王金霞，魏志寶，陳雪妍，李 榮，張 倩，胡麗筠，羅瑞明

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

灘羊以其營養(yǎng)豐富、無膻味、肉質(zhì)細(xì)嫩而著稱，作為寧夏等地的區(qū)域性優(yōu)質(zhì)家畜品種，其具有重要的經(jīng)濟(jì)及食用價(jià)值。消費(fèi)者往往通過肉表面的顏色判斷肉的健康與新鮮程度，長期以來，肉色褐變已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]，因此探究動(dòng)物宰后貯藏期間影響肉色的因素從而提高肉色穩(wěn)定性，避免造成損失是當(dāng)前的首要任務(wù)。

肉的色澤穩(wěn)定性通常由肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、血紅蛋白和一些微量有色代謝物維持。在充分放血的肌肉中，Mb含量占總色素含量的75%左右[2]，是影響宰后肉色澤穩(wěn)定性的主要因素[3]。由于血紅素在肉中具有多種存在形式，因此可以形成許多豐富的肉色，比如鮮紅色、紫紅色、深褐色，甚至還有綠色、灰色等比較少見的顏色[4]。

氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）系統(tǒng)由線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈（electron transfer chain，ETC）和ATP合成酶（復(fù)合物V）組成，是物質(zhì)在線粒體內(nèi)氧化釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機(jī)磷酸合成ATP的偶聯(lián)反應(yīng)。氧化磷酸化可產(chǎn)生ATP，從而滿足細(xì)胞行使功能所需能量[5]；同時(shí)氧化磷酸化參與調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵細(xì)胞活動(dòng)，例如活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和封存[6]、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老等[7]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是能夠揭示細(xì)胞/組織生長、發(fā)育、代謝等生命現(xiàn)象本質(zhì)變化的分子生物學(xué)篩選技術(shù)[8]。它是一種最直接、有效的蛋白質(zhì)研究手段，可以對(duì)細(xì)胞/組織中全部蛋白質(zhì)表達(dá)水平、組成成分以及修飾狀態(tài)的變化進(jìn)行分析，從而對(duì)蛋白質(zhì)之間的交互關(guān)系進(jìn)行全面說明，從分子水平上對(duì)蛋白質(zhì)的功能和細(xì)胞代謝的生命活動(dòng)進(jìn)行深入探討[9]。Wu Shuang等[10]以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，研究了黑切牛肉的顏色變化，結(jié)果表明，較高的脫氧Mb含量、耗氧率、高鐵肌紅蛋白（methemoglobin，MetMb）還原活性和較低的脂質(zhì)氧化作用使得黑切牛肉具有較低的a*值和較高的肉色穩(wěn)定性。Hughes等[11]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，光的散射和吸收與結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)量變化顯著相關(guān)。劉吉娟等[12]采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)對(duì)不同貯藏時(shí)間的灘羊肉進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)主要涉及肌肉收縮、ATP酶活性調(diào)控的差異蛋白，并最終影響灘羊肉持水性。綜上，利用蛋白組學(xué)技術(shù)可以從分子水平上闡明肉品質(zhì)在貯藏過程中的變化機(jī)制，但目前鮮見從分子水平揭示氧化磷酸化影響肉色穩(wěn)定的機(jī)制研究。

本實(shí)驗(yàn)采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究貯藏0、4、8 d灘羊肉中差異蛋白的表達(dá)變化，篩選與氧化磷酸化相關(guān)差異蛋白，鑒定0～4 d和4～8 d兩個(gè)貯藏階段共有的差異豐度蛋白質(zhì)，采用Cytoscape軟件鑒定核心網(wǎng)絡(luò)；將所篩選的差異蛋白標(biāo)注于氧化磷酸化通路上，從通路水平揭示氧化磷酸化調(diào)控灘羊肉色澤穩(wěn)定性的機(jī)制，旨在為灘羊肉宰后肉品色澤穩(wěn)定性控制提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取12 只來自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司且胴體質(zhì)量相近的6 月齡公灘羊的右側(cè)背最長肌，屠宰后采用滅菌刀立即剔除可見脂肪與結(jié)締組織，置于聚乙稀薄膜內(nèi)，采用錫紙包裝后置于帶有編號(hào)的保鮮袋中，并將記為0 d的樣本置于液氮中暫時(shí)保存，將需要成熟4、8 d的樣本置于4 ℃的保溫箱貯藏，待樣本成熟后，立即將0、4、8 d的樣本轉(zhuǎn)置于－80 ℃冰箱中保存，用于各指標(biāo)的測定。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司；乙腈（分析純）美國賽默飛世爾科技公司；三乙二胺碳酸鹽、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國普洛麥格公司；十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；ROS探針 上海懋康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；JXFSTPRP-CL全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀 上海凈信有限公司；352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；TGL-24M高速冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；Sciex Triple TOF-5600質(zhì)譜儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司；ImageScanner掃描儀 美國GE Healthcare公司；VCX-130超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 美國Sonics公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；Mini-PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

