李鄧斌，魏 超，張 媛，張根林,*，王小艷,*

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是一種復(fù)合低聚糖，在母乳中以游離形式存在，是母乳中第三大固體成分，具有顯著的生物活性，能夠有效地提升母乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。HMOs 被證實(shí)具有獨(dú)特的健康益處，如減少病原體黏附，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和免疫反應(yīng)，降低壞死性小腸結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)大腦發(fā)育和認(rèn)知等功能[2]。在整個(gè)哺乳期，HMOs 的濃度不同[3]。研究表明，HMOs 在初乳中的濃度最高（平均9～22 g/L），其次是過(guò)渡乳（平均8～19 g/L），隨著哺乳的進(jìn)行，成熟乳中的HMOs 濃度逐漸下降，從出生一個(gè)月內(nèi)采集的母乳中的6～15 g/L 下降到6 個(gè)月后的4～6 g/L[4]。HMOs 還可以保護(hù)母乳喂養(yǎng)的嬰兒免受微生物感染，喂食配方奶粉（添加特定HMOs）的嬰兒表現(xiàn)出一種與純母乳喂養(yǎng)嬰兒更接近的炎性細(xì)胞因子模式[5]。因此，在商業(yè)嬰兒配方奶粉中的補(bǔ)充適量的HMOs 對(duì)于模仿真正的母乳具有重要意義[6]。

HMOs 是由3～6 個(gè)糖基組成的化合物，其中包括N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，Glc-NAc）、唾液酸（sialicacid，Sia）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）以及N-乙酰神經(jīng)氨酸（CMP-N-acetylneuraminicacid，Neu5Ac）。這五種單糖通過(guò)多種結(jié)合方式相互組合，形成了超過(guò)200 種不同的結(jié)構(gòu)[7]。HMOs 按照修飾基團(tuán)的不同可分為 3 類(lèi)，包括被巖藻糖基修飾的中性HMOs，如2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose,3-FL）和二巖藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）等，占比35%～50%（圖1）；酸性 HMOs，如3′-唾液酸乳糖（3′-Sialyllactose，3′-SL）和6′-唾液酸基乳糖（6′-Sialyllactose，6′-SL），占比12%～14%；以及非巖藻糖基化的中性HMOs，如乳糖-N-四糖（Lacto-N-tetraose，LNT）和乳糖-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose，LNnT），占比42%～55%[8-10]。

圖1 巖藻糖基乳糖（FL）的結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Structural composition of fucosyllactose (FL)

鑒于人們愈發(fā)認(rèn)識(shí)到HMOs 在嬰幼兒健康與生長(zhǎng)發(fā)育中的關(guān)鍵作用，全球范圍內(nèi)對(duì)合成人乳寡糖及其活性類(lèi)似物作為嬰幼兒配方奶粉添加劑的研究與商業(yè)關(guān)注日益濃厚。2′-FL 和3-FL 是HMOs 中最豐富的巖藻糖基化寡糖，它們對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育有益。近年來(lái)，通過(guò)微生物法、酶法和化學(xué)合成法生產(chǎn)2′-FL、3-FL 已取得重大技術(shù)突破，這給嬰兒營(yíng)養(yǎng)食品行業(yè)帶來(lái)了革命性的變化。美國(guó)食品藥品管理局、歐盟委員會(huì)、澳大利亞和新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)局等已經(jīng)批準(zhǔn)在嬰兒配方食品中添加2′-FL。2021 年12 月，歐盟和美國(guó)已經(jīng)分別批準(zhǔn)了3-FL 等六種母乳寡糖作為新食品原料。2022 年4 月15 日，中國(guó)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心對(duì)2′-FL 公開(kāi)征求意見(jiàn)。相信，不久之后在中國(guó)2′-FL 在食品中添加的法規(guī)會(huì)有新的進(jìn)展。

本文總結(jié)2′-FL 和3-FL 的制備方法，系統(tǒng)闡述微生物法合成2′-FL 和3-FL 的工程化策略，為后續(xù)2′-FL 和3-FL 的微生物生產(chǎn)提供一定的研究思路。

1 2′-FL 和3-FL 的合成方法

2′-FL 是HMOs 的重要組成部分，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。而3-FL 與2′-FL 的合成方法相似，因此，它們的合成研究可以相互借鑒。研究者們用化學(xué)法、酶法和微生物細(xì)胞工廠(chǎng)法廣泛地研究了2′-FL 和3-FL 的合成[11]，這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)具體見(jiàn)表1。

表1 2′-FL 和3-FL 的合成方法Table 1 Synthesis methods of 2′-FL and 3-FL

1.1 化學(xué)法合成2′-FL 和3-FL

化學(xué)合成法使用乳糖和L-巖藻糖作為原料，分別通過(guò)2、3 步反應(yīng)合成乳糖受體和巖藻糖基供體。然后，將這兩種物質(zhì)混合，通過(guò)3 步反應(yīng)得到2′-FL 混合物。最后，通過(guò)脫鹽、脫色和提純等工藝，可以得到純度更高的2′-FL[12]。

