流式細(xì)胞技術(shù)在抗生素抑菌實驗中的應(yīng)用

蔣海霞， 許 杰

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

0 引 言

在抗生素抑菌能力研究中，快速檢測靶標(biāo)細(xì)菌的生長或活力狀態(tài)至關(guān)重要［1］。目前檢測細(xì)菌生長和活力的經(jīng)典方法主要是平板抑菌圈法和細(xì)菌細(xì)胞透性檢測法（包括膜電勢測量法和Ca2+濃度測量法等）［2-4］。盡管這些方法比較成熟，但是存在耗時長、誤差大、操作繁瑣等問題，難以滿足抗生素抑菌能力實驗中快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)菌生長狀態(tài)的要求，因此尋找可用于抗生素抑菌檢測的新方法很有必要。

流式細(xì)胞儀（FCM）已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、腫瘤醫(yī)學(xué)和臨床檢驗等領(lǐng)域［5-6］。流式細(xì)胞儀具有靈敏、精確、高效、樣品前處理簡單等優(yōu)勢，可快速采集多參數(shù)數(shù)據(jù)［7］。目前流式細(xì)胞儀在真核細(xì)胞凋亡方面的檢測已經(jīng)比較成熟，可以實現(xiàn)對活細(xì)胞和死細(xì)胞的有效區(qū)分［8］。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞存在固有差異（如細(xì)胞的大小、細(xì)胞壁組成、細(xì)胞核的有無、染色質(zhì)狀態(tài)等），而流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分原核細(xì)胞（如細(xì)菌）生長狀態(tài)方面的研究還相對較少。近年來，隨著各類熒光染料的出現(xiàn)與流式細(xì)胞儀等技術(shù)的發(fā)展，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光信號來分析細(xì)菌等微生物成為可能。李森［9］通過系統(tǒng)分析影響流式細(xì)胞儀定量檢測結(jié)果的各種因素，優(yōu)化進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣速率、SYBR GreenⅠ和碘化丙啶（PI）染料濃度、染色溫度和染色時間，建立了適用于水環(huán)境樣品細(xì)菌活性分析的快速定量檢測方法。鄧穎［10］通過研究染料熒光團(tuán)SYTO 9 和PI 的細(xì)菌染色特性、染色濃度和染色時間，評估流式細(xì)胞儀定量檢測大腸桿菌活性的效果。以上研究表明，利用流式細(xì)胞技術(shù)可實現(xiàn)細(xì)菌死活狀態(tài)的檢測，但是流式細(xì)胞技術(shù)在抗生素抑菌實驗中的研究幾乎沒有相關(guān)文獻(xiàn)。

黃單胞菌屬病原細(xì)菌可以侵染超過400 種植物，是我國目前防治的重點病害微生物之一［11］。申嗪霉素（Shenqinmycin）是假單胞菌Pseudomonas 代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-Carboxylic Acid，PCA）的商業(yè)名稱，由上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院與上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司自主研發(fā)、具有廣譜抗菌活性的一種新型微生物源殺菌劑（農(nóng)用抗生素），前期研究表明申嗪霉素在黃單胞菌的防治中起到較好的作用［12-13］。因此，以申嗪霉素對黃單胞菌抑菌效果為例，利用流式細(xì)胞技術(shù)開發(fā)細(xì)菌凋亡的快速檢測方法，尤其精準(zhǔn)分析細(xì)菌的活力狀態(tài)，為抗生素等藥物抑菌機理檢測提供支持。

1 材料與方法

1.1 申嗪霉素溶液配制和處理時間

采用甲醇配制申嗪霉素母液（200 mg/mL），以最大水溶度進(jìn)行梯度稀釋：20、2、0.2、0.02 mg/mL，分別加入對數(shù)生長期的黃單胞菌培養(yǎng)液里，1 和2 h后分別取樣檢測。

