張 桓, 褚瑞海, 薛 琦, 路 真

(1濰坊醫(yī)學(xué)院, 山東 濰坊 261000; 2濰坊市人民醫(yī)院感染科, 山東 濰坊 261000)

新生兒呼吸窘迫綜合征(Respiratory distress syndrome,RDS),又稱(chēng)為成熟不良肺綜合征(Infant respiratory distress syndrome,IRDS),是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的新生兒疾病,通常發(fā)生于早產(chǎn)兒或胎齡較小的新生兒[1-2]。RDS的發(fā)病涉及肺發(fā)育不成熟、胎兒肺泡膜發(fā)育不良、肺表面活性物質(zhì)生成不足等多種因素[3],但其具體的分子機(jī)制仍未完全闡明。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA,能夠通過(guò)與目標(biāo)mRNA的相互作用,參與調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過(guò)程[4]。miRNA在肺部發(fā)育和肺泡表面活性物質(zhì)合成等過(guò)程中有重要的調(diào)節(jié)作用,而肺部發(fā)育不成熟和肺泡表面活性物質(zhì)不足是RDS的重要原因。研究表明,許多miRNA,例如miRNA-141參與了肺泡發(fā)育和細(xì)胞分化過(guò)程的調(diào)節(jié)[5],這些miRNA可能通過(guò)與其他基因或轉(zhuǎn)錄因子相互作用,影響細(xì)胞的增殖、分化和功能,間接影響肺泡表面活性物質(zhì)的合成與分泌[6]。另外,miRNA還可通過(guò)影響機(jī)體氧化應(yīng)激損傷而參與RDS的發(fā)生和發(fā)展[7]。本研究分析RDS新生患兒和健康新生兒血漿中miRNAs的差異表達(dá)譜,篩選出差異最為明顯的miRNAs,并分析其與血?dú)庵笜?biāo)、心肌損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的關(guān)系,以其尋找RDS潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

1 方法

1.1 研究對(duì)象選擇2021年1月-2023年1月濰坊市人民醫(yī)院收治的68例RDS新生患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《實(shí)用兒科學(xué)(第5版)》中有關(guān)新生兒RDS診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)出生后12 h內(nèi)發(fā)生呼吸窘迫;(3)患兒在本院分娩并完成全程治療;(4)單胎妊娠;(5)足月分娩;(6)臨床資料完整,且監(jiān)護(hù)人對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并存在其他重要器官?lài)?yán)重的功能障礙;(2)住院期間死亡;(3)重度窒息;(4)合并先天性畸形、先天性疾病或遺傳學(xué)疾病。另外選擇同期在濰坊市人民醫(yī)院出生的15例年齡、性別匹配的健康新生兒為對(duì)照。兩組新生兒的性別、年齡、體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)(批號(hào):2019KL0016)。

1.2 血漿樣本采集抽取68例RDS新生患兒及15例健康新生兒晨起空腹肘靜脈血10 mL,離心(1 500 g,10 min)分離血清,留存血漿,保存于-80℃冰箱。

1.3 RNA-seq測(cè)序隨機(jī)選取6例RDS新生患兒及6例健康新生兒血漿,使用NanoPhotometer?分光光度計(jì)、Qubit?2.0熒光光度計(jì)和Agilent 2141 RNA Nano 6000分析試劑盒從血漿中提取總RNA。使用NextSeq測(cè)序平臺(tái)上的SE50測(cè)序程序?qū)细竦腄NA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,以獲得高質(zhì)量的序列讀數(shù)。通過(guò)Bowtie對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行清理并與參考基因組進(jìn)行比對(duì),并使用miRDeep2軟件鑒定miRNAs。DESeq分析得到差異表達(dá)的miRNAs,篩選標(biāo)準(zhǔn)為Q值<0.05,|log2 fold change|>2。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)血漿miRNAs提取血漿總RNA,反轉(zhuǎn)錄后在CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件為95℃變性20 s,然后95℃變性10 s,60℃變性20 s,70℃變性10 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 血?dú)庵笜?biāo)、心肌損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)血?dú)庵笜?biāo):用血?dú)夥治鰞x測(cè)定患兒動(dòng)脈血氧分壓(Partial pressure of oxygen,PaO2)。二氧化碳分壓(Partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)、吸氧分?jǐn)?shù)(Fraction of oxygen uptake,FiO2)。PaO2/FiO2為氧合指數(shù),是動(dòng)脈血氧分壓與吸入氧氣濃度的比值,用于反映人體外周血液中的氧氣含量。心肌損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo):用酶標(biāo)儀檢測(cè)患兒血漿肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(Lactic?dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平。

2 結(jié)果

2.1 RDS新生患兒血漿中miRNAs的差異表達(dá)RDS新生患兒與健康新生兒血漿中共1 230種差異表達(dá)miRNAs,其中693種表達(dá)上調(diào),537種表達(dá)下調(diào)。miRNA-200b及miRNA-449差異表達(dá)倍數(shù)>20,是差異性表達(dá)最顯著的miRNAs。見(jiàn)圖1。

注: A, 層級(jí)聚類(lèi)圖; B, 火山圖。

2.2 差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證隨機(jī)選擇2種顯著高表達(dá)(miRNA-200b、miRNA-449)、2種顯著低表達(dá)(miRNA-596、miRNA-30c)、2種無(wú)明顯差異表達(dá)(miRNA-696、miRNA-888-3p)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,表明測(cè)序結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性。見(jiàn)圖2和表2。

注: *P<0.05。

表2 差異miRNAs的驗(yàn)證

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)RDS新生患兒血漿miRNA-200b及miRNA-449的表達(dá)水平出院后1個(gè)月時(shí)RDS新生患兒血漿miRNA-200b及miRNA-449的表達(dá)水平均低于發(fā)作期和出院時(shí)(P<0.05),且出院時(shí)水平低于發(fā)作期(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖3。

