山新楊谷胱甘肽S-轉移酶PdbGST基因的克隆與脅迫表達分析

平曉帆　遇文婧　黃穎

摘要：? 在植物中，谷胱甘肽S-轉移酶是一類多功能酶，能夠在其響應非生物脅迫中發(fā)揮作用。為研究該基因在楊樹中的功能，本研究克隆了山新楊谷胱甘肽S-轉移酶基因PdbGST及其啟動子序列，對其進行生物信息學分析和表達特征分析。結果顯示，PdbGST基因的開放閱讀框（ORF）全長666 bp，編碼221個氨基酸，其形成的蛋白質相對分子質量為25.57 kDa，為穩(wěn)定親水性酸性蛋白，定位于細胞質中。系統(tǒng)進化分析表明，山新楊PdbGST蛋白與山新楊中的XP_034926648蛋白的同源性最高。對克隆獲取的2 000 bp啟動子序列進行分析，結構顯示該啟動子序列中，含有多種響應非生物脅迫的順式作用元件。熒光定量PCR分析顯示PdbGST基因在山新楊根部表達量最高，其次在山新楊葉部也有較高表達量，相反在山新楊頂芽中表達量最低。此外，對PdbGST基因響應非生物脅迫分析顯示，山新楊根部PdbGST基因受誘導后即出現(xiàn)持續(xù)且大量的表達。

關鍵詞：? 山新楊；? 谷胱甘肽S-轉移酶；? 非生物脅迫；? 表達模式

中圖分類號：? ?S 762. 8? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：１００1 － 9499（２０24）03 － 0033 － 08

Analysis of Cloning， Identification and Expression Pattern of

Glutathione S-transferases Gene in Poplar

PING Xiaofan YU Wenjing HUANG Ying**

（Forestry Protection Institute of Heilongjiang Province，? Heilongjiang Harbin 150081）

Abstract In plant， glutathione S-transferase （GST） refers to a multifunctional enzymes that plays an important role in abiotic stress modulation pathways. To investigate the function of GST in poplar trees， a PdbGST gene and its 2 000 bp promoter squence were cloned and analyzed in Populus davidiana×P. bolleana， and the expression pattern of it were also analyzed by RT-qPCR. The results showed that the open reading frame （ORF） length of PdbGST is 666 bp， which encodes 221 amino acids with the molecular weight is 25.57 kDa. The PdbGST is a stable hydrophilic acidic protein located in the cytoplasm. Systematic evolutionary analysis reveals that PdbGST in Populus davidiana × P. bolleana has a close relationship with XP_034926648 in P. alba. The analysis of cis-acting elements in promoter sequence of PdbGST showed that， this sequence contains multiple cis-acting elements related to plant response to abiotic stress. RT-qPCR showed that PdbGST had the highest expression level in the roots of Populus davidiana×P.bolleana， followed by a higher expression level in the leaves ， and the lowest expression level in the top buds . In addition， analysis of the response of PdbGST in response to abiotic stress showed that PdbGST in the roots of Populus davidiana×P.bolleana exhibited sustained and extensive expression after induction.

Key words Populus davidiana×P.bolleana； glutathione S-transferases； abiotic stress； expression pattern

谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferases ， GST）是一類廣泛存在于動、植物及微生物中的多功能酶[ 1 - 3 ]。在植物中，GST基因最早被發(fā)現(xiàn)于玉米中，該基因被證實能夠參與玉米對除草劑的解毒過程中[ 4 ]。隨后，在玉米、水稻、桑樹、大豆等不同植物中均被分離鑒定出了GST基因[ 5 - 10 ]。目前，GST基因依據(jù)其基因的結構、蛋白質序列的相似性及底物的專一性等，被劃分為14大類：metaxin、Phi（F）、Tau（U）、Zeta（Z）、谷胱甘肽依賴性脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、真核翻譯延伸因子1B的γ-亞基類（EF1Bγ）、Lambda（L）、四氯對苯二酚脫氫鹵化酶（TCHQD）、hemerythrin（H）、iota（I）、Theta（T）、微粒體前列腺素E合成酶2型（mPGES2）、含兩種硫氧還蛋白的GST（GST2N）和谷胱甘肽氫醌還原酶（GHR）[ 11 - 13 ]。在這14類GST基因中，Tau、Phi、DHAR和Lambda四類為植物所特有，其中以針對Tau和Phi類GST基因功能的研究最為廣泛[ 14 ， 15 ]。

