步園園 潘志芳 崔祥祥 周笑 陳建樺 黃榮韶 李良波

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202306012

步園園， 潘志芳， 崔祥祥， 等， 2024.

氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋生理及綠原酸合成積累的影響 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（5）： 972-980.

BU YY， PAN ZF， CUI XX， et al.， 2024.

Effects of nitrogen， phosphorus and potassium fertilizers on physiology and chlorogenic acid synthesis and accumulation of Pyrrosia petiolosa ［J］.

Guihaia， 44（5）： 972-980.

摘? 要：? 為探討氮磷鉀3種養(yǎng)分對(duì)有柄石韋生理及有效成分綠原酸合成積累的影響，該研究以有柄石韋組培苗為材料，分別用低養(yǎng)分（不施肥：N0，P0，K0）、正常施肥（N：0.20 g·kg-1，P：0.15 g·kg-1，K：0.15 g·kg-1）和高養(yǎng)分（N1：0.40 g·kg-1，P1：0.30 g·kg-1，K1：0.30 g·kg-1）3個(gè)濃度梯度，設(shè)置7個(gè)處理分別為NPK、N0PK、N1PK、NP0K、NP1K、NPK0、NPK1，測(cè)定不同處理下有柄石韋的抗性生理指標(biāo)、綠原酸（CGA）含量及其合成關(guān)鍵酶活性。結(jié)果表明：（1）氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋的抗性生理有顯著的影響，超氧化物歧化酶（SOD）在高氮和低鉀處理中活性顯著增加，而3種養(yǎng)分的低濃度和高濃度處理均會(huì)導(dǎo)致過氧化氫酶（CAT）活性顯著上升。（2）不同養(yǎng)分水平氮、磷和鉀對(duì)有柄石韋CGA含量存在顯著影響，正常施肥的CGA含量最高，達(dá)到12.92 mg·g-1；高鉀施肥的CGA含量最低，為7.79 mg·g-1；鉀肥對(duì)CGA含量影響最顯著。（3）CGA合成關(guān)鍵酶活性在不同施肥處理中差異顯著，CGA含量與奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HQT）和4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）活性呈顯著正相關(guān)，與莽草酸羥基肉酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）活性顯著負(fù)相關(guān)，HQT、4CL和HCT是導(dǎo)致CGA含量差異的關(guān)鍵因素。該研究結(jié)果為有柄石韋藥材的人工栽培提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 有柄石韋， 氮磷鉀肥， 生理， 綠原酸， 積累

中圖分類號(hào)：? Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2024）05-0972-09

收稿日期：? 2023-09-25? 接受日期： 2023-10-19

基金項(xiàng)目：? 國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（32160085）； 廣西中醫(yī)藥大學(xué)桂派中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2022B005）； 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSY2023005）； 江西紅星藥業(yè)有限公司委托項(xiàng)目。

第一作者： 步園園（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與利用，（E-mail）1609299682@qq.com。

*通信作者：? 李良波，博士，研究員，研究方向?yàn)榈赖厮幉幕钚猿煞址e累機(jī)制及質(zhì)量控制，（E-mail）llb100@126.com。

Effects of nitrogen， phosphorus and potassium fertilizers

on physiology and chlorogenic acid synthesis and

accumulation of Pyrrosia petiolosa

BU Yuanyuan1， PAN Zhifang1， CUI Xiangxiang1， ZHOU Xiao1，

CHEN Jianhua1，2， HUANG Rongshao1，2， LI Liangbo1，2*

（ 1. College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China; 2. Key Laboratory of Protection and

Utilization of Chinese Medicine Resources， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China ）