雖然化學(xué)合成法在生產(chǎn)效率和產(chǎn)品純度上都表現(xiàn)出色，但是它的生產(chǎn)流程繁復(fù)，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)物收率偏低，L-巖藻糖價(jià)格不菲，并且經(jīng)常需要使用有毒有害的試劑，這些都限制了它的廣泛應(yīng)用。

1.2 酶法合成2′-FL 和3-FL

酶合成法2′-FL 和3-FL 是利用多種酶催化底物、供體以及輔助因子轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物的特異性反應(yīng)[13]。雖然酶合成法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)成分相對(duì)簡(jiǎn)單以及易于純化等優(yōu)點(diǎn)，但酶法存在底物成本高以及產(chǎn)物的得率不高等問(wèn)題，目前尚處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。

1.2.1 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶合成2′-FL 和3-FL 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（EC2.4.1.-）是糖基轉(zhuǎn)移酶家族，廣泛用于復(fù)雜糖鏈表位的糖基化，參與多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)和癌癥轉(zhuǎn)移等。到目前為止，已經(jīng)分離、鑒定了不同類(lèi)型的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，并將其應(yīng)用于制備高附加值的α-巖藻糖基化產(chǎn)物[15]。根據(jù)巖藻糖苷的區(qū)域特異性和受體類(lèi)型，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可劃分為五大類(lèi)：α-1,2，α-1,3，α-1,4，α-1,6 和O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶[16]。其中，α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)DP-L-巖藻糖從供體傳遞到受體乳糖端，從而產(chǎn)生2′-FL[17]。α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠以GDPL-巖藻糖和乳糖為底物，生成3-FL。不同來(lái)源的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在酶學(xué)和理化性質(zhì)等方面存在差異，常見(jiàn)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶如表2 所示。從表2 中可看到，目前巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的生物來(lái)源較為廣泛，其中幽門(mén)螺旋桿菌來(lái)源的最多。

表2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的各種形式Table 2 Various forms of fucosyltransferase

1.2.2α-L-巖藻糖苷酶合成2′-FL 和3-FLα-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）是一類(lèi)外切糖苷水解酶，能夠選擇性地水解或轉(zhuǎn)移相應(yīng)碳水化合物或糖結(jié)合物的非還原α-L-巖藻糖基殘基[26]。采用α-L-巖藻糖苷酶合成2′-FL 的技術(shù)[27]，通常以4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷為糖基供體，該酶具有高度的特異性，作用于巖藻糖基化合物的巖藻糖基團(tuán)，水解得到的巖藻糖分子與乳糖經(jīng)進(jìn)一步反應(yīng)獲得2′-FL。

1.3 微生物法合成2′-FL 和3-FL

微生物合成法FL 有兩種合成途徑。一種是從頭合成途徑（De novo pathway），以甘油、葡萄糖或蔗糖作為合成起始底物，在磷酸甘露糖變位酶（ManB）、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)移酶（ManC）、GDPD-甘露糖-4,6-脫水酶（Gmd）和GDP-L-巖藻糖合成酶（WcaG）的參與下合成GDP-L-巖藻糖，GDP-L-巖藻糖和乳糖在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成2′-FL 和3-FL[28]。另一種是補(bǔ)救途徑（salvage pathway），以L(fǎng)-巖藻糖為起始底物，通過(guò)雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶（fucosepyrophosphorylase，F(xiàn)KP）合成GDP-L-巖藻糖，再經(jīng)過(guò)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的作用生成2′-FL 和3-FL[29]。

相比于化學(xué)法和酶法，微生物具有更快的增殖速度，更容易擴(kuò)大培養(yǎng)，而且能夠使用低成本碳源。因此，微生物法已經(jīng)成為2′-FL、3-FL 及其他HMOs綠色合成的首選方式[30]。表3 列出不同的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 的研究進(jìn)展。從表3 中可看到，近幾年，通過(guò)細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 的產(chǎn)量得到大幅度提升，其中2′-FL 的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了112.56 g/L，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

表3 微生物法合成2′-FL 和3-FL 的研究進(jìn)展Table 3 Research progress for microbial synthesis of 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose

2 大腸桿菌生物合成2′-FL 和3-FL 的代謝工程化策略

隨著代謝工程的不斷發(fā)展，人們可以通過(guò)構(gòu)建和調(diào)控微生物宿主中的代謝途徑，從而產(chǎn)生更多高附加值的產(chǎn)品，為社會(huì)發(fā)展帶來(lái)更多的價(jià)值。因此，可通過(guò)多種策略，如底盤(pán)宿主選擇、代謝途徑構(gòu)建、途徑酶的表達(dá)與優(yōu)化、競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑的敲除、輔因子的循環(huán)再生、碳源和養(yǎng)分的利用、代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)等方式來(lái)提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量[36-37]。