GST基因的功能豐富，既能參與到植物生長、發(fā)育及衰老的過程中，又能夠幫助植物抵御外界不良環(huán)境的毒害[ 16 ]。針對GST基因表達模式的分析發(fā)現(xiàn)，來自小麥、苜蓿、水稻等不同植物中GST基因能夠不同程度地響應鹽堿、干旱、寒冷、重金屬等非生物脅迫的誘導，說明該類基因能夠廣泛地參與到植物對非生物脅迫的適應過程中[ 17 - 20 ]。同時，多項針對轉GST基因植株的研究證實，GST基因的過表達有助于提高轉基因植物對鹽、寒冷或是氧化脅迫的耐受性。如在煙草中過表達擬南芥AtGSTF11基因或是鹽角海蓬子SbGSTU基因，能夠增強其對氧化脅迫和鹽脅迫的耐受性[ 21 ， 22 ]。而在擬南芥中，過表達水稻OsGSTU4基因也能夠增強其加對鹽及氧化脅迫的耐受性[ 23 ]。大量的研究表明，GST基因在植物應對非生物脅迫過程中起著重要作用，但是這類研究的對象以草本植物為主，而針對木本植物的研究較為稀少。

楊樹分布廣泛且用途多樣，兼具社會、經濟及生態(tài)效益，也是研究林木抗逆機理，培育優(yōu)良新品種的首選樹種。山新楊（Populus davidiana×P.bolleana）是以山楊及新疆楊雜交而成的品種，是北方地區(qū)防護林的主要種植樹種。因其抗逆能力突出，適應能力較強，故以山新楊為模式植物開展的研究已應用于多個領域，如通過轉基因技術培育出抗逆性、抗病蟲害能力更加突出的優(yōu)良品種[ 24 - 26 ]；將山新楊引入鹽堿地修復過程中，探究其生長狀況等[ 27 ]。本研究克隆了山新楊PdbGST基因及其啟動子序列，并通過熒光定量PCR（RT-qPCR）技術分析其響應非生物脅迫下的表達模式，為后續(xù)深入研究該基因的功能提供理論依據(jù)，同時為林木抗逆基因工程育種提供潛在的基因資源。

1 材料與方法

1. 1 試材與采樣

選取健康且長勢一致的山新楊組培苗，將其移栽至規(guī)格為11cm×10 cm的花盆中進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)基質為混有V（泥炭土）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）=3∶1∶1的混合基質。其培養(yǎng)環(huán)境為：光照14 h/黑暗10 h，平均溫度約為（23±1）℃、相對濕度為60%～70%、光照強度400 μmol/m2·s培養(yǎng)15 d后，挑選長勢一致，且狀態(tài)優(yōu)良無病蟲害的幼苗用于后續(xù)實驗。分別摘取山新楊土培苗頂芽、葉片、葉柄、莖部及根部組織用于PdbGST基因的組織特異性分析，每個組織分別摘取自三株生長狀態(tài)一致的山新楊土培苗作重復。分別使用300 mM甘露醇溶液、200 mM NaCl溶液和20% PEG6 000溶液灌溉山新楊土培苗進行非生物脅迫處理。分別在處理后第1、3、6、12、24和48 h后，取其葉部及根部組織，液氮冷凍后儲存于-70 ℃，用于PdbGST基因響應非生物脅迫的基因表達模式分析，每種處理脅迫25株苗，每次取樣3株植株做重復，并分別以未經處理的山新楊土培苗的根部與葉部作對照。

1. 2 山新楊PdbGST基因及其啟動子序列的克隆

使用山新楊cDNA作為模版，并將轉錄組中的基因序列作為參照設計引物，克隆PdbGST基因。使用引物如下：GST-F：ATGGCGGAGGTGGTGAAGCT-GCTCGG；GST-R：TCAGGCGGATGCAAGCCTCTTT-TCTCTG。具體PCR擴增體系為cDNA2ul，上下游引物各1ul，無酶水12.1ul，10×Star Taq PCR buffer 2ul，dNTP Mix（2.5 mM）1.6ul， Star Taq（5 U/μL）0.3ul；PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產物電泳檢測，確認條帶大小符合預期后，對PCR產物進行回收。將回收后的產物連接至pMD18-T載體，并轉化至大腸桿菌TOP10中，將篩選后的陽性菌株送至生工生物工程（上海）公司進行測序[ 28 ]。