Abstract：? To explore the effects of nitrogen， phosphorus and potassium on the physiology of Pyrrosia petiolosa as well as the synthesis and accumulation of chlorogenic acid （CGA）， tissue culture seedlings of P. petiolosa were used as materials， and three concentration gradients of low nutrient （ no fertilization： N0， P0， K0 ）， normal fertilization （ N： 0.20 g·kg-1， P： 0.15 g·kg-1， K： 0.15 g·kg-1 ） and high nutrient （ N1： 0.40 g·kg-1， P1： 0.30 g·kg-1， K1： 0.30 g·kg-1） were set up. Seven treatments were set up to NPK， N0PK， N1PK， NP0K， NP1K， NPK0 and NPK1， and the resistance physiological indexes， CGA contents and key enzyme activities of P. petiolosa under different treatments were determined. The results were as follows： （1） Nitrogen， phosphorus and potassium fertilizers had significant effects on the resistance physiology of P. petiolosa. The activities of superoxide dismutase（SOD） increased significantly under high nitrogen and low potassium treatments， but catalase （CAT） activities rose significantly under low and high treatments of three nutrients. （2） The contents of CGA in P. petiolosa was significantly affected by different nutrient levels of nitrogen， phosphorus， and potassium. The CGA level in normal fertilization was the highest， reaching 12.92 mg·g-1， while the CGA content in high potassium fertilization was the lowest， 7.79 mg·g-1. Potassium fertilizer had the most significant effect on CGA content. （3） The key enzyme activities of CGA synthesis were significantly different in different fertilization treatments. The content of CGA was positively correlated with the activities of quinate o-hydroxycinnamoyl transferase （HQT） and 4-coumaroyl coenzyme ligase （4CL）， and negatively correlated with the activity of quinic acid shikimate o-hydroxycinnamoyl transferase （HCT）. HQT， 4CL and HCT were the key factors leading to the difference of CGA content. The results of this study provide a theoretical reference for the artificial cultivation of P. petiolosa.

Key words： Pyrrosia petiolosa，nitrogen，phosphorus and potassium fertilizers， physiology， chlorogenic acid （CGA）， accumulation

有柄石韋（Pyrrosia petiolosa）為水龍骨科石韋屬植物，是2020版《中國藥典》收錄的石韋藥材基原之一，以葉入藥，味苦、甘，性微寒，具有利水通淋、清肺泄熱、止血等功效（國家藥典委員會(huì)，2020）。潘禮業(yè)等（2020）研究表明，有柄石韋含有酚酸類、黃酮類、三萜類等多種類型的有效成分，而綠原酸（chlorogenic acid， CGA）是其質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。一方面，有柄石韋基本來源于野生資源，隨著野生資源的過度采挖和臨床需求量的不斷增加，有柄石韋野生資源急劇減少，供需矛盾日益突出；另一方面，由于各地石韋藥材質(zhì)量參差不齊，無法保證穩(wěn)定的臨床療效（賴海標(biāo)等，2010）。因此，為滿足石韋藥材的市場(chǎng)需求和保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，開展有柄石韋的引種馴化和人工栽培已勢(shì)在必行。

目前，關(guān)于有柄石韋的人工栽培剛剛開始，仍存在孢子萌發(fā)率低、出苗整齊度差和存活率低、自然生長(zhǎng)緩慢、施肥配比不明等問題。施肥是藥用植物人工栽培及規(guī)范化種植過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，直接影響藥用植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和質(zhì)量。根據(jù)筆者調(diào)查，目前未見關(guān)于有柄石韋人工栽培中科學(xué)施肥方法的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，如何通過施肥管理調(diào)控有柄石韋的生長(zhǎng)和有效成分積累是實(shí)現(xiàn)有柄石韋人工栽培需要解決的關(guān)鍵問題之一。

大量研究表明，合理的施肥能有效促進(jìn)藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育和有效成分的合成積累，而濫用肥料或缺肥會(huì)形成逆境脅迫環(huán)境，破壞體內(nèi)的代謝平衡，導(dǎo)致減產(chǎn)或藥材有效成分含量降低。韓建萍等（2004）研究了氮、磷肥對(duì)丹參的次生代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)氮素對(duì)丹參酮ⅡA的積累表現(xiàn)出負(fù)面效應(yīng)，丹參酮ⅡA含量隨著施氮量的增加而逐漸減少，磷的施用對(duì)丹參酮ⅡA和丹參素的積累則具有積極促進(jìn)作用。曹欣欣等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，氮肥對(duì)西洋參皂苷影響變化明顯，適當(dāng)?shù)牡视昧匡@著增加了三七皂苷Rb3含量，而氮肥施用過多則會(huì)導(dǎo)致含量降低。有柄石韋的有效成分為綠原酸，屬于酚酸類成分，其在植物體內(nèi)的合成途徑為苯丙烷代謝途徑（Clifford et al.， 2017），該途徑的前體物質(zhì)為芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，氮供應(yīng)量可通過影響芳香族氨基酸的含量從而影響苯丙烷次生代謝產(chǎn)物的含量（Fritz et al.， 2006）。張寧潔等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，金銀花綠原酸（CGA）的含量與施氮量呈負(fù)相關(guān)，適量施肥后金銀花中苯丙氨酸氨解酶基因（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶基因（C4H）、4-香豆酰輔酶A連接酶基因（4CL）和羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因（HQT）等CGA合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平上調(diào)。有研究指出，磷素也會(huì)影響酚酸類代謝產(chǎn)物的合成積累，參與酚酸和類黃酮生物合成途徑的基因PAL、4CL在磷脅迫下的不同表達(dá)，在高磷處理下異綠原酸C、隱綠原酸、異綠原酸B等酚酸含量顯著降低（Wang et al.， 2023）。與氮和磷不同，鉀不是有機(jī)化合物的一部分，但鉀作為主要陽離子或各種酶的輔助因子在植物的生理和生化過程中起著重要作用，如酶活化、離子穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)合成等（Xue et al.， 2022）。然而，目前尚未有任何關(guān)于施肥水平影響有柄石韋酚酸類活性成分合成積累的研究報(bào)道。