通過(guò)合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)，已經(jīng)有五種底盤(pán)細(xì)胞被用于2′-FL 和3-FL 的生物合成，它們分別是大腸桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌。其中釀酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌在微生物學(xué)中一般被認(rèn)為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）[38]。雖然GRAS 微生物宿主具備生產(chǎn)安全性的優(yōu)點(diǎn)，但它們的生產(chǎn)效率往往不及大腸桿菌，這是因?yàn)榇竽c桿菌的生長(zhǎng)周期短、菌株構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本低廉，使得大腸桿菌生產(chǎn)效率更高。圖2 為大腸桿菌中合成2′-FL 和3-FL 的工程途徑。

圖2 在大腸桿菌中2′-FL 和3-FL 的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathways of 2′-FL and 3-FL in E.coli

2.1 模塊化代謝工程策略

微生物代謝工廠(chǎng)合成目標(biāo)化合物時(shí)，常常需要共同表達(dá)多個(gè)關(guān)鍵酶。由于中間產(chǎn)物的大量積聚，會(huì)給上游酶帶來(lái)反饋性的抑制，從而加劇細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，阻礙微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響最終產(chǎn)品的合成[39]。采用模塊化代謝工程策略，將合成途徑劃分為多個(gè)模塊，對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控，可以有效地解決代謝流平衡問(wèn)題[28]。

Li 等[20]利用組合模塊化策略，將2′-FL 合成途徑分為GDP-L-巖藻糖合成模塊、乳糖巖藻糖基化模塊，通過(guò)不同拷貝數(shù)的組合優(yōu)化，在轉(zhuǎn)錄水平上微調(diào)基因表達(dá)水平，將代謝流合理引向2′-FL 代謝途徑，獲得了14.1 g/L 的2′-FL。Li 等[40]將2′-FL 分為GDPL-巖藻糖合成模塊、乳糖巖藻糖基化模塊、輔因子再生模塊，通過(guò)不同的質(zhì)粒組合來(lái)平衡合成途徑，獲得了22.3 g/L 的2′-FL。Chen 等[24]將3-FL 代謝通路的關(guān)鍵酶分為兩個(gè)代謝模塊，以質(zhì)?？截悢?shù)的變化調(diào)節(jié)內(nèi)源酶（ManB、ManC、Gmd 和WcaG）和異源酶（FutM2）的基因表達(dá)強(qiáng)度，獲得了20.3 g/L 的3-FL。模塊化代謝工程策略表明將代謝通路按照不同的功能、分支等因素分為不同的代謝模塊，就代謝通路而言，每個(gè)模塊又相互作用，從而實(shí)現(xiàn)代謝途徑的調(diào)控，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，2′-FL 和3-FL 產(chǎn)量也會(huì)隨之提高。

2.2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶篩選與優(yōu)化策略

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠以GDP-L-巖藻糖和乳糖為底物合成2′-FL 和3-FL，是2′-FL 和3-FL 合成的關(guān)鍵限制因素之一。但是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶存在異源表達(dá)量低、催化活性差等缺陷，阻礙了2′-FL 和3-FL 的合成。

2.2.1 異源表達(dá)量的篩選與優(yōu)化 來(lái)源于微生物的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性?xún)H為一般代謝酶活性的1%，且α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的溶解性較差。因此，篩選高活性的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的溶解度，是合成2′-FL 和3-FL 過(guò)程中的重要手段。Huang 等[19]針對(duì)酶源進(jìn)行了挖掘與篩選分析，比較了各種外源α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶候選菌株，發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌來(lái)源的FutC 和FutA 產(chǎn)生的2′-FL 和3-FL 產(chǎn)量最高。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)已鑒定的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶很難在大腸桿菌中功能表達(dá)，導(dǎo)致形成包涵體。與某些標(biāo)簽融合表達(dá)可顯著提高其可溶性表達(dá)，如SUMOstar[41]、TrxA[42]、pelB[28]等。此外，Lee 等[43]發(fā)現(xiàn)降低啟動(dòng)子強(qiáng)度可能會(huì)提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的溶解度，用Trc 啟動(dòng)子替換T7 啟動(dòng)子后，α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在菌株中的表達(dá)顯著提高了2′-FL 產(chǎn)量和產(chǎn)量。Li 等[28]設(shè)計(jì)了多水平的組合策略（包括RBS、融合肽和多拷貝基因篩選）來(lái)改善巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用的技術(shù)瓶頸，其中中等表達(dá)強(qiáng)度的RBS（BBa_B0034）更適合α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的翻譯水平和蛋白表達(dá)，mRNA 水平分別是對(duì)照組的3.48 倍和4.54 倍。這表明，可以通過(guò)篩選異源表達(dá)量高的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、探索更多的融合標(biāo)簽、篩選適當(dāng)強(qiáng)度的表達(dá)元件等方式來(lái)提高宿主體內(nèi)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量。

