田志,段王平,馬永勝,張城銘,衛(wèi)小春

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科,骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030001)

同種異體骨軟骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)是從組織供者獲得整塊軟骨和軟骨下骨來精確修補(bǔ)受損的關(guān)節(jié)軟骨,是一種針對(duì)局限性大塊關(guān)節(jié)軟骨損傷的有效治療方式[1]。主要用于青壯年大面積軟骨損傷以及微骨折、細(xì)胞治療失敗的軟骨損傷患者[2]。OCA具有不受供區(qū)取材限制、提供與損傷部位相同曲度的關(guān)節(jié)面、骨融合率高、臨床結(jié)果可靠等技術(shù)優(yōu)勢(shì),在軟骨損傷修復(fù)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[3-5]。但OCA的本質(zhì)是異體移植,涉及移植物的采集、處理、保存、運(yùn)輸、手術(shù)等一系列過程,保證其生物安全極其重要。OCA生物安全檢測(cè)是保證其生物安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié),包括供體生物安全檢測(cè),軟骨組織儲(chǔ)存、處理過程中的生物安全檢測(cè),受體的生物安全監(jiān)測(cè),軟骨移植過程中生物安全體系建設(shè)。本文對(duì)OCA修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的相關(guān)生物安全內(nèi)容綜述如下。

1 供體的生物安全

1.1 一般情況篩查

移植物供體的篩選過程應(yīng)非常嚴(yán)格,內(nèi)容包括：年齡、死因(現(xiàn)病史)、既往史(遺傳病史、傳染病史、慢性自身免疫疾病病史)、外傷及手術(shù)史,是否經(jīng)歷過關(guān)節(jié)手術(shù)甚至重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)治療;還要對(duì)供者四肢關(guān)節(jié)情況進(jìn)行評(píng)估,家族史等進(jìn)行調(diào)查[6];了解供者有無人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病(hepatitis C virus,HCV)、結(jié)核病或其他傳染性疾病的接觸史;有無非法藥物的濫用史、冶游史甚至同性性行為史;有無動(dòng)物飼養(yǎng)史、接觸史(特別是家禽類,如雞、鴨、鵝等;家畜類,如豬、羊、牛、狗及嚙齒類動(dòng)物等),為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室篩查提供依據(jù)[7]。對(duì)昏迷及死亡的供者需明確導(dǎo)致其昏迷或死亡的原因,包括：疫苗接種史、血制品應(yīng)用史、感染性疾病史、職業(yè)暴露史等。同時(shí)明確供者的五年內(nèi)旅居史,排除地方性感染暴露的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)地方性感染暴露史,需要采取針對(duì)性、目的性強(qiáng)的供者篩查手段或者受者預(yù)防措施來預(yù)防地方性傳染病及人畜共患疾病的傳播。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

1.2.1 一般常規(guī)檢測(cè) 對(duì)所有供者都應(yīng)常規(guī)檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和血常規(guī)。CRP是敏感但特異性不高的炎癥指標(biāo),CRP≥40 mg/L提示存在感染;≥100 mg/L提示有膿毒癥或侵襲性感染可能。血常規(guī)主要包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell,WBC)和分類計(jì)數(shù)(包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)和單核細(xì)胞)。對(duì)于WBC增多(≥10.0×109/L)或減少(≤3.0×109/L),或者出現(xiàn)“核左移”時(shí),提示可能有感染發(fā)生[8]。

1.2.2 病毒學(xué)檢測(cè) 由于病毒培養(yǎng)技術(shù)復(fù)雜、要求高,常見血源性傳播的病毒性疾病主要依靠血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。核酸檢測(cè)(nucleic acid tests,NAT)可用于發(fā)現(xiàn)常規(guī)血清學(xué)篩查漏診的感染[9-11]。關(guān)節(jié)軟骨供者需進(jìn)行篩查的血清學(xué)檢查包括：HIV抗體;HBV的血清學(xué)檢測(cè),包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;HCV抗體;梅毒螺旋體和非梅毒螺旋體檢測(cè)(螺旋體血球凝集試驗(yàn)或密螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)或熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)+快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn));巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)抗體;EB病毒(epstein-barr virus,EBV)抗體[9-11]。其他針對(duì)病毒感染傳染性疾病和人畜共患病可以進(jìn)行篩查的檢測(cè)包括：HIV、HCV和/或HBV的NAT;人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(human T-cell lymphotropic virus,HTLV-1/2)抗體;單純皰疹病毒IgG抗體;水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)抗體;西尼羅河病毒(west nile virus,WNV)的血清學(xué)檢測(cè)或NAT;球孢子蟲血清學(xué)、類園線蟲血清學(xué)和克氏錐蟲血清學(xué)檢測(cè);其他人畜共患疾病,如動(dòng)物源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染檢測(cè)[9-11]。