為了探討有柄石韋對(duì)不同氮磷鉀肥濃度的生理響應(yīng)及綠原酸（CGA）合成積累的規(guī)律，本研究測(cè)定了不同濃度氮磷鉀處理下有柄石韋的抗氧化酶SOD、CAT及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的變化，以及CGA合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）、莽草酸羥基肉酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）、奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HQT）、香豆酸-3-羥化酶（C3H）的活性和CGA的含量，以期闡明有柄石韋對(duì)不同濃度氮磷鉀肥的生理響應(yīng)及CGA合成積累規(guī)律，為有柄石韋的引種馴化和人工栽培提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)于2022年7—9月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，供試植株為1年生有柄石韋組培苗，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的有柄石韋植株，將根部沖洗干凈后用1 000倍多菌靈浸泡根部15 min，移栽后置于溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)。使用尿素（津歐博凱化工有限公司）、磷酸二氫鈣（天津市大茂化學(xué)試劑廠）和氯化鉀（天津市北辰方正試劑廠）分別對(duì)有柄石韋進(jìn)行氮磷鉀養(yǎng)分處理。

1.2 供試土壤

供試土壤為酸性紅色土壤，土壤經(jīng)滅菌、風(fēng)干、打碎、混勻后用于盆栽試驗(yàn)。混合基質(zhì)為紅土∶育苗基質(zhì)（有機(jī)質(zhì)+腐殖酸）∶珍珠巖=2∶2∶1，混合基質(zhì)理化性質(zhì)為 pH 4.9、全氮0.10%、全磷0.12%、全鉀2.50%、有機(jī)質(zhì) 16.0 g·kg-1、水解性氮73.0 mg·kg-1、速效磷8.8? mg·kg-1、速效鉀247 mg·kg-1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

施肥使用分析純的尿素、磷酸二氫鈣和氯化鉀，氮磷鉀3種主要營(yíng)養(yǎng)分別用低養(yǎng)分（不施肥）、正常養(yǎng)分和高養(yǎng)分3個(gè)濃度梯度，共設(shè)置7個(gè)處理組分別為NPK、 N0PK、 N1PK、 NP0K、 NP1K、NPK0、NPK1，其中氮處理為 N0PK、NPK、N1PK；磷處理為NP0K、NPK、 NP1K；鉀處理為NPK0、NPK、NPK1。 N0、P0和K0為不施肥，正常養(yǎng)分施肥（N：0.20 g·kg-1，P：0.15 g·kg-1，K：0.15 g·kg-1），高養(yǎng)分施肥（N1：0.40 g·kg-1，P1：0.30 g·kg-1，K1：0.30 g·kg-1）。將有柄石韋植株移栽于栽培盆（長(zhǎng)30 cm， 寬15 cm， 高10 cm）中，每個(gè)盆裝2.8 kg混合基質(zhì)。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15株苗。分兩次施肥，0 d施一半肥，30 d施另一半肥，處理60 d，每隔3 d自來水澆灌1次，其他管理一致。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光還原法（李合生，2000）；用萬分之一天平稱取0.100 g的樣品，加入1 mL提取液冷凍研磨，以8 000 r·min-1在4 ℃下離心10 min后取上清液，上清液處理后于酶標(biāo)儀560 nm下測(cè)定樣品的吸光度，當(dāng)黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位。過氧化氫酶（CAT）活性采用分光光度法測(cè)定（趙亞華，2000），酶提取步驟同上，每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 μmol H2O2定義為一個(gè)酶活單位。脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮法測(cè)定（高俊鳳，2006）。