1.2 細(xì)菌樣品準(zhǔn)備

取不同質(zhì)量濃度申嗪霉素、處理1 h和2 h后的黃單胞菌培養(yǎng)菌液，采用分光光度計檢測，在光密度值為1 的基礎(chǔ)上再稀釋10 倍，重懸的菌液顆粒含量為1 ×107個/mL。

1.3 樣本制備

樣本采用碧云天Annexin-V-FITC 凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色處理。按照產(chǎn)品說明書將處理后的細(xì)菌離心，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌一次，再將試劑盒中組分Annexin-V-FITC 和PI 按照20∶1比例重懸，室溫避光孵育15 min后上機檢測。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測方法及參數(shù)設(shè)置

本實驗測試儀器是美國Beckman Coulter 公司的Cytoflex流式細(xì)胞儀。

鑒于原核細(xì)胞的體積較小，設(shè)置反映細(xì)胞直徑大小的前向散射光（FSC）和側(cè)向散射光（SSC）的信號值為對數(shù)放大，同時設(shè)置FSC信號閾值為5 ×103。建立雙參數(shù)FSC-A和SSC-A散點圖以及雙參數(shù)FITC-A和PE-A散點圖（硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC；藻紅蛋白，PE；面積，A），采用未經(jīng)染色的對照樣品調(diào)節(jié)光電倍增管電壓，將Annexin-V-FITC和PI分別單獨染色的對照樣品調(diào)節(jié)熒光補償（通過互補矩陣?yán)锏膮?shù)設(shè)置），得到合適的流式細(xì)胞圖。在雙參數(shù)FSC-A 和SSC-A 散點圖中找到細(xì)菌最集中的區(qū)域設(shè)門P1，圈出所需分析的細(xì)菌（見圖1，F(xiàn)SC-A 和SSC-A 表示散射光強度的相對值）。收集1 ×104個細(xì)菌進(jìn)行流式分析。FITC 通道檢測波長為530/30 nm，PE 通道檢測波長為586/15 nm，F(xiàn)ITC 通道收集Annexin-V-FITC 綠色熒光，PE 通道收集PI紅色熒光，獲得FITC-A和PE-A散點圖。

圖1 基于FSC-A和SSC-A散點圖的細(xì)菌設(shè)門

2 結(jié)果與分析

2.1 對照設(shè)置和染色分析

在細(xì)菌凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，Annexin-V-FITC與之結(jié)合呈現(xiàn)陽性，此時細(xì)胞膜還是完整的，PI 無法穿透細(xì)胞膜染色而呈現(xiàn)陰性；在細(xì)菌凋亡晚期，細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin-V-FITC和PI 都可以對細(xì)胞染色而呈現(xiàn)雙陽性；已經(jīng)死亡的細(xì)菌因細(xì)胞膜已經(jīng)被破壞、Annexin-VFITC無法結(jié)合磷脂酰絲氨酸而呈現(xiàn)陰性，PI可以對細(xì)胞染色而呈現(xiàn)陽性。因此，取未經(jīng)染色的菌體PBS 懸液作為雙陰性對照，經(jīng)申嗪霉素處理（20 mg/mL 處理1 h）的細(xì)菌用Annexin-V-FITC單獨染色作為單陽性對照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理30 min 的細(xì)菌用PI 單獨染色作為另一單陽性對照。FITC-A 和PE-A 散點圖（FITC-A 和PE-A 代表熒光強度的相對值）分析結(jié)果表明：未經(jīng)染色雙陰性細(xì)菌位于四象限的左下象限Q1-LL［見圖2（a）］，經(jīng)申嗪霉素處理和Annexin-VFITC染色為陽性的細(xì)菌位于四象限的右下象限Q1-LR［見圖2（b）］，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理30 min和PI染色為陽性的細(xì)菌位于四象限的左上象限Q1-UL［見圖2（c）］。結(jié)果表明，流式細(xì)胞技術(shù)能夠較好地區(qū)分凋亡不同階段或不同狀態(tài)的黃單胞菌。