1.2.3 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) 2012年一項(xiàng)大樣本量骨移植物易感染性分析結(jié)果顯示：移植物細(xì)菌感染情況與骨軟骨組織采集團(tuán)隊(duì)的組織獲取經(jīng)驗(yàn)、組織采集時(shí)間及移植物來源相關(guān);高毒力致病菌(鏈球菌、大腸桿菌等)感染與供者死亡時(shí)間、ICU治療史、組織采集部位等相關(guān);低毒力致病菌與組織采集環(huán)境、方法、時(shí)間、消毒方式相關(guān)[12]。除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)外,血液學(xué)檢測(cè)還應(yīng)包括真菌感染以及特殊細(xì)菌感染檢測(cè)等：(1)降鈣素原(procalcitonin,PCT)：目前臨床常用的判斷膿毒血癥的生物標(biāo)記物,當(dāng)PCT≥2 μg/L時(shí),提示供體可能存在膿毒癥,同時(shí)PCT數(shù)值與感染嚴(yán)重程度正相關(guān);(2)(1,3)-β-D-葡聚糖試驗(yàn)(G試驗(yàn))：適用于深部真菌感染的早期診斷(不包括隱球菌和接合菌),敏感性較高但易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果(如鏈球菌血癥),只能提示有無真菌侵襲性感染,不能確定感染真菌種類,目前認(rèn)為其陰性預(yù)測(cè)值高;(3)半乳甘露聚糖試驗(yàn)(galactomannan,GM試驗(yàn))：為侵襲性曲霉菌感染的早期診斷提供依據(jù),臨床上通常與G試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè),可以提高對(duì)侵襲性真菌病的診斷能力;(4)隱球菌莢膜多糖抗原測(cè)定：新型隱球菌檢測(cè)的生物標(biāo)記物,可早期、快速診斷隱球菌感染;(5)γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assay,IGRAs)：對(duì)輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)有一定參考價(jià)值[8]。除以上血清學(xué)檢測(cè),還需對(duì)供體血液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè),同時(shí)記錄取材的關(guān)節(jié)軟骨大體觀察結(jié)果。

2 軟骨組織處理、儲(chǔ)存過程中的生物安全

軟骨采集、處理應(yīng)在具有骨軟骨采集、保藏資質(zhì)的保藏機(jī)構(gòu)、實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)療機(jī)構(gòu)中進(jìn)行,由具有器官、組織采集操作許可的專業(yè)人員操作。為了便于病原體檢測(cè),采集樣本應(yīng)包括：軟骨、骨組織收集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存過程中常規(guī)留取供者的外周血、血清及骨軟骨組織進(jìn)行病原微生物檢測(cè)或培養(yǎng);同時(shí)可考慮采集供者滑膜組織、關(guān)節(jié)液、松質(zhì)骨(部分椎體、髂骨)等標(biāo)本,積極尋找潛在的病原微生物,為后續(xù)監(jiān)測(cè)、治療提供指導(dǎo);軟骨-骨組織、軟骨-骨組織拭子、軟骨-骨組織保存液的細(xì)菌、真菌以及病毒培養(yǎng)也應(yīng)列為生物安全評(píng)估的常規(guī)檢查手段[9],但由于低毒力致病菌與組織采集污染相關(guān)性較高,其培養(yǎng)結(jié)果需結(jié)合血液學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果共同納入?yún)⒖紭?biāo)準(zhǔn)[12]。常規(guī)細(xì)菌微生物檢測(cè)方法包括：(1)直接涂片染色鏡檢：革蘭染色、抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色、六胺銀染色等能快速檢測(cè)所提供樣本中普通細(xì)菌、抗酸桿菌、查奴卡菌、新型隱球菌、肺孢子菌等可能的病原體信息,但確診仍需要進(jìn)一步診斷依據(jù);(2)培養(yǎng)：采集供者血液、關(guān)節(jié)液等無菌體液、骨軟骨組織保藏液、灌洗液及拭子等進(jìn)行細(xì)菌和真菌培養(yǎng);(3)基于核苷酸分子技術(shù)原理的病原菌快速檢測(cè)方法：如環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、微流控碟式芯片反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)、多重巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)。這些快速檢測(cè)方法可以明顯縮短病原菌的鑒定時(shí)間,對(duì)常見的臨床常見細(xì)菌、真菌及罕見菌進(jìn)行檢測(cè),如腸球菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌等[13]。