1.5 CGA含量測(cè)定

CGA含量的測(cè)定參照《中國藥典》（國家藥典委員會(huì)，2020）并進(jìn)行稍作改動(dòng)。將藥材烘干粉碎后過篩，稱取有柄石韋粉末0.2 g，置于50 mL離心管中，加入50%的甲醇15 mL，靜置24 h后再加入50%的甲醇10 mL二次提取，藥渣與提取液超聲處理45 min后放冷至室溫補(bǔ)足重量，10 000 r·min-1常溫離心10 min后取上清液0.22 μm微孔濾膜過濾后待測(cè)。精密稱定CGA標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：929 N022）2.17 mg，使用50%甲醇配置濃度為0.217 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋成濃度為0.021 7、0.043 4、0.086 8、0.130 2、0.173 6、0.217 0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，線性回歸方程為y=3.004 24×107x-329 43，R2=0.999 2。色譜柱：XBridge C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，乙腈（C）～0.1%磷酸溶液（A）梯度洗脫，洗脫程序： 0～5 min，10%→15%C，90%→85%A；5～12 min，15%→19%C，85%→81%A；12～18 min，19%→27%C，81%→73%A；18～40 min，27%→80%C，73%→20%A；40～60 min，80%→10%C，20%→90%A。

1.6 CGA合成關(guān)鍵酶活性測(cè)定

CGA合成關(guān)鍵酶均采用酶聯(lián)免疫法，按照試劑盒（廣西君奇生物科技有限公司，202301）方法步驟進(jìn)行測(cè)定，精確稱取有柄石韋鮮樣0.1 g ，加入1 mL的PBS（pH為7.2～7.4）緩沖液，4 ℃冷凍研磨勻漿，10 000 r·min-1、4 ℃離心20 min，獲得酶提取液。樣品孔加入樣品稀釋液，空白孔不加，除空白孔外標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔分別加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體，恒溫箱37 ℃反應(yīng)60 min后取出，棄去廢液加入洗滌液重復(fù)洗滌5次，拍干后每孔加入底物，37 ℃避光孵育15 min后每孔加入硫酸終止液，測(cè)定450 nm下各孔的OD值。關(guān)鍵酶活性定義為每克蛋白質(zhì)在每分鐘內(nèi)降解1 μmol 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為一個(gè)酶活性單位。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示），用SPSS 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較、Pearson相關(guān)性分析，Origin 2021軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1 氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋抗性生理的影響

2.1.1 不同氮濃度對(duì)有柄石韋抗性生理的影響? 由圖1可知，高氮處理的SOD活性是低氮處理的2.18倍，正常施氮與低氮處理的SOD活性無顯著性差異（圖1：A）。正常施氮的CAT活性最低（圖1：B），與低氮和高氮處理達(dá)到顯著水平。低氮處理下脯氨酸含量最低，為42.09 μg·g-1，與正常氮處理達(dá)到顯著水平，與高氮處理無顯著差異。隨著施氮量增加，脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)（圖1：C）

2.1.2 不同磷濃度對(duì)有柄石韋抗性生理的影響? 在磷處理試驗(yàn)中，正常施磷的SOD活性最高，而高磷處理與低磷處理的SOD活性無顯著性差異（圖1：A）。不同磷濃度下有柄石韋的CAT活性變化趨勢(shì)與SOD活性變化趨勢(shì)相反，正常磷濃度時(shí)CAT活性最低，低磷處理和高磷處理分別較正常磷升高了82.64%和77.41%，均達(dá)到顯著水平（圖1：B）。正常施磷時(shí)脯氨酸含量最高，高磷處理與低磷處理無顯著性差異（圖1：C）。

2.1.3 不同鉀濃度對(duì)有柄石韋抗性生理的影響? 不同鉀濃度處理間有柄石韋SOD活性存在顯著性差異，低鉀處理SOD活性最高，高鉀處理SOD活性最低（圖1：A）。CAT活性在正常施鉀肥情況下最低，低鉀處理下CAT活性顯著高于正常施鉀和高鉀處理。鉀濃度對(duì)有柄石韋的脯氨酸含量的影響與氮、磷處理的影響一致，即正常施鉀顯著高于低鉀處理和高鉀處理，低鉀處理與高鉀處理間無顯著性差異（圖1：C）。