注:與發(fā)作期比較, *P<0.05;與出院時(shí)比較, #P<0.05。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)RDS新生患兒血漿miRNA-200b及miRNA-449的表達(dá)水平

2.4 血漿miRNA-200b、miRNA-449對(duì)RDS的診斷價(jià)值ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示,血漿miRNA-200b、miRNA-449診斷RDS的曲線(xiàn)下面積(Area under curve,AUC)分別為0.702(95%CI:0.632～0.796)、0.763(95%CI:0.625～0.843), 靈敏度分別為73.6%、76.9%,特異度分別為69.8%、72.8%。見(jiàn)圖4。

圖4 血漿miRNA-200b、miRNA-449診斷RDS的ROC曲線(xiàn)

2.5 血漿miRNA-200b、miRNA-449與RDS新生患兒血?dú)庵笜?biāo)的相關(guān)性分析血漿miRNA-200b與miRNA-449相對(duì)表達(dá)水平分別與PaO2、PaO2/FiO2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),分別與PaCO2、FiO2呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 血漿miRNA-200b、miRNA-449與RDS新生患兒血?dú)庵笜?biāo)的相關(guān)性分析

2.6 血漿miRNA-200b、miRNA-449與RDS新生患兒心肌損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性miRNA-200b、miRNA-449分別與CK-MB、LDH、MDA呈正相關(guān)(P<0.05),分別與SOD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 miRNA-200b、miRNA-449與RDS新生患兒心肌損傷指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

miRNAs通過(guò)影響肺泡表面活性物質(zhì)合成和肺部免疫炎癥反應(yīng),參與RDS的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。本研究對(duì)RDS新生患兒血漿進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)miRNAs有明顯變化,其中miRNA-200b、miRNA-449表達(dá)水平明顯升高,且差異表達(dá)倍數(shù)>20倍。另外,隨著RDS病情緩解,二者表達(dá)水平明顯下降。以上提示miRNA-200b、miRNA-449可能參與RDS的發(fā)生和發(fā)展。分析原因可能為:(1)肺泡上皮細(xì)胞miRNA-200b及miRNA-449表達(dá)水平升高可抑制肺泡上皮細(xì)胞的成熟和重建[9],此外,miRNA-200b可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,破壞肺泡上皮細(xì)胞的完整性和功能恢復(fù)[10];(2)miRNA-449通過(guò)促進(jìn)免疫炎癥損傷而加重肺組織損傷[11];(3)miRNA-200b可通過(guò)抑制NKX2.1基因表達(dá),影響肺泡上皮細(xì)胞的功能和肺發(fā)育[12-13];(4)miRNA-449可以通過(guò)抑制Bim和Bcl-2等凋亡相關(guān)基因表達(dá),損傷肺泡上皮細(xì)胞[14-15]。本研究ROC曲線(xiàn)分析還發(fā)現(xiàn),血漿miRNA-200b、miRNA-449診斷RDS的AUC分別為0.702、0.763,靈敏度分別為73.6%、76.9%,特異度分別為69.8%、72.8%,說(shuō)明二者對(duì)RDS的診斷有一定價(jià)值。

氧合功能指標(biāo)有助于評(píng)估RDA病情嚴(yán)重程度,并有助于預(yù)測(cè)患兒預(yù)后[16]。PaO2和PaO2/FiO2是評(píng)估肺氣體交換功能的指標(biāo),其水平降低表示氧氣無(wú)法充分進(jìn)入血液。本研究發(fā)現(xiàn),miRNA-200b及miRNA-449相對(duì)表達(dá)水平越高,患兒的PaO2、PaO2/FiO2越低,而PaCO2、FiO2越高,提示肺功能損傷越重。這是因?yàn)閙iRNA-200b和miRNA-449表達(dá)水平升高可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞功能障礙和肺泡結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而影響血氧飽和度[10-11]。本研究還發(fā)現(xiàn),miRNA-200b、miRNA-449分別與CK-MB、LDH、MDA呈正相關(guān),而分別與SOD呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明miRNA-200b和miRNA-449表達(dá)水平越高,患兒心肌損傷及氧化應(yīng)激強(qiáng)度就越重。隨著RDS病情進(jìn)展,患兒逐漸出現(xiàn)呼吸困難和低氧血癥,而持續(xù)存在的呼吸困難會(huì)導(dǎo)致患兒呼吸肌肥大,并增加胸腔內(nèi)的負(fù)壓[17]。這會(huì)進(jìn)一步影響心臟功能,導(dǎo)致心肌受損。低氧血癥可以導(dǎo)致心臟缺氧,也可能對(duì)心肌產(chǎn)生損傷。同時(shí),RDS可能導(dǎo)致新生兒處于氧合不良的狀態(tài),從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激加劇[18]。氧化應(yīng)激損傷會(huì)增加自由基釋放,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA產(chǎn)生損害,這一病理變化又會(huì)加重氧化應(yīng)激,造成惡性循環(huán)[19]。

綜上所述,RDS新生患兒血漿miRNAs有明顯異常表達(dá),其中miRNA-200b、miRNA-449差異較為顯著,二者與呼吸功能損傷、心肌損傷和氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。研究結(jié)果提示,miRNA-200b、miRNA-449有可能成為RDS的生物學(xué)標(biāo)志物,有助于該疾病的診治。本研究也存在一定的局限性,例如樣本量小、未對(duì)患者進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪(fǎng)、未分析miRNAs在RDS中的具體作用機(jī)制。未來(lái)需要開(kāi)展基礎(chǔ)研究,進(jìn)一步探討miRNA-200b、miRNA-449在RDS中的作用及機(jī)制。