3 軟骨移植過程中受體的生物安全監(jiān)測(cè)

盡管需進(jìn)行嚴(yán)格的生物安全篩查,但仍然需要向受者、受者家屬?gòu)?qiáng)調(diào)骨軟骨移植過程中有潛在的細(xì)菌和病毒傳播風(fēng)險(xiǎn),且病原體來源、發(fā)病時(shí)間及感染性疾病轉(zhuǎn)歸等風(fēng)險(xiǎn)無法量化[14]。受者年齡、全身一般情況、慢性病史(包括糖尿病史、全身或局部感染史甚至口腔感染史)均會(huì)對(duì)上述風(fēng)險(xiǎn)造成影響。

受體在移植后的1年內(nèi)的感染風(fēng)險(xiǎn)較大,血清學(xué)常規(guī)檢查和血液培養(yǎng)應(yīng)納入常規(guī)監(jiān)測(cè)范圍,血液培養(yǎng)可以檢測(cè)到常規(guī)檢測(cè)漏掉的感染情況。考慮到部分合并軟骨下骨移植受者可能需要接受免疫抑制治療,對(duì)病原體的免疫反應(yīng)較弱,樣本采集時(shí)間和頻次為：骨軟骨移植前期、移植過程中、移植后1個(gè)月、移植后3個(gè)月、移植后6個(gè)月、移植后1年、移植后2年分別采集1次,之后每間隔2年采集1次[15]。對(duì)于一些有糖尿病史、免疫抑制劑使用史的受者,樣本采集的頻次需要增加。主動(dòng)篩查及被動(dòng)篩查過程包括常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),以及一系列針對(duì)性強(qiáng)的目的性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)?；诠擒浌且浦矌?kù)、骨軟骨移植管理平臺(tái)的建設(shè)和完善,對(duì)日常收集的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)信息數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,排除可能出現(xiàn)骨軟骨移植相關(guān)的潛在疾病、新興疾病,如人源性或動(dòng)物源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染檢測(cè)。

4 生物安全監(jiān)測(cè)體系建設(shè)

骨軟骨移植生物安全體系廣義上應(yīng)包括：制定人體骨軟骨組織移植法律、法規(guī)、管理?xiàng)l例等;完善人體組織尤其是骨軟骨組織移植行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、從業(yè)規(guī)范、管理制度;建立常規(guī)行業(yè)監(jiān)督制度、從業(yè)人員培訓(xùn)考核制度、人體組織捐贈(zèng)及獲取管理制度、骨軟骨移植組織庫(kù)管理制度等。

人體組織移植法律、法規(guī)、管理?xiàng)l例方面,目前中國(guó)未對(duì)人體組織捐獻(xiàn)和移植頒布明確的法律、法規(guī)。參考2023年《人體器官捐獻(xiàn)和移植條例》,骨軟骨移植過程中,軟骨組織捐獻(xiàn)應(yīng)當(dāng)遵循自愿、無償?shù)脑瓌t。條例明確規(guī)定從事遺體、器官、組織移植的醫(yī)療機(jī)構(gòu)需具備所需的設(shè)備、設(shè)施、技術(shù)人員支持;符合人體器官、組織移植倫理審核;完善、健全的器官、組織獲取質(zhì)量管理和控制制度。遺體器官應(yīng)通過國(guó)務(wù)院衛(wèi)生健康部門建立的分配系統(tǒng)統(tǒng)一分配;嚴(yán)格執(zhí)行器官及組織獲取、運(yùn)輸、保藏審核登記制度,移植醫(yī)師培訓(xùn)考核制度,接受移植患者資格審核、費(fèi)用監(jiān)督、生物安全監(jiān)測(cè)制度。從移植職業(yè)機(jī)構(gòu)、供者、受者等多方面監(jiān)管軟骨采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、移植過程。