2.2 氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋CGA含量及合成關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋CGA含量的影響? 由圖1可知，不同水平氮、磷和鉀肥對(duì)有柄石韋CGA含量存在顯著影響。正常施氮CGA含量最高，達(dá)12.92 mg·g-1，低氮和高氮處理分別較正常施氮降低了15.87%和19.66%，均達(dá)到了顯著水平。高磷和高鉀處理不利于有柄石韋的CGA積累，與正常施磷和正常施鉀肥相比分別下降了28.33%和39.71%，鉀濃度對(duì)有柄石韋CGA含量影響更顯著。

2.2.2 氮處理對(duì)有柄石韋CGA合成關(guān)鍵酶活性的影響? 低氮處理的PAL活性最高，而高氮處理與正常施氮的PAL活性無顯著變化（圖2：A）。低氮處理的C4H活性較正常施氮降低了23.39%，達(dá)到顯著水平（圖2：B）。高氮處理的4CL活性較正常施氮相比下降了13.23%，低氮處理和正常施氮間無顯著性差異（圖2：C）。高氮處理的HCT活性比正常施氮顯著升高了21.05%，而正常施氮的HCT活性最低（圖2：D）。高氮處理下HQT活性與正常施氮相比降低了12.6%，均達(dá)到顯著水平（圖2：E）。氮濃度對(duì)C3H活性無顯著影響（圖2：F）。

2.2.3 磷處理對(duì)有柄石韋CGA合成關(guān)鍵酶活性的影響? 高磷處理下PAL活性最低，較正常施磷處理組降低了12.85%，而低磷處理較正常施磷PAL活性無顯著變化（圖3：A）。磷處理對(duì)C4H活性的影響與氮處理相似，呈先升高后降低的趨勢(shì)（圖3：B）。低磷處理4CL活性與正常施磷相比無顯著變化，而高磷處理4CL活性較正常施磷降低了14.39%（圖3：C）。正常施磷的HCT活性最低，低磷和高磷處理較正常施磷相比分別升高了20.15%和15.67%（圖3：D）。HQT活性隨磷處理濃度先上升后下降，高磷處理較正常磷處理降低了24.83%（圖3：E）。磷處理對(duì)C3H活性無顯著影響（圖3：F）。

2.2.4 鉀處理對(duì)有柄石韋CGA合成關(guān)鍵酶活性的影響? 鉀濃度對(duì)有柄石韋PAL活性無顯著影響（圖4：A）。低鉀處理和高鉀處理的C4H活性較正常施鉀分別降低了23.44%和31.72%，均達(dá)到顯著水平（圖4：B）。低鉀處理與正常施鉀的4CL活性無顯著性差異，而高鉀處理較正常施鉀下降了22.40%（圖4：C）。高鉀處理較正常施鉀HCT活性升高了28.94%（圖4：D）。高鉀處理的HQT活性較正常施鉀相比降低了22.45%，而低鉀處理與正常施鉀無顯著性差異（圖4：E）。C3H活性在不同鉀處理下無顯著變化（圖4：F）。

2.3 氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋CGA含量及其合成關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析

不同濃度的氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋CGA合成途徑中關(guān)鍵酶活性與CGA含量相關(guān)性分析如表1所示，上游關(guān)鍵酶4CL與有柄石韋CGA含量呈極顯著正相關(guān)，下游關(guān)鍵酶HQT活性與CGA含量呈顯著正相關(guān)，而下游關(guān)鍵酶HCT活性與CGA含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