在山新楊基因組中查找獲得PdbGST基因上游約2 000 bp的序列作為啟動子區(qū)，設計引物對該序列進行克隆，所用引物如下：GST-proF：ATGGC-GGAGGTGGTGAAGCTGCTCGG；GST--proR：TCAG-GCGGATGCAAGCCTCTTTTCTCTG。具體PCR擴增體系為DNA1ul，上下游引物各1ul，無酶水13.1ul，10×Star Taq PCR buffer 2ul，dNTP Mix（2.5 mM）1.6ul， Star Taq（5 U/μL）0.3ul；PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1. 3 山新楊PdbGST蛋白質的生物信息學分析

使用ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對PdbGST蛋白進行基礎理化性質分析；使用ProtComp（http：//yadamp.unisa.it/protcomp/）進行亞細胞定位預測。在NCBI官網通過BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）進行比對，篩選與PdbGST相似性高的序列，使用ClustalW（http：//www./Tools/msa/clustalo/）對這些序列進行多序列比對分析，并通過MEGA7.0軟件，使用鄰接法（Neighbor- Joining，NJ）構建進化樹，其中Bootstrap參數(shù)設置為1 000。分別使用PredictProtein（https：//www.pre-dictprotein.org）及Swissmodel（https：//swissmodel.expa-sy.org）預測蛋白質的二級結構及三維結構。使用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/plantcare/html/）預測其啟動子序列所含cis-順式作用元件。

1. 4 山新楊PdbGST基因的表達模式分析

提取不同處理后山新楊不同組織的RNA進行反轉錄，并進行熒光定量PCR（RT-qPCR），分析不同植物組織及非生物脅迫下PdbGST基因的表達模式，所用引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法對定量數(shù)據(jù)進行處理，本文圖中所用基因的表達水平均進行了Log2轉化[ 29 ， 30 ]。

2 結果與分析

2. 1 山新楊PdbGST基因和其啟動子序列克隆

以山新楊cDNA為模版，將轉錄組測序獲得的基因序列作參照，設計引物，克隆PdbGST基因。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR結果進行檢測（圖1a），克隆獲得條帶長度約為666 bp的PCR產物，符合預期。所獲PCR產物經純化、連接及轉化等步驟后，送至生工生物工程（上海）公司進行測序。通過tBlastn對測序結果進行比對，結果顯示該基因屬于GSTU家族基因。以山新楊DNA為模板，以搜索其基因組獲得的序列做參照，設計引物，經PCR、純化回收、連接轉化及測序等過程，共克隆獲得PdbGST基因的啟動子序列2 000 bp（圖1b）。

2. 2 山新楊PdbGST蛋白的基礎理化性質分析

對克隆獲得的PdbGST基因所編碼的蛋白質進行理化性質的分析表2。該基因編碼氨基酸221個，構成蛋白質相對分子質量為25.57 kDa。蛋白質理論等電點為5.65，推測其為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為31.84，為穩(wěn)定蛋白。蛋白質親疏水性分析顯示其GRAVY值為-0.132，為親水蛋白。此外，亞細胞定位顯示該蛋白定位于細胞質中（表2），說明其在細胞質中發(fā)揮作用。

2. 3 山新楊PdbGST蛋白質結構分析

對該基因編碼形成的蛋白質進行二維結構預測，結果顯示其二級結構含有56.11%的螺旋、9.05%的折疊以及34.84%的Ω環(huán)（圖2a）。三維結構預測顯示，該蛋白主要由兩個亞基組成，其中位于N端的亞基較小，而位于C端的亞基則較大。同時，這兩個亞基由較短的氨基酸殘基相連（圖2b），該預測結果符合GST蛋白的結構特點。