準(zhǔn)確稱取貯藏0、4、8 d的樣品各500 mg，于液氮中迅速冷凍后放置到-80 ℃的冰箱中，用于蛋白質(zhì)組學(xué)的測定和其他指標(biāo)的測定。采集0、4、8 d的樣品各10 g，用于測定CAT、SOD、GSH-Px活性、ROS含量的測定。

1.3.2 CAT活性測定

參照CAT檢測試劑盒說明書進(jìn)行，使用紫外-可見分光光度計(jì)于240 nm波長處測定。

1.3.3 SOD活性測定

參照SOD檢測試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在560 nm波長處測定。

1.3.4 GSH-Px活性測定

參照GSH-Px檢測試劑盒說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀在340 nm波長處測定。

1.3.5 線粒體活性氧含量測定

參考張玉林[13]的方法，并略作修改。準(zhǔn)確稱取已經(jīng)剔除脂肪與結(jié)締組織的肉樣0.1 g，置于Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、10 mmol/L蔗糖，pH 7.4）中混合備用，4 ℃、60 Hz勻漿30 s后，3 000×g冷凍離心15 min并收集上清液，采用雙縮脲法測定上清液的蛋白濃度。

取100 μL上清液與100 μL反應(yīng)緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、10 mmol/L蔗糖、10 μmol/L 2,7-二氯熒光素二乙酸酯，pH 7.4）在酶標(biāo)板內(nèi)迅速混合，于激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長525 nm處立即測定孵育前的熒光強(qiáng)度，再置于37 ℃孵育箱內(nèi)孵育30 min，再次測定孵育后熒光強(qiáng)度，ROS水平按下式計(jì)算：

1.3.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

參考尤麗琴等[14]的方法提取灘羊肉中的總蛋白質(zhì)。iTRAQ-蛋白質(zhì)組學(xué)分析委托上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行，運(yùn)用Analyst TS 1.1軟件獲得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。采用Protein Pilot 5.0軟件獲得蛋白質(zhì)的定性及定量信息。通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索Ovisaries數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.6或FC＜1/1.6且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異豐度蛋白質(zhì)，并利用OmicsBean軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，比對(duì)后獲得差異蛋白的基因本體論（Gene Ontology，GO）功能信息，選擇差異最顯著的前10 個(gè)條目作圖。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對(duì)所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析。利用String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選。將所篩選的差異蛋白標(biāo)注于氧化磷酸化通路上，從通路水平揭示氧化磷酸化調(diào)控灘羊肉色澤穩(wěn)定性的機(jī)制。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Origin 2021軟件作圖，R軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源抗氧化酶體系活性的變化

如圖1 所示，貯藏0～4 d CAT 活性顯著下降（P＜0.05），貯藏4～8 d其活性顯著上升（P＜0.05），表明抗氧化酶體系清除自由基的能力開始減弱。貯藏期間SOD活性隨著貯藏時(shí)間的延長呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），表明SOD清除超氧陰離子自由基的能力變?nèi)鮗15]。GSH-Px活性在貯藏期間顯著下降（P＜0.05），表明GSH-Px將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和分子氧的能力變?nèi)鮗16]。

圖1 貯藏期間內(nèi)源抗氧化物酶體系活性的變化Fig.1 Changesin endogenous antioxidant enzyme activities during storage

