M5 HiClear DL2000 DNA marker(北京聚合美公司,批號MF025);2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)(北京全式金公司,批號AS111);T7 High Efficiency Transcription Kit(北京全式金公司,批號JT-101-01);5X All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)(加拿大abm公司,批號G492);Middlebrood 7H9肉湯基礎(北京索萊寶科技有限公司,批號215O031);刃天青(北京索萊寶科技有限公司,批號R8150);甘油(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,批號SHBK7273);OADC添加劑(青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司,批號20220123);長葉薄荷酮(北京伊諾凱科技有限公司,批號A0420276);DMSO(蘇州瑞諾德生物科技有限公司,批號EZ7890C145);結核DNA型提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司,批號22051201)。

2 方法

2.1 生物被膜介導的耐藥MTB的選取對臨床篩選出的耐藥MTB的DNA進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,確定試驗菌株含生物被膜調(diào)控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362,將其命名為MTB-1,對引物分別采用51℃、54.7℃、57.4℃、60℃為退火溫度進行PCR實驗。各PCR引物序列見表1,PCR擴增體系見表2,PCR擴增程序見表3。

表1 引物序列

表2 PCR擴增體系

表3 PCR擴增程序

2.2 PCR產(chǎn)物的電泳檢測將PCR產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠孔中,120 V電壓30 min,采用Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)紫外透射光下觀察。

2.3 菌液的制備將凍存菌株從-80℃冰箱取出接種于羅氏中性培養(yǎng)基上,放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,待長出菌落后用無菌棉簽從斜面刮取菌落,用無菌生理鹽水振蕩磨菌,使菌塊分散均勻,靜置5～10 min。用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1麥氏濃度,用10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基將菌液稀釋10、100倍。

2.4 (R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1抑菌活性(MIC和MBC)的測定在無菌96孔板第1～5列每孔加入100 μL含10% OADC的7H9液體培養(yǎng)基,第1列每孔加100 μL 4倍稀釋的(R)-(+)-長葉薄荷酮原液(947 mg/mL),連續(xù)倍比稀釋至第5列,藥物終濃度為7.39～118.38 mg/mL。每孔加入100 μL菌液,重復3個孔。陰性對照孔加入100 μL培養(yǎng)基和100 μL菌液,空白對照孔加入200 μL培養(yǎng)基,周邊孔內(nèi)加入200 μL生理鹽水以防止培養(yǎng)過程中96孔板的蒸發(fā)。用封口膜密封后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后各孔加20 μL過濾除菌的0.1 g/L刃天青顯色劑,孵育24 h,記錄顏色變化,用以判斷MTB-1生長情況和藥物的抑菌作用效果。

2.5 液體培養(yǎng)計數(shù)法檢測(R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1的抑菌活性(MIC和MBC)在96孔板中分別加入(R)-(+)-長葉薄荷酮各100 μL(118.38 mg/mL),倍比稀釋6個濃度梯度后,每孔加入100 μL菌液,陰性對照孔加入100 μL培養(yǎng)基和100 μL菌液,空白對照孔加入200 μL培養(yǎng)基。封口膜封口培養(yǎng)7 d后,每3個平行孔各取50 μL接種于含液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中,放入BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定儀中培養(yǎng)42 d,自動監(jiān)測菌落數(shù)。

2.6 (R)-(+)-長葉薄荷酮對基因Rv0024、Rv2872、Ra1362表達的影響取(R)-(+)-長葉薄荷酮干預前后的菌液,按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA,經(jīng)RNA合成后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,完成RT-PCR反應:按照表4配制轉(zhuǎn)錄體系,用移液槍輕輕混勻并離心,37℃孵育2 h。反應結束后加入2 μL DNaseⅠ,37℃反應30 min。用核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度,按照表5配置反應體系進行cDNA合成,混勻后37℃反應15 min,60℃反應10 min,95℃反應3 min。結束反轉(zhuǎn)錄后將得到的cDNA置于-80℃保存,使用RNase-free Water按照1∶1稀釋樣本cDNA后進行熒光定量檢測。RT-PCR檢測引物見表6,RT-PCR體系見表7,RT-PCR程序見表8。

