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      HPLC法同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量

      2024-06-25 12:29:29王珂周瓊李建科
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年5期
      關(guān)鍵詞:絞股藍水溶液酚酸

      王珂 周瓊 李建科

      摘要:為建立同時檢測陜西平利絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)中13種酚酸含量的測定方法,采用高效液相色譜法(HPLC),利用甲醇水溶液(80%)常溫渦旋,超聲波提取,色譜柱為Dimensions C18(4.6 mm×150 mm,5 μm,P/N: 227-30011-07,C/N:18C03033),流動相為甲醇(100%)和磷酸水溶液(0.5%),洗脫方法為梯度洗脫,檢測波長為280 nm,柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣體積為5 μL。結(jié)果表明,13種酚酸在濃度為5~100 mg/L時線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.998;在樣本加標(biāo)回收試驗中,平均加標(biāo)回收率為61.8%~131.0%。該測定方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好,適用于陜西平利絞股藍中酚酸含量的測定。

      關(guān)鍵詞:陜西平利絞股藍(Gynostemma pentaphyllum);酚酸;高效液相色譜法(HPLC);含量

      中圖分類號:TS272???????? 文獻標(biāo)識碼:A

      文章編號:0439-8114(2024)05-0182-05

      DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.032??????????? 開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

      Simultaneous detection of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli, Shaanxi Province by HPLC

      WANG Ke, ZHOU Qiong, LI Jian-ke

      (School of Modern Agriculture and Biotechnology,Ankang University, Ankang? 725000,Shaanxi,China)

      Abstract: In order to establish a method for simultaneously detecting the content of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli, Shaanxi,high performance liquid chromatography (HPLC) was used. Methanol aqueous solution (80%) was used for room temperature vortex and ultrasonic extraction,the chromatographic column was Dimensions C18(4.6 mm×150 mm,5 μm,P/N: 227-30011-07, C/N: 18C03033), with a mobile phase of methanol (100%) and phosphoric acid aqueous solution (0.5%). The elution method was gradient elution, with a detection wavelength of 280 nm, column temperature of 30 ℃, flow rate of 1.0 mL/min, and injection volume of 5 μL. The results showed that there was a good linear relationship among the 13 phenolic acids at concentrations of 5~100 mg/L, with a correlation coefficient (R2) ≥ 0.998; in the sample spiking recovery experiment, the average spiking recovery rate was 61.8%~131.0%. This determination method had good precision, repeatability, and stability, and was suitable for the determination of phenolic acids content in Gynostemma pentaphyllum from Pingli, Shaanxi.

      Key words: Gynostemma pentaphyllum from Pingli,Shaanxi; phenolic acid; high performance liquid chromatography (HPLC); content

      收稿日期:2023-03-20

      基金項目:陜西省科技廳創(chuàng)新人才推進計劃基金項目(2019TD-042;2023AYPT06)

      作者簡介:王 珂(1999-),男,陜西漢中人,本科生,專業(yè)方向為果蔬貯藏與保鮮,(電話)15929597791(電子信箱)wk199955@163.com;

      通信作者,周 瓊(1971-),女,貴州甕安人,教授,博士,主要從事植物資源的研發(fā)與利用研究,(電話)13992550047

      (電子信箱)kanqiongtao@163.com。

      王 珂,周 瓊,李建科. HPLC法同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2024,63(5):182-186.

      絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)為葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物,又名七葉膽[1]。陳武等[2]認(rèn)為絞股藍性寒,其藥性應(yīng)屬平性偏微溫、味甘、微苦,歸肺、脾、心、腎經(jīng),具備清熱解毒、清肺化痰止咳、補氣養(yǎng)陰生津、養(yǎng)心安神、固精之效用。在中國秦嶺和長江流域以南廣大地區(qū)分布較廣[3,4]。絞股藍是藥食同源類植物資源,有南方人參和第二人參的美譽。