2.2.2 催化活性的篩選與優(yōu)化 大部分α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶會(huì)催化產(chǎn)生副產(chǎn)物DFL 以及3-FL[44]。為獲得其他高活力的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，Zhu等[22]從Helicobactersp.11S02629-2 中篩選出一種新的具有活性的α-1,2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（BKHT），不產(chǎn)生副產(chǎn)物DFL 和3-FL。獲得了94.7 g/L 的2′-FL，乳糖產(chǎn)量0.98 mol/mol，產(chǎn)糖量1.14 g/L/h。此外，Chen 等[23]從Azospirillum lipoferum篩選出一種新的具有活性的α-1,2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（SAMT），將其插入到工程菌的染色體中，基于SAMT 的菌株只產(chǎn)生2′-FL，沒(méi)有其他副產(chǎn)物，獲得112.56 g/L 的2′-FL，乳糖產(chǎn)量0.98 mol/mol，產(chǎn)糖量1.10 g/L/h，具有較強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。這表明，通過(guò)篩選新的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，催化時(shí)減少或不產(chǎn)生副產(chǎn)物的生成，能夠明顯提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

2.2.3 其他方面的篩選與優(yōu)化 在對(duì)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的分子改造報(bào)道中，通過(guò)系統(tǒng)的截?cái)嗪脱由欤?1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的C 端工程導(dǎo)致3-FL 合成增加了10～20 倍[25]。Liu 等[45]為了提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的底物選擇性和底物耐受性，采用了計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和篩選與生化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的半理性操作，突變體的催化效率比野生型提高了100 倍。Park 等[46]通過(guò)對(duì)保守氨基酸序列的家族多序列分析和蛋白質(zhì)-配體底物對(duì)接分析，找到4 個(gè)突變位點(diǎn)（F40S/Q150H/C151R/Q239S），這些突變位點(diǎn)可以提高FutC 的溶解性和活性，并且四個(gè)組合突變使2′-FL 產(chǎn)量提高了2.4 倍。

2.3 中間體GDP-L-巖藻糖的積累策略

GDP-L-巖藻糖是代謝工程生產(chǎn)2′-FL 和3-FL的巖藻糖基供體。GDP-L-巖藻糖的從頭合成和補(bǔ)救合成已分別或聯(lián)合用于2′-FL 和3-FL 的生產(chǎn)。

在從頭合成途徑中，可以調(diào)控合成GDP-L-巖藻糖的相關(guān)基因表達(dá)來(lái)增加FL 的產(chǎn)量，如manB、manC、gmd、wcaG、rcsA以及rcsB[19]。另外一種是敲除參與 GDP-L-巖藻糖代謝的相關(guān)基因，如參與克拉酸合成的基因wcaJ，抑制 GDP-L-巖藻糖進(jìn)一步合成克拉酸[20]。RcsA 和RcsB 作為調(diào)節(jié)因子，對(duì)溫度變化非常敏感，它的降解受到ATP 的影響，因此，當(dāng)ATP 的濃度下降時(shí)，RcsA 和RcsB 的活性會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致GDP-L-巖藻糖的供應(yīng)量減少[19]。此外，還需要考慮前體GDP-甘露糖代謝競(jìng)爭(zhēng)途徑的相關(guān)酶GDP-甘露糖甘露醇水解酶（NudD）和GDP-甘露糖水解酶（NudK）。在Ni 等[47]的研究中，與對(duì)照菌株相比，缺失nudD可以提高工程菌中2′-FL 的產(chǎn)量；然而，nudK的缺失并沒(méi)有表現(xiàn)出積極的效果，甚至減少了2′-FL 的產(chǎn)量。而在Li 等[28]的研究中，nudD和nudK的缺失都能夠提高工程菌中2′-FL 的產(chǎn)量。

在補(bǔ)救合成途徑中，Wan 等[48]敲除以L(fǎng)-巖藻糖為直接底物的兩種酶—L-巖藻糖異構(gòu)酶（FucK）和L-巖藻糖激酶（FucI）的酶基因，以提高2′-FL 生物合成前體的利用率，最終菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)胞外2′-FL 為30.5 g/L，產(chǎn)糖量為0.661 mol/mol 巖藻糖，產(chǎn)率為0.48 g/L/h。此外，L-鼠李糖異構(gòu)酶（RhaA）和D-阿拉伯糖異構(gòu)酶（AraA）參與催化L-巖藻糖的異構(gòu)化，工程菌中araA和rhaA基因的雙敲除使2′-FL 的產(chǎn)糖量由0.36 mol/mol 巖藻糖提高到0.52 mol/mol 巖藻糖，從而使2′-FL 的濃度由23.1 g/L 達(dá)到47.0 g/L[49]。因此敲除araA、rhaA也是提高GDPL-巖藻糖產(chǎn)量的有效策略。