2.2 貯藏期間線粒體ROS含量的變化

如圖2所示，灘羊背最長肌的ROS含量隨貯藏時(shí)間的延長顯著上升（P＜0.05），這是因?yàn)閮?nèi)源抗氧化酶的活力隨貯藏時(shí)間的延長而降低，導(dǎo)致ROS逐漸積累增加[17]。

圖2 貯藏期間ROS水平變化Fig.2 Changes in ROS contents during storage

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

如圖3所示，貯藏過程可以很好地區(qū)別樣本，相同貯藏期的樣本之間區(qū)別不顯著，而不同貯藏期的樣本之間區(qū)別顯著，以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)樣品收集合理，并且蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可靠，可以滿足后續(xù)分析的需要。

圖3 3 個(gè)貯藏期樣本蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of proteomic data of samples in three storage periods

2.4 差異豐度蛋白質(zhì)篩選

如圖4所示，4 d對(duì)比0 d組記為4/0 d組，8 d對(duì)比4 d組記為8/4 d組，共鑒定出164 個(gè)豐度差異顯著蛋白質(zhì)。其中4/0 d組共鑒定出71 個(gè)豐度差異顯著蛋白質(zhì)，53 個(gè)顯著上調(diào)，18 個(gè)顯著下調(diào)；8/4 d組共鑒定出93 個(gè)豐度差異顯著蛋白質(zhì)，其中11 個(gè)顯著上調(diào)，82 個(gè)顯著下調(diào)。

圖4 3 個(gè)貯藏期樣本的差異蛋白火山圖Fig.4 Volcano maps of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

2.5 篩選蛋白的生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)

2.5.1 GO功能注釋富集統(tǒng)計(jì)

利用GO注釋對(duì)所篩選出的差異豐度蛋白質(zhì)從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）3 個(gè)角度對(duì)其功能進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)。由圖5a可知，4/0 d組的差異豐度蛋白質(zhì)富集到406 個(gè)BP、98 個(gè)CC、95 個(gè)MF；由圖5b可知，8/4 d組的差異豐度蛋白質(zhì)富集到699 個(gè)BP、85 個(gè)CC、168 個(gè)MF。

圖5 3 個(gè)貯藏期樣本差異豐度蛋白的生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)Fig.5 Bioinformatic statistics of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

由圖6a可知，灘羊宰后貯藏0～4 d期間，差異豐度蛋白主要參與的BP包括肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、小分子代謝過程以及ATP代謝過程等；CC主要包括肌節(jié)、細(xì)胞外泌體、胞外細(xì)胞器、細(xì)胞外膜結(jié)合細(xì)胞器、橫紋肌細(xì)絲等；MF主要包括維生素結(jié)合、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、電子載流子活性等過程。灘羊屠宰后貯藏初期肌肉收縮、前體代謝和能量的產(chǎn)生、ATP代謝過程等發(fā)生變化，這些變化可能引起線粒體損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量無法正常交換，能量代謝活動(dòng)發(fā)生紊亂，致使MetMb無法被進(jìn)一步還原，導(dǎo)致肌肉中3 種Mb的含量與存在形式發(fā)生改變，最終對(duì)灘羊肉色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

由圖6b可以看出，灘羊宰后貯藏4～8 d期間，差異蛋白主要參與的BP包括ATP代謝過程、核苷二磷酸化、嘌呤核苷單磷酸代謝過程等；CC主要包括細(xì)胞外膜細(xì)胞器、細(xì)胞外泌體、膜結(jié)合囊泡、肌纖維、收縮纖維等；MF主要包括抗氧化物活性、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、MHCII類蛋白復(fù)合物結(jié)合等過程。灘羊屠宰后貯藏后期，差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及過氧化物酶活性、橫紋肌收縮和ATP代謝過程等反應(yīng)過程，這些代謝過程的變化可能影響內(nèi)源氧化還原酶系統(tǒng)的活性，促使肌細(xì)胞線粒體能量代謝受到影響，引起肌肉組織收縮，直接影響3 種Mb的存在狀態(tài)和含量，最終對(duì)灘羊肉色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.5.2 KEGG通路統(tǒng)計(jì)

將3 個(gè)貯藏期所篩選的164 個(gè)差異豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路注釋統(tǒng)計(jì)，如圖7所示，4/0 d組共顯著富集于16 條KEGG通路，8/4 d組共顯著富集于18 條KEGG通路。