      酚酸是指結(jié)構(gòu)中帶有酚類基團的有機酸,它是植物中僅次于黃酮類化合物的第二大次生代謝物[5]。近年來,酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護因子,受到學(xué)者越來越多的關(guān)注,其部分原因是它們潛在的抗氧化活性、抗癌作用、對慢性疾病的保健作用以及在植物源食品中的廣泛存在性[6,7]。同時,已有研究表明,酚酸不僅具有抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化及預(yù)防心血管疾病的作用,而且還具有抗癌、抗炎癥和抗血小板凝聚等功能[8]。關(guān)于酚酸檢測有較多報道,胡華等[9]建立了利用高效液相色譜法同時測定醬油中8種酚酸的方法;黃小蘭等[10]建立了同時測定地筍中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸7種酚酸的高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-PDA)并對不同產(chǎn)地地筍中酚酸成分進行分析評價;陳少洲等[11]、翁芳華等[12]也分別針對向日葵籽和藍莓酒建立了測定其酚酸含量的方法。綜上,針對陜西平利絞股藍,探究其酚酸類化合物的測定方法及其含量的測定,優(yōu)化其提取分離工藝,探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),從而為其進一步地開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

      本研究通過對色譜條件(流動相、檢測波長、梯度洗脫條件等)進行優(yōu)化,以期建立同時測定陜西平利絞股藍中13種酚酸(鞣花酸、水楊酸、肉桂酸等)的一種簡單快速準(zhǔn)確的分析方法,為陜西平利絞股藍中酚酸的檢測提供技術(shù)依據(jù),同時也為絞股藍功能性成分的研究和絞股藍資源開發(fā)利用提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      絞股藍為陜西省平利縣的陜西平利絞股藍,中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品;品種為平利1#、平利2#、平利3#、平利4#。

      沒食子酸、新綠原酸、綠原酸等對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司,對照品信息如表1所示。

      1.2 儀器與設(shè)備

      LC-2040C PLUS型高效液相色譜儀(日本株式會社島津制作所);SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);TDZ5-WS型醫(yī)用離心機、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);H1650R型離心機[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];超聲波清洗器(昆山力波超聲波設(shè)備有限公司);CP224C型萬分之一天平(天津瑞澤分析儀器有限公司);全新氣流式超微粉機(上海一恒科技有限公司);標(biāo)準(zhǔn)分樣篩(40目0.45 mm,上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

      1.3 色譜條件

      色譜柱Dimensions C18(4.6 mm×150 mm,5 μm,P/N: 227-30011-07, C/N: 18C03033);流動相A為100%甲醇,流動相B為0.5%磷酸水溶液。采用低壓梯度洗脫的分離方法,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣體積為5 μL。具體洗脫程序如表2所示。

      1.4 試驗方法

      1.4.1 樣品處理 使用萬分之一天平準(zhǔn)確稱量5 g樣品,移入50 mL離心管中,加入甲醇水溶液(80%)40 mL,渦旋振蕩器渦旋1 min,超聲波處理60 min,使樣品中酚酸充分溶出,5 000 r/min 離心5 min,將上清液移入10 mL比色管,加入甲醇水溶液(80%)定容至10 mL,過0.22 μm膜,上機檢測[13-15]。

      1.4.2 對照品儲備溶液和混合對照品使用液的配制 使用萬分之一天平分別精確稱取13種酚酸對照品10.00 mg,用甲醇(100%)溶解并定容至10 mL。此時,每個對照品儲備溶液的濃度為1 000 mg/L,為了得到不同濃度的對照品儲備溶液,進一步用甲醇(100%)稀釋。分別準(zhǔn)確吸取1 mL 1 000 mg/L的?? 13種對照品儲備溶液,分別用甲醇(100%)定容至10 mL得到濃度為100 mg/L的對照品儲備溶液。分別移取0.5 mL 100 mg/L的各對照品儲備溶液,充分混勻,得到濃度為100 mg/L的混合對照品使用液。溶液置于4 ℃冰箱中避光保存。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 色譜條件的優(yōu)化

      2.1.1 檢測波長 將13種100 mg/L的對照品儲備溶液稀釋后上機測定,檢測波長分別為280 nm和320 nm。通過比較2種波長下的色譜圖及出峰情況,發(fā)現(xiàn)13種酚酸在檢測波長為280 nm時有更好的吸收。