2. 4 山新楊PdbGST蛋白的進化樹分析與多序列比對

通過BlastP比對，選取與PdbGST蛋白相似性高的蛋白序列，進行多序列比對分析的結果（圖3）可見，GST的氨基酸序列包含兩個保守結構域：N端包含影響催化功能的GSH結合位點（G-site），C端包含與特定底物結合的共底物結合域（H- site）。這兩個結構域由約10個殘基的短連接子序列連接。所有的活性位點都分布在這些結構域上，其中G位點通常是保守的，但H位點高度可變以允許一系列疏水底物的結合。

使用MEGA7.0軟件對與PdbGST蛋白序列相似性高的楊樹GST蛋白序列進行進化樹分析（圖4）。9個來自于不同種類楊樹的GST蛋白序列被分為3大分支。其中山新楊PdbGST蛋白與來自山楊（Populus alba）的XP_034926648蛋白親緣關系最近，位于第一分支（group1）。而來自亞東楊（P.yatungensis）的蛋白ANO39977與其他8種楊樹的GST蛋白親緣關系最遠，獨自處于一個分支（group3）。

2. 5 山新楊PdbGST基因的啟動子cis-順式作用元件分析

通過Plant CARE網站，對克隆獲得的PdbGST基因2 000 bp的啟動子序列所含的cis-順式作用元件種類進行預測。結果顯示：PdbGST的啟動子序列中共含有26種順式作用元件，除去一些調控基因轉錄所必需的基本元件外，還含有6種能夠響應非生物脅迫的順式作用元件，包括MYB，MYB-like，MYC，W-box，GT1和WUN-motif。此外，該基因的啟動子序列中也含有部分能夠響應光的元件，如Box-4，AE-box等（圖5）。該預測結果表明，PdbGST可能響應逆境環(huán)境的脅迫，進而參與到山新楊對非生物脅迫的抵御過程中。

2. 6 山新楊PdbGST基因的表達模式分析

對山新楊土培苗的頂芽、葉片、葉柄、莖及根部組織進行RT-qPCR分析，PdbGST基因在頂芽中表達量最低，故以其作為對照進行數(shù)據(jù)處理。結果顯示，該基因在山新楊根部表達量最高為25.6倍，其次在山新楊葉部也有較高表達量，為24.2倍。此外，該基因在楊樹莖部與葉柄處也有表達（圖6 a）。說明在山新楊的不同組織中，PdbGST基因的表達存在一定的差異，其在楊樹的生長、發(fā)育等過程中可能具有不同的功能。

分別使用PEG6000及甘露醇灌施山新楊根部，模擬干旱脅迫，分析了PdbGST基因在干旱下的表達模式。結果（圖6b、圖6c）顯示，在PEG6000的誘導下，山新楊根部PdbGST基因的表達呈持續(xù)上調的表達趨勢，基因的表達量在處理后第48 h達到最大，為29.39倍。而經PEG誘導后，山新楊葉部的基因呈現(xiàn)先抑制后上調的表達趨勢，其表達量在處理后第48 h達到最大，為22.41倍（圖6b）。在甘露醇的處理下，山新楊根部基因呈上調后下調的表達趨勢，基因的表達量在處理后第1 h即達到最大，為24.41倍。而經甘露醇誘導后，山新楊葉部的基因在短暫上調后基本呈現(xiàn)下調的表達趨勢，其表達量在處理后第24 h達到最大，為21.99倍（圖6c）。該結果表明，山新楊根部的PdbGST基因可能參與到楊樹對干旱條件的應對過程中。

通過分析NaCL處理下PdbGST基因的表達模式，分析其是否參與到楊樹對鹽脅迫的響應過程，結果（圖6d）顯示，在NaCL誘導下，山新楊根部PdbGST基因的表達呈持續(xù)上調的表達趨勢，基因的表達量在處理后第12 h達到最大，為29.91倍。而經NaCL誘導后，山新楊葉部的基因呈現(xiàn)先抑制后上調的表達趨勢，其表達量在處理后第24 h達到最大，為23.99倍。該結果顯示，PdbGST基因可能參與到楊樹對鹽脅迫的響應過程中。