20世紀(jì)90年代末,在美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)的監(jiān)督下美國(guó)組織庫(kù)協(xié)會(huì)(American association of tissue banks,AATB)建立了完整的軟骨獲取、加工、儲(chǔ)存流程,使得OCA移植在臨床商業(yè)化應(yīng)用成為可能。隨著OCA移植的推廣、普及,鑒于軟骨組織供體的不可控性,行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、從業(yè)規(guī)范、管理制度、監(jiān)督制度、從業(yè)人員培訓(xùn)考核制度、人體組織捐贈(zèng)及獲取管理制度應(yīng)參考更為嚴(yán)格的質(zhì)量控制(quality control,QC)標(biāo)準(zhǔn)甚至異種移植相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operating procedure,SOP)[15]。綜合考慮以下幾個(gè)方面：

(1)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。需同時(shí)考慮到個(gè)體健康、公眾健康的生物安全,說明可能出現(xiàn)的不確定事件及后果,包括：免疫排斥反應(yīng);潛在未知細(xì)菌、病毒、真菌等微生物傳播可能導(dǎo)致的局部感染、全身感染、甚至移植失敗;潛在未知傳染性病原體傳播可能會(huì)導(dǎo)致的人或動(dòng)物源性傳染病,以及新病原體的隱形傳播。

(2)傳染性病原體細(xì)菌、病毒、真菌等篩查。實(shí)施病原體篩查的機(jī)構(gòu)需具有成熟的病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室,對(duì)特定病原體、傳染性病原體和動(dòng)物源性潛在病原體進(jìn)行檢測(cè);擁有新病原體、難培養(yǎng)病原體甚至病毒分離、培養(yǎng)、鑒定等相關(guān)知識(shí)、技能和經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員,能區(qū)分人源性或動(dòng)物源性病原體是來自供體或受體本身,如人源巨細(xì)胞病毒和動(dòng)物源巨細(xì)胞病毒的區(qū)分[15]。

(3)病原體感染監(jiān)測(cè)。在疑似出現(xiàn)同種或異種感染,以下兩種情況應(yīng)立即通知受者,預(yù)警密切接觸人員并上報(bào)監(jiān)管機(jī)構(gòu)：①不易被識(shí)別的非異種感染病原體;②已被鑒定清楚的潛在異種感染病原體。當(dāng)受者出現(xiàn)病原體感染癥狀時(shí),在進(jìn)行常規(guī)診斷檢查的基礎(chǔ)上,應(yīng)啟動(dòng)持續(xù)篩查程序。骨軟骨移植實(shí)施醫(yī)療機(jī)構(gòu)需說明和執(zhí)行篩查程序,列明供體來源、使用軟骨的部位、數(shù)量、移植時(shí)間。通過骨軟骨移植庫(kù)、骨軟骨移植管理平臺(tái)的建設(shè)和完善,達(dá)到滿足常規(guī)樣本采集、潛在感染人員監(jiān)測(cè)等主動(dòng)、被動(dòng)篩查程序順利實(shí)施。