圖2 對照組的FITC-A和PE-A散點圖分析

2.2 時間和梯度分析

為了進(jìn)一步探究流式細(xì)胞儀在檢測黃單胞菌凋亡中的靈敏度和準(zhǔn)確度，采用2 個處理時間和4 個梯度質(zhì)量濃度的雙因素疊加分析（見圖3）。橫向?qū)Ρ炔煌|(zhì)量濃度的抑菌效果。結(jié)果表明：處理1 h 后，隨著申嗪霉素質(zhì)量濃度的逐漸增加（0.02 ～20 mg/mL），Annexin-V-FITC和PI 雙陽性的細(xì)胞位于四象限的右上象限Q1-UR，凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比逐漸增加，從4.30%、6.18%、12.81%增加到20.61%［見圖3（a）～（d）］；處理2 h后得到類似的結(jié)論，凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比從18.82%、23.43%，29.64%增加到37.95%［見圖3（e）～（h）］。這表明申嗪霉素質(zhì)量濃度越高，抑菌（黃單胞菌）能力越強。

圖3 實驗組的FITC-A和PE-A散點圖

進(jìn)一步兩兩縱向分析相同質(zhì)量濃度和不同處理時間下的效果［見圖3（a）、（e），圖3（b）、（f），圖3（c）、（g），圖3（d）、（h）］。結(jié)果表明：相同申嗪霉素質(zhì)量濃度時，隨著處理時間的增加，Annexin-V-FITC 和PI 雙陽性細(xì)胞凋亡晚期的壞死細(xì)胞百分比相應(yīng)增加，0.02 mg/mL下為4.30% ～18.82%［見圖3（a）、（e）］，0.2 mg/mL 下為6.18% ～23.43%［見圖3（b）、（f）］，2 mg/mL下為12.81% ～29.64%［見圖3（c）、（g）］，20 mg/mL下為20.61% ～37.95%［圖3（d）、（h）］。以上數(shù)據(jù)表明，相同質(zhì)量濃度下，隨著處理時間的延長，申嗪霉素抑菌（黃單胞菌）能力越強。

3 討 論

經(jīng)典的平板抑菌圈法檢測申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果難以量化［14-15］，而且也難以快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)菌的生長狀態(tài)。本研究基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜完整性和通透性的改變所導(dǎo)致的Annexin-V-FITC和PI染色差異，提出通過流式細(xì)胞技術(shù)建立細(xì)胞凋亡的快速檢測方法，可以有效地解決細(xì)胞凋亡快速檢測問題。

本研究重點分析時間和濃度雙層因素下，流式細(xì)胞技術(shù)檢測申嗪霉素對黃單胞菌抑制的變化。相同處理時間下，申嗪霉素質(zhì)量濃度越高，凋亡晚期的壞死細(xì)胞越多，但是死亡細(xì)胞的比例（Q1-UL）變化不明顯（見圖3）。以處理時間1 h 和2 h 為例，隨著申嗪霉素質(zhì)量濃度（0.02 ～20 mg/mL）的逐漸增加，Annexin-VFITC陰性而PI 陽性的細(xì)胞位于四象限的左上象限Q1-UL，死亡細(xì)胞百分比變化不明顯（見圖3）。相同申嗪霉素質(zhì)量濃度下，隨著處理時間的增加（1 h 和2 h），死亡細(xì)胞百分比（Q1-UL）明顯增加（見圖3）。本研究進(jìn)一步量化了不同質(zhì)量濃度和不同處理時間下申嗪霉素對黃單胞菌的抑菌效果，也為實際用藥量和作用時間提供了數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié) 語

流式細(xì)胞儀在動物細(xì)胞研究領(lǐng)域使用頻率很高，但在微生物領(lǐng)域使用較少。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院儀器共享與技術(shù)服務(wù)平臺依托微生物代謝國家重點實驗室，進(jìn)一步拓展了流式細(xì)胞儀在微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用，以期為抗生素等藥物抑菌機理研究檢測技術(shù)提供支持。