2.4 底物乳糖的攝取與利用策略

乳糖作為生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 的巖藻糖受體底物，需確保細(xì)胞內(nèi)具備充足數(shù)量以滿(mǎn)足2′-FL 和3-FL 的合成需求。相關(guān)研究表明，乳糖可以在β-半乳糖苷酶（LacZ）的作用下被水解成葡萄糖和半乳糖。由于乳糖的2′-FL 和3-FL 產(chǎn)量（分別為0.026 mol/mol和0.046 mol/mol）明顯低于理論產(chǎn)量（1 mol/mol），大部分乳糖顯然被用于細(xì)胞生長(zhǎng)，而不是2′-FL 和3-FL 的生產(chǎn)[19]。

Chin 等[50]通過(guò)敲除底盤(pán)細(xì)胞中編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到的影響幾乎可以忽略不計(jì)，而且這種方法可以有效地提高乳糖在目標(biāo)產(chǎn)物合成中的利用率，從而將代謝流引向目標(biāo)代謝產(chǎn)物，進(jìn)而提升2′-FL 和3-FL 的產(chǎn)量。此外，β-半乳糖苷透性酶（LacY）是一種跨膜蛋白，負(fù)責(zé)乳糖的跨細(xì)胞膜運(yùn)輸[28]。可以通過(guò)過(guò)表達(dá)或增加基因拷貝數(shù)等方式來(lái)增強(qiáng)LacY 的表達(dá)，提高乳糖在細(xì)胞內(nèi)的利用率，從而促進(jìn)2′-FL 和3-FL 的生物合成[20]。乳糖抑制因子（LacI）的缺失能夠解除LacY 的抑制。因此，敲除LacI后，LacY 將更多的乳糖運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，用于2′-FL 的合成[42]。

2.5 輔因子循環(huán)體系構(gòu)建策略

在微生物細(xì)胞生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 中，存在兩種關(guān)鍵輔因子，一種是鳥(niǎo)苷-5′-三磷酸（GTP），作為生物合成GDP-L-巖藻糖的關(guān)鍵輔因子，它既是GDP 的供體，也是能源物質(zhì)；另一種是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），它可以參與多種代謝反應(yīng)，包括磷酸戊糖途徑（PPP 途徑）、三羧酸循環(huán)途徑（TCA 循環(huán)）以及脫氫酶系統(tǒng)，為生物體提供氫原子，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。

兩種從頭合成途徑的酶（ManC、WcaG）都需要GTP 和NADPH 的參與，而補(bǔ)救途徑的酶（FKP）也需要GTP 的參與才能正常催化。Huang 等[19]選擇8 個(gè)NADPH 再生的相關(guān)基因進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了22 株單基因或聯(lián)合表達(dá)這些基因的菌株。結(jié)果顯示大多數(shù)工程菌對(duì)FL 的產(chǎn)量都有促進(jìn)作用，其中分別導(dǎo)入編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（zwf）和嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（pntAB）的效果最好。在另一項(xiàng)研究中，Li等[40]選擇了9 個(gè)與GTP 和NADPH 再生相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)，其中共表達(dá)zwf 和肌苷鳥(niǎo)苷激酶（gsK）的工程菌對(duì)2′-FL 的產(chǎn)量有最大的促進(jìn)作用。

2.6 自組裝途徑酶的空間組織策略

自組裝途徑酶的空間組織策略作為一種有效的合成生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程策略，通過(guò)構(gòu)建具有明確結(jié)構(gòu)的多酶復(fù)合體，可以建立底物通道，促進(jìn)活性殘基之間的中間轉(zhuǎn)移，控制代謝流量，減少中間擴(kuò)散，從而提高產(chǎn)物產(chǎn)率[51]。Wan 等[48]將一對(duì)來(lái)自cAMP 依賴(lài)蛋白激酶（PKA）的RIDD 和來(lái)自A 激酶錨定蛋白（AKAPs）的RIAD 多肽引入2′-FL 補(bǔ)救合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶FutC 和FKP，構(gòu)建了一個(gè)控制代謝通量的自組裝復(fù)合體，在工程大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)高效的2′-FL 生物合成。此外，該課題組將短肽相互作用對(duì)Riad-RIDD 引入2′-FL 從頭合成途徑自組裝成酶復(fù)合體，并引入另一個(gè)正交的蛋白質(zhì)相互作用基序（Spycatcher-SpyTag 或PDZ-PDZlig）進(jìn)一步聚集成多酶組件。胞內(nèi)多酶組合顯著增加了通向2′-FL 生物合成的通量，與表達(dá)自由漂浮酶和未組裝酶的菌株相比，2′-FL 產(chǎn)量增加了2.1 倍[52]。這表明，通過(guò)構(gòu)建多酶復(fù)合體，能夠控制代謝流量，增加了通向2′-FL 和3-FL 生物合成的通量。