圖7 3 個(gè)貯藏期樣本差異蛋白的KEGG通路注釋Fig.7 KEGG pathway annotation of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

灘羊宰后貯藏0～4 d期間，差異蛋白主要參與碳代謝、代謝途徑、2-氧代羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及心肌收縮等通路；宰后貯藏4～8 d期間，差異蛋白主要參與氨基酸合成、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、氧化磷酸化、HIF-1信號(hào)通路等。宰后初期，所篩選的差異蛋白并未明顯富集于氧化磷酸化通路的根本原因可能是同一個(gè)差異蛋白可富集于不同的信號(hào)通路，例如氧化磷酸化復(fù)合物亞基COX5A、COX4I1及COX5B等都顯著富集在心肌收縮通路中。以上代謝過程可能通過影響宰后肌細(xì)胞線粒體能量代謝活動(dòng)從而影響高鐵肌紅蛋白還原酶（metmyoglobin reductase，MetMbase）體系，最終影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性。同時(shí)，所篩選的差異蛋白可以顯著富集到氧化磷酸化代謝通路，且隨貯藏時(shí)間的延長其上的相關(guān)酶會(huì)發(fā)生改變，MetMbase系統(tǒng)又受氧化磷酸化的調(diào)控。因此，本研究將以氧化磷酸化通路中關(guān)鍵蛋白的差異變化為重點(diǎn)，初步闡明氧化磷酸化通路上關(guān)鍵蛋白對(duì)灘羊肉色澤穩(wěn)定性產(chǎn)生的影響。

2.6 核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Venn網(wǎng)站（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選3 個(gè)貯藏期共有的差異蛋白，如圖8所示，4/0 d組與8/4 d組共有的差異蛋白為28 個(gè)，并將這28 個(gè)差異蛋白列于表1中。通過String網(wǎng)站（https://www.string-db.org/）對(duì)28 個(gè)共有的差異蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，如圖9所示，該網(wǎng)絡(luò)中PPI的富集P值為1.0×10-16，聚類系數(shù)為0.556。共有34 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)，78 條邊位于該互作網(wǎng)絡(luò)中，表明24 個(gè)差異蛋白之間具有明顯的互作關(guān)系。

表1 3 個(gè)貯藏期樣本共有的差異蛋白變化Table 1 Changes in shared differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

圖8 3 個(gè)貯藏期樣本差異蛋白的Venn圖Fig.8 Venn diagrams of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

圖9 3 個(gè)貯藏期樣本共有差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 Interaction network diagram of shared differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中并采用MCODE篩選該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中與氧化磷酸化相關(guān)的核心網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖10所示。核心網(wǎng)絡(luò)上共有8 個(gè)的差異蛋白在氧化磷酸化通路中，分別為細(xì)胞色素c氧化酶亞基5A（cytochrome c oxidase subunit 5A，COX5A）、COX2、ATP合酶亞基α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A1）、ATP合酶亞基O（ATP synthase peripheral stalk subunit OSCP，ATP5O）、ATP合酶亞基D（ATP synthase peripheral stalk subunit D，ATP5H）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合鐵硫亞基B（succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B，SDHB）、ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶（ADP/ATP translocase 1，SLC25A4）和細(xì)胞色素c（cytochrome c，CYCS），其中ATP5A1、ATP5O、ATP5H參與線粒體中氫離子的轉(zhuǎn)運(yùn)；COX5A指導(dǎo)COX的正確裝配，維持COX結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，COX2為細(xì)胞色素c氧化酶亞基2；SDHB負(fù)責(zé)將電子從琥珀酸鹽轉(zhuǎn)移到泛醌；SLC25A4負(fù)責(zé)催化ADP和ATP在膜上的交換。因此，認(rèn)為這8 個(gè)上調(diào)表達(dá)的差異蛋白是影響灘羊宰后貯藏期間氧化磷酸化的核心差異蛋白。

