張希瑞 孫海正 孫淑紅 田崇兵 趙鳳民 薛菁芳

摘要：以來(lái)自不同地區(qū)的167份水稻品種為供試材料，2021年和2022年連續(xù)2年采用芽期接種法進(jìn)行惡苗病抗性鑒定，在水稻3.0～3.5葉期對(duì)得病率（IR）、徒長(zhǎng)率（SGR）和苗增重率（WGR）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和測(cè)量。利用TASSEL 3.0軟件的GLM將3個(gè)表型性狀與154對(duì)SSR標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，2021年檢測(cè)到22個(gè)位點(diǎn)，2022年檢測(cè)到13個(gè)位點(diǎn)，共有4個(gè)位點(diǎn)在2次鑒定中被同時(shí)檢測(cè)到，分別是位于第6、第3和第4號(hào)染色體上與IR顯著關(guān)聯(lián)的RM527、RM1352和RM1354，位于第7號(hào)染色體上與SGR顯著關(guān)聯(lián)的RM473。同時(shí)進(jìn)一步挖掘出9個(gè)優(yōu)異等位變異及相應(yīng)載體材料，發(fā)現(xiàn)龍稻1號(hào)、遼粳912、五優(yōu)稻1號(hào)等是含有2個(gè)及以上等位變異的較優(yōu)材料。

關(guān)鍵詞：粳稻；惡苗病抗性；SSR標(biāo)記；關(guān)聯(lián)分析；等位變異

中圖分類號(hào)：S435.111.4+4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）05-0051-07

水稻惡苗病是一種種傳病害，主要由惡苗病病菌在種子發(fā)芽過(guò)程中侵染胚芽導(dǎo)致發(fā)病，患病植株主要表現(xiàn)為植株細(xì)高，葉片葉鞘細(xì)長(zhǎng)，葉色淡黃，根系發(fā)育不良，部分病苗在移栽前枯萎死亡。水稻生長(zhǎng)的任意一個(gè)時(shí)期都可能感染惡苗病病菌，從而引發(fā)惡苗病。水稻惡苗病的大面積發(fā)生，可導(dǎo)致作物產(chǎn)量減少40%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約水稻的安全生產(chǎn)［1］。

防治惡苗病最直接、經(jīng)濟(jì)、有效的方法就是培育抗惡苗病水稻新品種。選育抗惡苗病水稻品種的前提是篩選和挖掘抗性資源。惡苗病的抗性鑒定主要包括病菌的培養(yǎng)、接種和抗性水平的評(píng)價(jià)。前人關(guān)于水稻惡苗病的接種鑒定方法的研究有很多，呂彬?qū)ρ科诮臃N、立針期噴霧接種、芽期加立針期接種、穗期噴霧接種等多種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，芽期浸菌接種致病效果最佳，可用此方法區(qū)分不同水稻品種的抗感水平［2］。Yadav等發(fā)現(xiàn)，惡苗病病菌生長(zhǎng)繁殖的最適溫度是20 ℃、最適pH值為5.0，并進(jìn)一步得出以谷殼作碳源的培養(yǎng)基病菌生長(zhǎng)速度最快和以甘蔗作碳源的培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量最大的結(jié)論［3］。Hossain等在鑒定不同水稻品種抗性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用1.5×105個(gè)/mL惡苗病病菌孢子懸浮液浸種36 h處理效果最佳［4］。在惡苗病抗性水平的評(píng)價(jià)上，出現(xiàn)了多種衡量指標(biāo)。有的基于發(fā)病癥狀對(duì)抗性水平進(jìn)行定級(jí)［5-6］，有的通過(guò)發(fā)病癥狀統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、健康植株率來(lái)衡量抗性水平［7-8］。季芝娟在定位惡苗病抗性相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）研究中，利用徒長(zhǎng)率（SGR）和苗增重率（WGR）來(lái)衡量試驗(yàn)材料的惡苗病抗性水平，并得出2個(gè)性狀存在相關(guān)性的結(jié)論［9］。