2.7 敲除競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑策略

根據(jù)代謝通量分析，關(guān)鍵中間體果糖-6-磷酸（Fru-6-P）、GDP-D-甘露糖、GDP-L-巖藻糖以及乳糖的分枝代謝可能阻礙2′-FL 和3-FL 的生物合成和積累。為了最大限度地增加流向FL 合成途徑的碳流，Li 等[28]通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)分別敲除由ATP 依賴(lài)的磷酸果糖激酶（由pfkA和pfkB編碼）的Fru-6-P 到Fru-1,6-P 分支途徑、由果糖-6-磷酸縮醛酶（由fsaA和fsaB編碼）的Fru-6-P 到甘油醛-3-P 分支途徑以及由甘露醇-1-磷酸脫氫酶（由mtlD編碼）的Fru-6-P 轉(zhuǎn)化為甘露醇-1-P，與未敲除的菌株相比，2′-FL 和3-FL 的產(chǎn)量得到了明顯提升。

大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙酸酯以及糖酵解副產(chǎn)物，這不僅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒性，而且與2′-FL 合成競(jìng)爭(zhēng)碳源，降低2′-FL 的產(chǎn)量，同時(shí)也不利于后續(xù)的分離純化。Liao 等[53]通過(guò)敲除arcA（厭氧氧化還原控制因子）和iclR（編碼乙醛酸操縱子阻遏蛋白）來(lái)調(diào)節(jié)乙酸代謝，arcA突變體顯著減少了乙酸的積累。然而，iclR的敲除和雙敲除突變體對(duì)2′-FL 的生物合成毫無(wú)益處。一方面，iclR突變體的最大DCW 增加了6.2%，這可能影響了細(xì)胞的生理和代謝；另一方面，iclR的缺失可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不是促進(jìn)2′-FL 的生物合成，但其分子機(jī)制尚不完全清楚。另有一項(xiàng)研究表明，糖酵解副產(chǎn)物的積累不僅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害，而且與乳糖和GDP-L 巖藻糖的合成競(jìng)爭(zhēng)碳源[54]。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)敲除調(diào)節(jié)參與副產(chǎn)物途徑的四種基因，包括用于將乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為乙酸酯的泛醌依賴(lài)的丙酮酸脫氫酶（PoxB）和乙酸激酶-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（ackA-pta）、用于將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸鹽的丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）以及用于將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的D-乳酸脫氫酶（LdhA），進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了工程大腸桿菌中2′-FL 和3-FL 的高效生產(chǎn)。

2.8 菌種改良的組合策略

迄今為止，多數(shù)研究中所述的大腸桿菌中合成FL 的生物合成途徑，主要是通過(guò)在質(zhì)粒上過(guò)度表達(dá)相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的[55]。然而，基于質(zhì)粒的細(xì)胞工廠(chǎng)在發(fā)酵過(guò)程中存在質(zhì)粒丟失的問(wèn)題，并且需要添加抗生素和誘導(dǎo)劑。因此，不含抗生素和誘導(dǎo)劑的生物合成途徑更具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

Parschat 等[56]在大腸桿菌構(gòu)建了一條蔗糖利用途徑，篩選出一個(gè)能夠?qū)DP-半乳糖和葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為乳糖的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GalTpm 1141）。然后，將途徑酶基因、蔗糖利用基因簇（cscABKR）、GalTpm1141 和UDP-半乳糖強(qiáng)化基因（pgi、pgm和galE）通過(guò)染色體整合到大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)了從廉價(jià)碳源蔗糖合成2′-FL 的新途徑，2′-FL 產(chǎn)量達(dá)到64 g/L。另外，Li 等[54]在大腸桿菌BL21（DE3）的染色體上引入了2′-FL 和3-FL 的從頭合成途徑，引入乳糖合成途徑，并對(duì)關(guān)鍵酶啟動(dòng)子的替換，在無(wú)抗生素的補(bǔ)料分批發(fā)酵中產(chǎn)生40.44 g/L的2′-FL 和30.42 g/L 的3-FL。

表達(dá)載體質(zhì)粒與染色體組合的方式也是一種提高FL 產(chǎn)量的可行策略。Liu 等[31]首先通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建2′-FL 的從頭合成途徑，隨后將額外的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（WbgL）表達(dá)盒通過(guò)染色體整合到recA基因座上，以加強(qiáng)巖藻糖化反應(yīng)，并使用一個(gè)強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子（PJ23119）來(lái)取代manC-manB和gmd-wcaG的原始啟動(dòng)子，在搖瓶發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)中，2′-FL 產(chǎn)量分別達(dá)到9.06 g/L 和79.23 g/L。這表明不含抗生素和誘導(dǎo)劑的染色體整合策略可作為構(gòu)建代謝工程菌的外源基因表達(dá)的一種綠色、安全和商業(yè)可行的生產(chǎn)策略。

2.9 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化策略

通過(guò)非理性適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，有助于構(gòu)建高水平的2′-FL 和3-FL 生產(chǎn)工廠(chǎng)。Sun 等[32]對(duì)2′-FL工程菌進(jìn)行了適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，首先通過(guò)紫外誘變獲得3 個(gè)突變體文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)移到24 深孔板中富集有益突變體，隨機(jī)挑取大的菌落對(duì)其生長(zhǎng)狀況和2′-FL 產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)試，并通過(guò)基因組測(cè)序進(jìn)行分析，獲得了一個(gè)rpoC基因突變，可提高細(xì)胞耐受性和2′-FL 的產(chǎn)量，最高可達(dá)61.06±1.93 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.7 g/L/h。因此，通過(guò)非理性適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，篩選有益突變體也是很重要的。