(4)病原體感染處理。同時(shí)應(yīng)注意逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括同種、異種逆轉(zhuǎn)錄病毒)的傳播風(fēng)險(xiǎn),如PERV感染問題。需制定相應(yīng)方案以解決受者PERV以及相似的病毒類病原體檢測(cè)陽(yáng)性的情況,包括：鑒別假陽(yáng)性,當(dāng)證實(shí)病毒來源于被感染的人類細(xì)胞后,應(yīng)繼續(xù)對(duì)病毒進(jìn)行分離;對(duì)造成感染的病毒病原體進(jìn)行鑒定,當(dāng)新病原體、難培養(yǎng)病原體、異種病原體等感染發(fā)生時(shí),需對(duì)所鑒定出的病原體進(jìn)行特異性說明、制定計(jì)劃上報(bào)上級(jí)監(jiān)管部門、相關(guān)的醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和倫理審查委員會(huì),制定臨時(shí)計(jì)劃并修改臨床研究方案,必要時(shí)暫?；蚪K止項(xiàng)目;在骨軟骨移植過程中對(duì)受者提供應(yīng)急方案以及后續(xù)醫(yī)療、護(hù)理以及心理咨詢;制定骨軟骨移植管理辦法保護(hù)受者、供體采集人員、手術(shù)和護(hù)理參與人員等密切接觸人員以及公共健康安全[15]。

(5)骨軟骨移植登記、管理服務(wù)平臺(tái)。包括：受者術(shù)前關(guān)節(jié)液、血樣、分離血漿等樣本留取、保藏工作;受者常規(guī)樣本采集以及高危無癥狀受者針對(duì)性樣本采集計(jì)劃;死亡受者尸檢檔案計(jì)劃,包括組織病理學(xué)檢查和病原體培養(yǎng),受者樣本采集部位包括骨軟骨移植物本身和移植物相關(guān)的、導(dǎo)致受者死亡的主要器官;基于骨軟骨移植登記、管理服務(wù)平臺(tái)擬定規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)流程,建議樣本采集流程達(dá)到生物安全等級(jí)二級(jí)水平,檢測(cè)流程遵守生物安全等級(jí)三級(jí)的要求;歸檔樣本均應(yīng)在-70 ℃以下保存50年以上或直至受者死亡[15]。

針對(duì)骨軟骨移植操作、保藏及預(yù)后的復(fù)雜性,應(yīng)注重骨軟骨移植相關(guān)的受者及密切接觸人群隨訪問題：受者和與受者有體液接觸、以及有皮膚或黏膜接觸的護(hù)工和實(shí)驗(yàn)人員等親密接觸的人群同為風(fēng)險(xiǎn)人群,均可能面臨機(jī)會(huì)性感染甚至人畜共患感染的風(fēng)險(xiǎn);風(fēng)險(xiǎn)人群與受者接觸需采取防護(hù)措施,防止傳染性病原體的傳播;風(fēng)險(xiǎn)人群應(yīng)延遲涉及體液或其他身體器官的捐獻(xiàn)行為;骨軟骨移植受者須同意將風(fēng)險(xiǎn)告知風(fēng)險(xiǎn)人群并接受定期進(jìn)行臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查、樣本采集以及終身回訪;受者應(yīng)被告知采集和歸檔的樣本將被抽查檢測(cè),用于評(píng)估疾病、病原體感染狀態(tài)以及科學(xué)研究;受者有責(zé)任向監(jiān)管部門上報(bào)其住址和電話的變更情況,以便進(jìn)行終身回訪,受者應(yīng)同意其醫(yī)療信息可被相關(guān)公共衛(wèi)生部門查詢,并在法律法規(guī)允許的范圍內(nèi)對(duì)其信息保密[16]。

同種異體骨軟骨的生物安全檢測(cè),要求供者年齡一般在15～45歲,排除風(fēng)濕免疫疾病及腫瘤疾病史,取軟骨部位關(guān)節(jié)軟骨完整、無明顯退行性變;排除供者細(xì)菌感染史、全身感染及局部感染;排除供者病毒感染史,包括DNA病毒、RNA病毒。這些流程盡量在指定的中心或組織庫(kù)進(jìn)行,才能保證獲取組織的安全性和質(zhì)量[5]。

異體軟骨來源相對(duì)豐富,其生物學(xué)特征和形態(tài)結(jié)構(gòu)與自體軟骨相似,是替代自體軟骨移植的主要材料。但同種異體軟骨移植所帶來的生物安全問題是一個(gè)需要高度重視的問題,如何規(guī)范軟骨移植生物安全監(jiān)測(cè)體系,從而降低其潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)是目前臨床、科研、社會(huì)工作者亟待解決的重要課題。