2.7 氧化磷酸化通路

為了將所篩選出的核心差異蛋白在氧化磷酸化通路中的變化進(jìn)行可視化展示，以KEGG代謝途徑作為媒介，將差異蛋白標(biāo)注于氧化磷酸化通路中。由圖11a可知，宰后貯藏0～4 d差異蛋白ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS均上調(diào)表達(dá)，線粒體蛋白Ndufv1、Ndufa8、COX5B及COX4也在貯藏初期上調(diào)表達(dá)，而COX2、COX3下調(diào)表達(dá)；Ndufv1、Ndufa8為泛醌氧化還原酶核心亞基，COX2、COX3、COX4、COX5A及COX5B均為細(xì)胞色素c氧化酶的核心亞基[18]。由圖11b可知，貯藏4～8 d氧化磷酸化通路上仍有多個(gè)差異蛋白上調(diào)表達(dá)，其中Ndufa13為NADH還原酶亞基，QCR8是泛醇-細(xì)胞色素c還原酶的亞基，負(fù)責(zé)編碼低分子質(zhì)量的泛醌結(jié)合蛋白。但宰后初期上調(diào)表達(dá)的COX4未發(fā)現(xiàn)明顯變化，Ndufab1、COX5A顯著下調(diào)表達(dá)。

圖11 核心差異蛋白在氧化磷酸化通路的注釋Fig.11 Annotation of the core differentially expressed proteins in the oxidative phosphorylation pathway

2.8 貯藏期間Mb表達(dá)量變化

如表2所示，貯藏0～4 d Mb表達(dá)量下調(diào)，這可能是因?yàn)闄C(jī)體供養(yǎng)方式的改變，促使Mb的初級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起其開始下調(diào)表達(dá)[19]，貯藏4～8 d期間，Mb為下調(diào)表達(dá)，這可能是因?yàn)殡S著貯藏時(shí)間的延長含量氧的降低使肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，造成線粒體功能受損，最終導(dǎo)致Mb表達(dá)量下降[20]。灘羊背最長肌的Mb表達(dá)量在整個(gè)貯藏期呈顯著下降趨勢(shì)，這是因?yàn)镸b二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)隨貯藏時(shí)間的延長發(fā)生分子重排，引起部分分子間的二硫鍵被破壞，導(dǎo)致Mb構(gòu)象由規(guī)整向松散分布，致使Mb結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降[21]，最終導(dǎo)致灘羊背最長肌中的Mb表達(dá)量在整個(gè)貯藏期顯著下降。

表2 貯藏期間灘羊背最長肌中Mb表達(dá)量變化Table 2 Changes in Mb expression in M.longissimus dorsi muscle of Tan sheep between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

2.9 影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性的機(jī)制

由圖12可知，Mb表達(dá)量與ATP5A1、SDHB、SLC25A4、CYCS呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），與ATP5O、ATP5H顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而其與COX2、COX5A呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001）；ATP5A1與ATP5O、ATP5H、SLC25A4均極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與SDHB、CYCS高度顯著正相關(guān)（P＜0.001），與COX2、COX5A呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；ATP5O、ATP5H與COX2、COX5A并無顯著相關(guān)性，這可能是因?yàn)镃OX2、COX5A直接影響ATP5A1的表達(dá)量，從而間接對(duì)ATP5O、ATP5H產(chǎn)生影響；SDHB、SLC25A4、CYCS均與各指標(biāo)顯著相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，氧化磷酸化通路上的差異蛋白ATP5A1、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS直接影響灘羊肉Mb的表達(dá)量，同時(shí)這些核心差異蛋白質(zhì)也可能通過間接方式影響灘羊背最長肌的色澤穩(wěn)定性。

圖12 灘羊肉Mb表達(dá)量與氧化磷酸化核心蛋白質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.12 Correlation analysis between Mb expression level and core proteins of oxidative phosphorylation in Tan sheep meat

3 討論

ROS是具有活性化學(xué)性質(zhì)的信號(hào)分子，能降低線粒體抗氧化能力，造成線粒體損傷[22]，主要來自線粒體細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體受損或處于缺血缺氧狀態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生過量的ROS，線粒體產(chǎn)生ROS的速率受線粒體內(nèi)膜跨膜電位的調(diào)節(jié)。本研究中灘羊宰后貯藏期間灘羊背最長肌中的ROS含量顯著上升，這是因?yàn)殡S著貯藏時(shí)間的延長內(nèi)源抗氧化酶逐漸失活，不能及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過量的ROS，導(dǎo)致ROS含量逐漸積累增加，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終引起細(xì)胞凋亡[23]。