3 其他宿主合成2′-FL 和3-FL 的工程化策略

目前，2′-FL 和3-FL 的生物合成主要以大腸桿菌作為底盤(pán)宿主，但是由于大腸桿菌細(xì)胞含內(nèi)毒素[57]，且易被噬菌體感染[58]，所以其作為食品的生產(chǎn)菌株存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此食品級(jí)微生物宿主具有更大的發(fā)展前景。

3.1 工程酵母菌株生物合成2′-FL 和3-FL

近年來(lái)，一些酵母菌已被廣泛認(rèn)為是生產(chǎn)化學(xué)品的成熟和優(yōu)越的生物生產(chǎn)平臺(tái)，其中包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。在釀酒酵母和解脂耶氏酵母的細(xì)胞質(zhì)中存在相對(duì)豐富的GDP-甘露糖[59]，這是從頭合成途徑中合成GDP-L-巖藻糖的必要前體，而且釀酒酵母和解脂耶氏酵母無(wú)法分解乳糖，這減少了FL 合成途徑中的乳糖損耗。Hollands 等[41]在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中構(gòu)建了2′-FL 的從頭合成途徑，通過(guò)安裝乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Lac12（來(lái)源Kluyveromyces lactis）和將GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖的酶（Gmd 和WcaG），最后引入FucT2 以及分泌2′-FL 的轉(zhuǎn)運(yùn)體CDT2（來(lái)源于Neurospora crassa），工程釀酒酵母和解脂酵母分別通過(guò)補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)生15 和24 g/L的2′-FL。

當(dāng)釀酒酵母以葡萄糖作為碳源時(shí)，會(huì)表現(xiàn)出葡萄糖效應(yīng)，其特征是抑制呼吸和促進(jìn)乙醇的產(chǎn)生。因此，當(dāng)葡萄糖被用作生產(chǎn)2′-FL 的底物時(shí)，葡萄糖的過(guò)度代謝而產(chǎn)生的副產(chǎn)物（乙醇）的積累會(huì)阻礙2′-FL 的高效生產(chǎn)。Lee 等[60]構(gòu)建了一個(gè)利用木糖生產(chǎn)2′-FL 的工程酵母菌株，將編碼2′-FL 生物合成酶的異源基因整合到工程酵母染色體中，以實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達(dá)，并對(duì)工程酵母中整合的外源基因的拷貝數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到2′-FL 產(chǎn)量為25.5 g/L，生產(chǎn)率為0.35 g/L·h。

Xu 等[21]在釀酒酵母中構(gòu)建了一個(gè)生產(chǎn)2′-FL的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)，通過(guò)促進(jìn)GDP-L-巖藻糖的從頭合成，并篩選多個(gè)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)源于蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FutBc 所提升的2′-FL 最顯著，是常用的幽門(mén)螺桿菌α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FutC）的1.8 倍。此外，在GDP-甘露糖轉(zhuǎn)移到GDP-L-巖藻糖的生產(chǎn)預(yù)計(jì)會(huì)干擾釀酒酵母正常的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞壁的生物合成，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。為了提高釀酒酵母中FL 的產(chǎn)量，細(xì)胞生長(zhǎng)和高效的GDP-L-巖藻糖生物合成之間的平衡應(yīng)該得到最好的保證。該課題組通過(guò)重新連接釀酒酵母信息素反應(yīng)途徑開(kāi)發(fā)了一個(gè)自動(dòng)誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)。在交配型“a”酵母中表達(dá)了低親和力的乳酸克魯維酵母的α信息素（Kα）代替天然的釀酒酵母的α信息素（Sα）。在信息素響應(yīng)型α啟動(dòng)子（Pfus1）的控制下，轉(zhuǎn)錄激活子Gal4p 進(jìn)一步增強(qiáng)了Kα誘導(dǎo)的途徑基因的表達(dá)，增加了GDP-L-巖藻糖的積累，進(jìn)一步分批補(bǔ)料發(fā)酵，2′-FL 和3-FL 的產(chǎn)量達(dá)到32.05 g/L 和20.91 g/L[33]。同時(shí)，這也是3-FL 在食品級(jí)微生物宿主的首次報(bào)道。

3.2 工程枯草芽孢桿菌生物合成2′-FL

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種具有GRAS 性質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性菌，其生長(zhǎng)、繁殖速度較快，且具有較高的分泌和生產(chǎn)重組蛋白的能力，在代謝工程和合成生物學(xué)中具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