關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡（LD）為基礎(chǔ)，分析自然群體材料某目標(biāo)性狀與分子標(biāo)記或候選基因間連鎖遺傳關(guān)系的一種方法，在水稻、玉米等作物中已被廣泛應(yīng)用［10-12］。本研究以167份不同地理來(lái)源的水稻品種為材料，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)2次苗期惡苗病抗性鑒定，利用154對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記與得病率（IR）、徒長(zhǎng)率、苗增重率等進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在挖掘與IR、SGR和WGR等惡苗病抗性性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，為高抗惡苗病水稻的選育提供分子理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以167份地理分布廣泛的粳稻品種為供試材料（表1）。其中，來(lái)自我國(guó)遼寧、吉林、黑龍江的材料分別有14、32、48份，來(lái)自日本的材料有47份，來(lái)自朝鮮的材料有7份，來(lái)自俄羅斯的材料有5份，來(lái)自韓國(guó)的材料有14份。

1.2 SSR標(biāo)記分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法進(jìn)行DNA提?。?3］。利用黑芒稻、元子二號(hào)、金鉤、東農(nóng)424和龍粳20的DNA對(duì)筆者所在實(shí)驗(yàn)室已有的500對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，從中篩選出154對(duì)多態(tài)性高的SSR引物，對(duì)167份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2 μL模板DNA（25 ng/μL），2 μL SSR引物（12 ng/μL），3 μL PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2溶液（25 mmol/L），0.3 μL Taq酶（5 U/μL），0.2 μL? dNTP（10 mmol/L），最后加入11 μL ddH2O使總體積達(dá)到20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 惡苗病病菌的培養(yǎng)

5種惡苗病病菌混合菌株由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所植物保護(hù)研究室提供，用高粱培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后用無(wú)菌純凈水將孢子沖洗下來(lái)，配制濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液，對(duì)其進(jìn)行鏡檢，以100倍鏡下每個(gè)視野約有2 000個(gè)孢子為宜。

1.4 芽期接種

本試驗(yàn)于2021年和2022年連續(xù)2年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用芽期接種法，試驗(yàn)設(shè)置處理和對(duì)照，每組3次重復(fù)。先將供試種子裝入有孔膠卷盒中，進(jìn)行浸種和催芽，再將處理組的種子浸在惡苗病病菌孢子懸浮液中接種12 h，撈出控干水分，采用育苗盤育苗，每個(gè)品種播種100粒。在水稻3.0～3.5葉期調(diào)查植株得病率，每個(gè)品種選5株測(cè)量其株高和植株干重，每年鑒定1次。徒長(zhǎng)率和苗增重率的計(jì)算方法如下：徒長(zhǎng)率=（處理株高平均值-對(duì)照株高平均值）/對(duì)照株高平均值×100%，苗增重率=（處理干重平均值-對(duì)照干重平均值）/對(duì)照干重平均值×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對(duì)得病率、徒長(zhǎng)率和苗增重率等性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，群體K值取值范圍為1～10，馬爾科夫鏈蒙特卡洛（MCMC）參數(shù)設(shè)為100 000，不作數(shù)迭代（length of burn-in period）設(shè)為10 000，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行10次。依據(jù)最大似然值原則確定合適的群體K值，若對(duì)數(shù)似然值lnP（D）隨亞群數(shù)K值增大而增大，則采用ΔK來(lái)確定最適K值［14-15］。運(yùn)用TASSEL 3.0軟件計(jì)算兩兩位點(diǎn)之間的D′值，以此來(lái)評(píng)價(jià)供試材料群體的連鎖不平衡（LD）程度（等位基因頻率＜5%的稀有等位基因作為缺失處理）。當(dāng)P≤0.01時(shí)認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀的LD達(dá)到顯著水平［16］。將Structure 2.3.4軟件運(yùn)行后得到的Q值作為協(xié)變量，利用TASSEL 3.0軟件中的廣義線性模型（GLM）進(jìn)行相關(guān)性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)P≤0.01時(shí)認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)［17］。