機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)能夠清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS[24]。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中最重要的酶，主要負(fù)責(zé)催化超氧陰離子歧化成過氧化氫[25]，CAT進(jìn)一步將過氧化氫催化分解為水和氧氣。馬森[26]提出GSH-Px通過激活谷胱甘肽介導(dǎo)了過氧化物、羥基等多種ROS的產(chǎn)生，從而維持了線粒體的穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)SOD、GSHPx活性隨著貯藏時(shí)間的延長均顯著下降，這說明內(nèi)源抗氧化酶系統(tǒng)清除氧自由基的活力開始變?nèi)?。而CAT活性在貯藏0～4 d顯著下降，但在4 d后卻顯著上升，這可能是因?yàn)橥赟OD活力的上升催化產(chǎn)生了過多的過氧化氫，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，致使CAT活力開始升高[27]。

宰后灘羊肉的貯藏時(shí)間與肌細(xì)胞線粒體內(nèi)能量代謝活動(dòng)具有顯著相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)不同貯藏階段蛋白差異水平有顯著變化，在貯藏期間顯著上調(diào)或下調(diào)，且多個(gè)顯著變化的差異蛋白可以富集于氧化磷酸化通路。灘羊宰后貯藏0～4 d，顯著差異蛋白ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4及CYCS均富集于氧化磷酸化通路；貯藏4～8 d，除所篩選出的8 個(gè)核心差異蛋白外，差異蛋白Ndufab1、COX5A也富集于氧化磷酸化過程。雖然不同貯藏期鑒定的差異蛋白表達(dá)量并不相同，但這些差異蛋白在KEGG中均注釋于能量代謝，這說明動(dòng)物屠宰后，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變會(huì)引起組織內(nèi)能量代謝相關(guān)酶亞基表達(dá)發(fā)生變化[28]。線粒體蛋白質(zhì)組在轉(zhuǎn)錄、翻譯和活性等多個(gè)層面上存在協(xié)同作用，因此富集于氧化磷酸化通路上差異蛋白的上調(diào)/下調(diào)表達(dá)則說明肌細(xì)胞線粒體通過調(diào)節(jié)氧化磷酸化復(fù)合物的表達(dá)量和活性，保持正常的能量代謝活動(dòng)，從而應(yīng)對(duì)由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變而造成的線粒體損傷。蛋白質(zhì)水平的上調(diào)表達(dá)很可能是由于線粒體受損而引起的離子穩(wěn)態(tài)失衡、結(jié)構(gòu)保護(hù)機(jī)制失效、抗凋亡功能失效等生理生化變化所致，蛋白質(zhì)水平發(fā)生下調(diào)表達(dá)則預(yù)示著機(jī)體能量的持續(xù)耗竭，最終引起組織/細(xì)胞的程序性死亡。