      2.1.2 流動相 甲醇水溶液、乙腈水溶液可以作為流動相分離酚酸[16],但羥基在水溶液中容易發(fā)生電離,極性增強,在固定相表面形成雙重保留,色譜峰拖尾嚴(yán)重。通過加入少量酸性調(diào)節(jié)劑可以改善此類情況。酸性調(diào)節(jié)劑有多種選擇,如甲酸、乙酸、磷酸等[9],在預(yù)試驗中,選擇甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動相,將13種100 mg/L的對照品儲備溶液上機檢測,得到13種對照品儲備溶液的出峰時間。由表3的出峰時間可以判斷,以甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動相并不理想。同時,甲醇和乙腈均具有較好分離效果,但乙腈的毒性較大,因此選擇甲醇作為有機流動相。綜上,本試驗以甲醇(100%)作為有機流動相(流動相A),以磷酸(0.5%)作為酸性調(diào)節(jié)劑(流動相B)。

      2.1.3 梯度洗脫 采用等度洗脫的模式,流動相A(100%甲醇)與流動相B(0.5%磷酸水溶液)以1∶1的比例進行洗脫,總時長為1 h,流速為0.3 mL/min,在此模式下,分離度較差,達不到本試驗的預(yù)期目的。因此將等度洗脫改為梯度洗脫,流速為1 mL/min,通過對13種酚酸色譜(280 nm)(圖1)進行分析可知,梯度洗脫程序能很好地將13種酚酸分離,得到較好的色譜圖。

      2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

      為了準(zhǔn)確計算陜西平利絞股藍樣品中酚酸含量,分別取100 mg/L混合對照品使用液適量,用甲醇配制成5個不同濃度的混合對照品使用液,分別為100、50、25、10、5 mg/L,在280 nm波長和梯度洗脫條件下進樣檢測,以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表4可知,13種酚酸在濃度為5~100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.998。

      2.3 精密度試驗

      取平利3#樣品,按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理,得到上機檢測樣品溶液,重復(fù)進樣5次[17],記錄峰面積,同時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中酚酸含量,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),如表5所示。結(jié)果表明儀器精密度良好。

      2.4 穩(wěn)定性試驗

      取平利3#樣品,按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理,分別在0、4、8、12、16、24 h進樣[13]。計算峰面積、酚酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6),如表6所示。結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.5 重復(fù)性試驗

      取同一平利3#樣品,按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理,平行5份[18,19],在波長280 nm和梯度洗脫條件下檢測,記錄峰面積以及計算酚酸含量,從而計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5),如表7所示。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

      2.6 加標(biāo)回收試驗

      根據(jù)本試驗方法,分別精密稱取5份平利3#粉末5 g,按“1.4.1”方法對樣品進行前處理,精密加入0.5 mL 100 mg/L的混合對照品使用液,混勻后在280 nm波長和梯度洗脫條件下進行測定,重復(fù)進樣5次,計算平均加標(biāo)回收率[20,21],如表8所示。9種酚酸的平均加標(biāo)回收率為61.8%~131.0%,表明該方法準(zhǔn)確可靠,可用于絞股藍中酚酸含量的測定。

      2.7 樣品測定

      由表9可知,平利1#葉樣品檢出8種酚酸,分別為新綠原酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、鞣花酸,總含量為13.440 mg/g,平均含量為1.680 mg/g。平利1#莖樣品檢出9種酚酸,總含量為13.093 mg/g,平均含量為1.455 mg/g。平利2#葉樣品檢出6種酚酸,總含量為1.330 mg/g,平均含量為0.222 mg/g。平利2#莖樣品檢出7種酚酸,總含量11.939為 mg/g,平均含量為1.706 mg/g。平利3#號樣品檢出9種酚酸,總含量為18.203 mg/g,平均含量為2.023 mg/g。平利4#樣品檢出7種酚酸,總含量為13.300 mg/g,平均含量為1.900 mg/g。

      3 小結(jié)

      不同品種、不同采集部位的陜西平利絞股藍中13種酚酸含量存在較大差異,如平利1#葉中鞣花酸含量高達10.56 mg/g,而平利2#葉、平利2#莖、平利3#、平利4#中未檢出鞣花酸。本研究建立同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量的高效液相色譜法,以甲醇(100%)和磷酸水溶液(0.5%)作為流動相,該測定方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好,適用于陜西平利絞股藍中酚酸含量的測定,可以為絞股藍的進一步開發(fā)與利用提供參考。

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