1.6 優(yōu)異等位變異挖掘

在上述關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)上，參照Z(yǔ)hang等的方法［18］進(jìn)行優(yōu)異等位變異挖掘。以群體平均值為對(duì)照，估算關(guān)聯(lián)位點(diǎn)等位變異的表型效應(yīng)值，并列出攜帶該等位基因的3個(gè)最佳品種材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻苗期惡苗病抗性鑒定

對(duì)2021年與2022年鑒定的167份水稻品種的得病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以2次鑒定的平均得病率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，平均得病率最小的5個(gè)品種分別是雙豐8號(hào)、咸南23號(hào)、日立23、12346和早晉富，得病率分別為8.7%、8.0%、8.8%、4.8%和6.3%。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

利用167個(gè)供試材料在154對(duì)SSR引物擴(kuò)增下的基因型數(shù)據(jù)，結(jié)合Structure 2.3.4軟件對(duì)該自然群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。由圖1可知，對(duì)數(shù)似然值 lnP（D） 隨亞群數(shù)K值的增大而增大，無(wú)法確定最適K值，故采用ΔK來(lái)確定合適K值。當(dāng)K=2時(shí)，ΔK為最大值，因此判定樣本亞群數(shù)為2。利用Structure 2.3.4軟件計(jì)算出每個(gè)品種歸屬于2個(gè)亞群的后驗(yàn)概率值，以此來(lái)劃分每個(gè)品種歸屬的亞群，將概率值≥0.8作為亞群分類條件，不符合條件的歸于混合亞群，將亞群分別命名為P1、P2和混合亞群（MIX）。由圖2可以看出，P1包括14份材料，P2包括114份材料，剩余的39份材料被劃分入MIX。利用Structure 2.3.4軟件計(jì)算出K=2時(shí)各材料的Q值并應(yīng)用于下一步的關(guān)聯(lián)分析中。

2.3 連鎖不平衡分析

使用TASSEL 3.0軟件對(duì)上述2個(gè)亞群154對(duì)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的連鎖不平衡狀況進(jìn)行分析，計(jì)算出所有可能位點(diǎn)的D′值和P值，用來(lái)評(píng)價(jià)群體的連鎖不平衡程度，其中稀有等位變異即變異頻率<5%作為缺失處理。評(píng)價(jià)位點(diǎn)間顯著連鎖不平衡的標(biāo)準(zhǔn)是P≤0.01。圖3直觀地顯示出連鎖狀態(tài)的位點(diǎn)組合，用不同的顏色表示每對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)間的D′值和Fisher檢驗(yàn)的P值。結(jié)果表明，在11 628個(gè)成對(duì)SSR位點(diǎn)組合中共線性組合和非共線性組合間均存在一定程度的LD（斜線左下方非白色小格）。統(tǒng)計(jì)概率（P＜0.01）支持LD成對(duì)的SSR位點(diǎn)有890個(gè)，占全部位點(diǎn)組合的7.7%。

2.4 苗期惡苗病抗性相關(guān)性狀與SSR位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 3.0軟件的GLM功能模塊分別對(duì)惡苗病相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。由表2可知，第1次（2021年）鑒定檢測(cè)到與3個(gè)抗病相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)共22個(gè)，其中與IR相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記7個(gè)，與SGR相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)11個(gè)，與SWR相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)4個(gè)；在第2次（2022年）鑒定檢測(cè)到與抗病性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)共13個(gè)，其中與IR相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記7個(gè)，與SGR相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)3個(gè)，與WGR相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)3個(gè)。在2次鑒定中共有4個(gè)位點(diǎn)被同時(shí)檢測(cè)到與IR和SGR性狀顯著關(guān)聯(lián)，分別是與IR顯著關(guān)聯(lián)的RM527、RM1352和RM1354，分別位于第6、第3和第4號(hào)染色體上，且2次鑒定累計(jì)表型貢獻(xiàn)率均大于35%；與SGR顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)是RM473，位于第7號(hào)染色體上，2次表型貢獻(xiàn)率分別是11.91%和9.10%。