所鑒定的差異蛋白在不同貯藏階段呈現(xiàn)了上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，細(xì)胞色素c氧化酶位于線粒體ETC的末端，其轉(zhuǎn)錄水平變化對(duì)酶活性具有調(diào)節(jié)作用[29]，COX1、COX2及COX3具有酶催化活性，COX5A指導(dǎo)COX的正確裝配，其中COX5A在貯藏初期上調(diào)表達(dá)，而在貯藏后期下調(diào)表達(dá)，這說明隨著貯藏時(shí)間的延長肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變促使COX5A無法正確指導(dǎo)COX的裝配，促使細(xì)胞色素c氧化酶活性發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)氧化磷酸化進(jìn)程產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致灘羊肉色澤穩(wěn)定性受到影響。F型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，是組織能量代謝的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)利用呼吸鏈產(chǎn)生的電化學(xué)勢(shì)能，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)合成ATP。ATP5A1、ATP5O、ATP5H在貯藏初期均上調(diào)表達(dá)，在貯藏后期均下調(diào)表達(dá)，ATP酶亞基的蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)意味著宰后肌肉組織內(nèi)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體復(fù)合物V高效組裝并引起其活性發(fā)生改變。ATP酶亞基的蛋白質(zhì)水平下調(diào)表達(dá)意味隨著貯藏時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)使復(fù)合物V已無法正確裝配，促使其活性開始下降。SDHB為復(fù)合物II亞基B，其具有結(jié)合金屬離子和電子傳遞的功能對(duì)于阻止復(fù)合體II的電子泄漏起著非常重要的作用，可能介導(dǎo)呼吸鏈生物功能和調(diào)控細(xì)胞生長[30]，SDHB在貯藏初期上調(diào)表達(dá)，并在貯藏后期下調(diào)表達(dá)，這可能是因?yàn)榧〖?xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變促使復(fù)合物II亞基B的表達(dá)受到貯藏時(shí)間的調(diào)控，其表達(dá)量的下調(diào)表達(dá)會(huì)引起復(fù)合物II發(fā)生突變，促使其氧化效能增加，最終加速細(xì)胞死亡[31]。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，所篩選的8 個(gè)核心蛋白ATP5A1、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS直接影響灘羊肉Mb的表達(dá)，并且這8 個(gè)核心蛋白均顯著富集于氧化磷酸化通路中，因此推測所篩選出的8 個(gè)核心蛋白對(duì)灘羊肉色澤穩(wěn)定性起重要調(diào)控作用，并且此過程是通過氧化磷酸化途徑實(shí)現(xiàn)的。Mb衍生態(tài)在組織內(nèi)存在的狀態(tài)和相對(duì)含量為灘羊宰后肉色變化的內(nèi)在機(jī)制，組織內(nèi)的還原酶系統(tǒng)對(duì)Mb狀態(tài)至關(guān)重要。而氧化磷酸化反應(yīng)往往伴隨著電子的轉(zhuǎn)移，復(fù)合物I負(fù)責(zé)催化NADH脫氫生成NAD+，復(fù)合物II主要負(fù)責(zé)將琥珀酸催化生成延胡索酸，并將產(chǎn)生的電子最終傳遞給泛醌，復(fù)合物III主要負(fù)責(zé)將電子從輔酶Q的傳遞給細(xì)胞色素c，復(fù)合物IV主要負(fù)責(zé)將電子從細(xì)胞色素c轉(zhuǎn)移到O2，將O2轉(zhuǎn)化為水。已有研究表明，動(dòng)物屠宰后機(jī)體細(xì)胞缺氧缺血，細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生會(huì)引起肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的失衡導(dǎo)致線粒體損傷，引起線粒體功能下降[32]，促使氧化磷酸化復(fù)合物活性發(fā)生改變，導(dǎo)致MetMb還原酶系統(tǒng)受到影響，最終導(dǎo)致灘羊肉色穩(wěn)定性變差。COX是聯(lián)系低氧反應(yīng)和代謝模式轉(zhuǎn)化的重要紐帶，它可以通過調(diào)節(jié)氧化磷酸化生成ATP，從而導(dǎo)致能量代謝方式發(fā)生轉(zhuǎn)化[28]，進(jìn)而對(duì)灘羊被最長肌中的Mb表達(dá)量產(chǎn)生影響，最終影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性。

通過分析研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)宰后貯藏期間灘羊肉中內(nèi)源抗氧化物酶系統(tǒng)的失效，導(dǎo)致ROS含量隨貯藏時(shí)間的延長不斷積累，引起肌細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡，促使氧化磷酸化通路上ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS等復(fù)合物亞基表達(dá)紊亂，引起線粒體復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使氧化磷酸化進(jìn)程受到阻礙，并進(jìn)一步對(duì)肌肉中Mb存在形式造成影響，最終影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

采用iTRAQ技術(shù)分析鑒定出8 個(gè)差異蛋白質(zhì)為影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性的核心蛋白質(zhì)，分別為ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS，這些蛋白質(zhì)主要通過能量代謝過程和氧化還原過程影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性。宰后貯藏期間灘羊肉中抗氧化體系的失效導(dǎo)致ROS含量不斷積累，破壞肌細(xì)胞線粒體完整性，促使氧化磷酸化通路上ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS等復(fù)合物亞基表達(dá)紊亂，引起線粒體復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使氧化磷酸化進(jìn)程受到阻礙，對(duì)肌肉中MetMbase系統(tǒng)造成負(fù)向影響，最終影響灘羊肉色澤穩(wěn)定性。