表4 RNA轉(zhuǎn)錄體系

表5 cDNA合成配置體系

表6 RT-PCR檢測引物

表7 RT-PCR體系

表8 RT-PCR程序

3 結果

3.1 生物被膜介導的耐藥MTB的鑒定耐藥MTB的DNA經(jīng)PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選MTB-1可擴增出Rv0024、Rv2872、Ra1362基因產(chǎn)物,即生物被膜介導的耐藥MTB菌株,作為本研究的實驗菌株,命名為MTB-1。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示,Marker從上至下依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp,圖中所有引物均能擴增出目的條帶,PCR產(chǎn)物條帶大小均符合表1標準,顯示亮帶。

圖1 MTB-1生物被膜調(diào)控基因的PCR電泳圖

3.2 (R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1的體外抑菌活性刃天青染色24 h后陰性對照孔由藍色變?yōu)榉凵?表明實驗菌株MTB-1生長狀況良好,96孔板顯色結果表明MIC濃度為14.79 mg/mL,MBC濃度為29.59 mg/mL,見圖2。根據(jù)BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定儀結果,(R)-(+)-長葉薄荷酮分別在3×107CFU/mL和3×106CFU/mL濁度下,其MBC濃度為24.62 mg/mL,MIC90濃度為19.89 mg/mL,見表9。

注：C1-C5分別為118.38、59.19、29.59、14.79、7.39 mg/mL濃度的(R)-(+)-長葉薄荷酮;陰為陰性對照,空白為空白對照。實線框表示3×107 CFU/mL的菌液濃度,虛線框表示3×106 CFU/mL的菌液濃度?！?”表示細菌未生長,“+”表示細菌生長;“#”為純菌液,“○”為培養(yǎng)基。

表9 (R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1菌落數(shù)的影響

3.3 (R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1生物被膜調(diào)控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362表達的影響與干預前比較,干預后MTB-1生物被膜調(diào)控基因Rv0024和Ra1362的表達量降低,Rv2872的表達量升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表10。

表10 (R)-(+)-長葉薄荷酮對MTB-1基因Rv0024、Rv2872、Ra1362表達的影響

4 討論

生物被膜的形成可導致抗菌劑治療的失敗,約80%的人類細菌性慢性炎癥和感染性疾病與細菌生物被膜相關,面對日益增長的耐藥性威脅,需要更高效的藥物來有效控制結核病的進展[14]。研究發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥卡泊芬可影響MTB生物被膜關鍵成分胞外DNA和脂質(zhì)的聚集,抑制MTB生物被膜的形成[15]。肽基-脯氨酰異構酶-B(PpiB)是參與MTB生物被膜形成的潛在藥物靶標,環(huán)孢菌素A可直接結合PpiB并破壞生物膜形成[16]。中藥對生物被膜介導的耐藥MTB也有較好的防治作用,如瑤山南星中的有效成分可通過調(diào)控Pks1基因進而抑制MTB生物被膜的形成[17-18]。通過對部分中草藥進行抗MTB活性與干預生物被膜生長活性篩選試驗發(fā)現(xiàn),苦參能有效抑制MTB生物被膜的形成[19];黃連素可通過抑制UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮轉(zhuǎn)移酶(MurA)使MTB生物被膜的形成能力以和穩(wěn)定性下降[20]。

綜合基因Rv0024、Rv2872、Ra1362在MTB生物被膜形成過程中的不同作用,本研究將Rv0024、Rv2872、Ra1362作為耐藥性MTB的出發(fā)點,采用刃天青染色法和液體培養(yǎng)計數(shù)法,檢測(R)-(+)-長葉薄荷酮對生物被膜介導的耐藥MTB的體外抑制作用,兩種方法可作為MTB藥物敏感試驗的參考檢測方法。分子學檢測表明長葉薄荷能夠抑制Rv0024、Ra1362的表達,促進Rv2872的表達,從而影響耐藥MTB生物被膜的形成。本研究明確了(R)-(+)-長葉薄荷酮對生物被膜介導耐藥MTB的體外抑制作用及其對生物被膜調(diào)控基因Rv0024、Rv2872、Ra1362的影響,為探究(R)-(+)-長葉薄荷酮對生物被膜介導的MTB的耐藥分子學機制提供實驗基礎。