2.5 優(yōu)異等位基因及載體材料

將本研究在2年鑒定中同時(shí)檢測(cè)到的4個(gè)位點(diǎn)用來(lái)進(jìn)一步挖掘優(yōu)異等位變異。因?yàn)闃?biāo)記間的等位變異表型效應(yīng)值為負(fù)數(shù)時(shí)才對(duì)水稻的惡苗病抗性有積極的促進(jìn)作用，所以將2年中表型效應(yīng)值小于零的優(yōu)異等位變異進(jìn)行整理，并列出攜帶該等位變異的3個(gè)最佳品種。由表3可知，共有9個(gè)優(yōu)異等位變異在2年中均被檢測(cè)到，分別是RM473-90、RM473-100、RM527-225、RM527-230、RM527-235、RM527-240、RM1354-205、RM1354-210、RM1354-215，其中RM1354-205在2年里的表型效應(yīng)絕對(duì)值均最大，分別是5.52和7.43。從表3中可以發(fā)現(xiàn)，龍稻1號(hào)、遼粳912、五優(yōu)稻1號(hào)、東農(nóng)424、龍盾104等較優(yōu)材料在2年鑒定中含有2個(gè)及以上優(yōu)異等位變異，且均具有較高惡苗病抗性。

3 討論

3.1 黑龍江水稻惡苗病的發(fā)生

有研究指出，催芽階段最易感染惡苗病病菌［19］。為方便農(nóng)民生產(chǎn)，現(xiàn)在黑龍江省絕大多數(shù)農(nóng)場(chǎng)都采用催芽工廠集中浸種催芽，而惡苗病屬于種傳病害，帶菌種子為惡苗病的初侵染源，在浸種催芽時(shí)極易大量繁殖與傳播，導(dǎo)致惡苗病大規(guī)模發(fā)生。這與季芝娟等的觀點(diǎn)［20］一致。本研究采用的芽期接種法符合生產(chǎn)實(shí)際。

3.2 抗惡苗病品種的選育

研究表明，不同水稻品種之間對(duì)惡苗病病菌的抗性存在明顯差異，通過(guò)人工選擇培育抗性強(qiáng)的水稻品種是最直接、有效的控制惡苗病發(fā)生的手段。本研究對(duì)現(xiàn)有水稻品種進(jìn)行抗性篩選，發(fā)掘高抗水稻資源，可作為培育高惡苗病抗性水稻的骨干親本，為抗性水稻的親本選育提供理論依據(jù)［21］。

3.3 化學(xué)防治惡苗病

在當(dāng)下的水稻生產(chǎn)實(shí)踐中，采用種衣劑包衣和浸種劑消毒是防治水稻惡苗病最主要的防治手段。研究表明，長(zhǎng)期使用單一藥劑及采用長(zhǎng)時(shí)間、低濃度的方式浸種易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。2種或多種藥劑混合使用的防治效果顯著優(yōu)于單一藥劑的使用效果［22］。近年來(lái)，以氰烯菌酯為有效成分的藥劑在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)田間惡苗病有良好的防治效果，被廣泛應(yīng)用于水稻生產(chǎn)中［23］。在采用混合藥劑浸種時(shí)，要注意防止高濃度、長(zhǎng)時(shí)間浸種對(duì)種胚造成的損傷，而影響種子出苗和正常生長(zhǎng)。在藥劑選擇時(shí)，可以考慮選擇微生物拮抗藥劑，可有效避免農(nóng)藥殘留，還具有安全性高、綠色環(huán)保等特點(diǎn)。

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