Ji 等[61]在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了2′-FL 的從頭合成途徑，通過(guò)在枯草桿菌164T7P 的基因組中構(gòu)建了一條從頭途徑，從而獲得了低產(chǎn)量的2′-FL（120 mg/L），隨后引入外源乳糖透性酶（LacY）和阻斷乳糖降解來(lái)提高底物供應(yīng)大大提高了生產(chǎn)效率，2′-FL 的累積產(chǎn)量達(dá)到31.2 g/L。Zhang 等[34]通過(guò)在枯草桿菌引入了2′-FL 的從頭合成途徑，使2′-FL 的產(chǎn)量達(dá)到1.12 g/L，然后通過(guò)減少競(jìng)爭(zhēng)乳糖消耗、增加GTP 的再生和增加前體甘露糖-6-磷酸（M6P）的供應(yīng)，獲得了2.57 g/L 的2′-FL 產(chǎn)量。隨后，通過(guò)優(yōu)化碳源比例，添加20 g/L 的乳糖和80 g/L 的蔗糖時(shí)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了14.29 g/L。最后用啟動(dòng)子P7 取代內(nèi)源manA基因的天然啟動(dòng)子，搖瓶中2′-FL 產(chǎn)量可達(dá)18.27 g/L。最終工程菌在3-L 生物反應(yīng)器中不添加抗生素和化學(xué)誘導(dǎo)劑，2′-FL 產(chǎn)量為88.3 g/L。

動(dòng)態(tài)調(diào)控是微生物細(xì)胞工廠(chǎng)基因表達(dá)控制的有效策略。Yu 等[62]開(kāi)發(fā)了一個(gè)途徑無(wú)關(guān)的可編程系統(tǒng)，使枯草桿菌代謝的多模塊有序控制成為可能。首先，制造了一系列溫度傳感器，并對(duì)其進(jìn)行了設(shè)計(jì)，以擴(kuò)大它們的閾值。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了基于不同過(guò)渡點(diǎn)溫度傳感器的單輸入多輸出順序控制電路。同時(shí)，結(jié)合基于CRISPRi 的非門(mén)電路，構(gòu)建了抑制電路。作為概念驗(yàn)證，將這些遺傳電路應(yīng)用2-FL 生物合成，并將其分為3 個(gè)模塊：2′-FL 合成模塊、GTP 供給模塊、競(jìng)爭(zhēng)途徑模塊，以此實(shí)現(xiàn)多模塊的有序控制，在搖瓶中的產(chǎn)量為1.84 g/L，是親本菌株的5.16 倍。在5-L 生物反應(yīng)器中，2-FL 產(chǎn)量達(dá)到28.2 g/L。

3.3 工程谷氨酸棒狀桿菌生物合成2′-FL

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，有著優(yōu)良的氨基酸生物合成和分泌能力。Seo 等[35]首次報(bào)道了在谷氨酸棒桿菌中通過(guò)從頭合成途徑生產(chǎn)2′-FL，隨后在此基礎(chǔ)引入乳糖透過(guò)酶基因lacY，并進(jìn)一步對(duì)fucT2進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，再以葡萄糖為碳源分批補(bǔ)料培養(yǎng)120 h 后，發(fā)酵產(chǎn)物2′-FL 產(chǎn)量為8.1 g/L，乳糖得率為0.42 mol/mol。

4 結(jié)論與展望

在微生物法合成方面，目前研究主要集中在應(yīng)用代謝工程策略合成。盡管合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展促進(jìn)了建造細(xì)胞工廠(chǎng)和進(jìn)一步高效地生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 的各種策略，但2′-FL 和3-FL 的生物合成還需要更系統(tǒng)的策略。為了構(gòu)建高效生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 的工程菌株，應(yīng)加強(qiáng)供體的GDP-L-巖藻糖的供應(yīng)，提高乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)和可利用性，篩選并提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的功能表達(dá)以及促進(jìn)2′-FL 和3-FL 外排等。

此外，基于代謝工程的微生物法生產(chǎn)2′-FL 和3-FL 可能由于前體底物和輔因子的供應(yīng)不平衡或細(xì)胞生長(zhǎng)與2′-FL 和3-FL 合成之間的不平衡而產(chǎn)生不平衡的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)。動(dòng)態(tài)調(diào)控是微生物細(xì)胞工廠(chǎng)基因表達(dá)控制的一種策略，也是代謝工程優(yōu)化的最有效策略之一。因此，通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控設(shè)計(jì)的基因編碼代謝控制系統(tǒng)，能夠促進(jìn)宿主根據(jù)內(nèi)部和外部代謝狀態(tài)自主平衡代謝通量，以最大限度地提高宿主生產(chǎn)力和產(chǎn)量。

未來(lái)，更多的生物工程技術(shù)，包括蛋白質(zhì)工程、代謝工程、發(fā)酵工程將被應(yīng)用到2′-FL 和3-FL 合成的研究中，不僅可以進(jìn)一步提高生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，而且可以建立一些通用的策略，指導(dǎo)其他HMOs的大規(guī)模生產(chǎn)。

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