3 討 論

在植物中，谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-? transferases， GST）是一類數(shù)量眾多、功能廣泛的酶類。這類酶被證實能夠參與植物的生長、發(fā)育、衰老過程，同時其也能夠參與響應植物對逆境環(huán)境的脅迫過程[ 1 - 3 ]。目前，針對GST基因功能的研究主要集中在草本植物中，極少針對木本植物中GST基因參與植物對逆境環(huán)境的響應過程中。因此，本研究克隆了山新楊PdbGST基因，對其在山新楊中的組織表達特性，以及在非生物脅迫條件下的表達模式進行分析，為后續(xù)研究該基因在木本植物中的功能提供理論基礎。

本研究克隆獲得的PdbGST基因長666 bp，編碼221個氨基酸，其形成的蛋白質為穩(wěn)定的親水性酸性蛋白，定位于細胞質中（表2）。同時，針對其氨基酸序列的分析及三維結構的預測顯示，該蛋白的結構符合GST蛋白的基本結構特征[ 31 ]，既其由分別位于N端及C端的兩個亞基構成。且位于N端的亞基含有高度保守的且能夠影響其催化功能G-site，而其C端的亞基則含有可變性較高的，能夠與特定底物結合H-site（圖2，圖3）。其中，H-site氨基酸殘基的可變性，使得不同的GST蛋白能夠結合不同的底物，參與到植物不同的生理生化過程中。

植物中的GST基因被證實能夠參與到其生長、發(fā)育及衰老等過程中。如Kumar等針對過表達水稻OsGSTL2基因的擬南芥觀察發(fā)現(xiàn)，過表達該基因提高了種子的發(fā)芽率，同時促進了植株子葉發(fā)育與根系生長[ 32 ]。擬南芥AtGSTU17基因則能夠參與其幼苗發(fā)育、下胚軸伸長等過程[ 33 ]。番茄中GST的表達能夠降低細胞內總谷胱甘肽的水平，減少細胞總磷脂含量，改變細胞內氧化還原電位，抑制細胞的程序性死亡過程[ 34 ]。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)，山新楊PdbGST基因在5種組織中的表達情況存在差異，其在頂芽中表達量最少，在根部表達量最高，此外其在葉部也有較高表達（圖6），表明該基因可能在楊樹的不同組織或是不同的發(fā)育階段起到重要作用。

大豆、番茄、水稻等植物GST基因的研究表明，該基因能夠保護植物細胞免受鹽堿、干旱、重金屬以及氧化脅迫等逆境環(huán)境造成的損傷。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達番茄LeGSTU2基因，能夠提高其對鹽及干旱的耐受性[ 35 ]。過表達水稻OsGSTU4基因的擬南芥不僅顯示出了較高的耐鹽性，并對氧化脅迫的耐受性也有所提高[ 23 ]。對過表達GST基因的苜蓿進行分析發(fā)現(xiàn)，GsGSTU14、GsGSTU19和GsGSTU13均在苜蓿響應鹽堿脅迫的過程中起作用[ 36 - 38 ]。針對耐鹽植物藜麥中GST基因的研究發(fā)現(xiàn)，GST基因能夠平衡其根部中受鹽脅迫而產生的內源性過氧化氫的含量，減輕了過氧化氫對其根細胞造成的損害[ 39 ]。因此，本研究分析了PdbGST啟動子的序列，結果顯示該基因啟動子序列含有能夠響應非生物脅迫的順式作用元件，如MYB，GT1，MYC，W-box等（圖5）。其中，水稻Os2H16的啟動子序列上的GT1元件被證實能夠與其反式作用因子OsASR2結合，參與其對干旱環(huán)境的響應過程中[ 40 ]。同時，對山新楊PdbGST基因響應的干旱及鹽脅迫下的表達模式的分析表明，結該基因受干旱或是鹽脅迫后。在山新楊根部出現(xiàn)持續(xù)大量的表達，而其葉部基因的表達在兩種脅迫下主要呈現(xiàn)先抑制后上調的表達模式（圖6）。該結果與來自部分來自苜蓿和土豆中的GST基因的表達模式一致[ 41 ， 42 ]。以上結果表明，PdbGST基因能夠參與楊樹對干旱及鹽等逆境的響應，但其在葉部及根部的作用時間或是功能可能不同。

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