3? 討論與結(jié)論

施氮量不足和過多時(shí)都會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不同的脅迫作用，造成抗氧化酶活性變化（劉寒等，2020），植物能通過促進(jìn)抗氧化酶系統(tǒng)加強(qiáng)清除活性氧的能力以維持正常生長(zhǎng)（Nadarajah， 2020）。本研究中，高濃度氮會(huì)對(duì)有柄石韋生長(zhǎng)造成脅迫環(huán)境，而植株則通過提高SOD、CAT活性以適應(yīng)環(huán)境，與羌活在氮處理中抗氧化酶活性變化的研究一致（張燕等，2018）?？寡趸赶到y(tǒng)協(xié)同作用才能消除體內(nèi)有害的自由基，植物通過提高CAT活性應(yīng)對(duì)高磷和低磷脅迫造成的活性氧損害；而SOD活性隨著鉀濃度增高降低，這與低鉀脅迫下孔雀草抗氧化系統(tǒng)變化規(guī)律較為一致（王宏宇等，2020）。整體而言，低濃度和高濃度施肥會(huì)對(duì)有柄石韋生長(zhǎng)造成脅迫，但CAT變化趨勢(shì)與SOD變化不一致，SOD活性主要響應(yīng)于有柄石韋的高氮和低鉀處理，而CAT活性則對(duì)3種養(yǎng)分的低濃度和高濃度處理都有顯著響應(yīng)。脯氨酸在植物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，其合成與代謝與許多細(xì)胞途徑有關(guān)，如光合作用、線粒體呼吸、氧化還原平衡、能量穩(wěn)態(tài)等（Alvarez et al.， 2022）。研究表明，脯氨酸也是植物獲得能量的來源，通過介導(dǎo)NADP+/NADPH比率的變化影響氧化磷酸戊糖途徑（OPPP）的碳通量，提供了赤蘚糖-4-磷酸形式的前體，以在應(yīng)激條件下合成苯丙素或次級(jí)代謝產(chǎn)物（Kishor et al.， 2005）。這可能是本研究中脯氨酸含量變化與CGA含量變化規(guī)律較為相似的原因。

本研究表明，氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋CGA積累具有顯著影響。Kovacik等（2020）研究表明連翹在高氮處理下CGA含量減少，而正常施氮更利于CGA積累，可能與高氮處理下CGA合成相關(guān)酶基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)（張婷婷等，2022）。同樣，低磷脅迫會(huì)使參與苯丙烷次生代謝物生物合成的PAL和4CL基因表達(dá)下調(diào)（Zhao et al.， 2023），這可能是導(dǎo)致低磷處理下有柄石韋CGA含量顯著下降的原因。Sun等（2023）研究表明，蘋果葉片在缺鉀處理下PAL、C4H和4CL基因表達(dá)上調(diào)，在高濃度鉀處理狀態(tài)下PAL基因表達(dá)下調(diào)，類黃酮通路在對(duì)不同鉀處理的反應(yīng)中起著重要作用。本研究中，高鉀處理下CGA含量處于最低水平，與付立忠等（2019）高鉀處理不利于三葉青酚類物質(zhì)積累的研究結(jié)果一致。推測(cè)可能是植株中鉀與鈣、鎂等陽離子之間存在著過高拮抗作用，過量施鉀會(huì)降低植株的Ca/K、Mg/K，導(dǎo)致植株養(yǎng)分不平衡，從而影響植物的次生代謝過程（王千等，2012）。PAL、4CL、C4H、HCT、C3H和HQT作為植物體內(nèi)CGA合成關(guān)鍵酶已經(jīng)在金銀花（張靜茹等，2016）、桑葉（Zhao et al.， 2019）等植物中得到驗(yàn)證，但在合成途徑中所占的重要性不同。本研究中，有柄石韋在不同的肥料處理下CGA含量及其合成關(guān)鍵酶活性存在顯著性差異。相關(guān)性分析表明，CGA含量與上游關(guān)鍵酶4CL和下游限速酶HQT呈顯著正相關(guān)，而與HCT活性呈顯著負(fù)相關(guān)。HCT 是HQT的上游酶，兩者之間的底物與產(chǎn)物存在聯(lián)系，有著反饋調(diào)節(jié)和負(fù)反饋調(diào)節(jié)。可見，4CL、HQT和HCT是氮磷鉀3種主要養(yǎng)分影響有柄石韋CGA積累的關(guān)鍵酶，但其影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，氮磷鉀肥對(duì)有柄石韋的SOD和CAT兩種抗氧化酶活性有顯著的影響，SOD活性主要響應(yīng)高氮和低鉀處理，而CAT活性則對(duì)3種養(yǎng)分的低濃度和高濃度處理均有顯著響應(yīng)。不同水平氮、磷和鉀濃度對(duì)有柄石韋CGA含量存在顯著影響，正常施肥的CGA含量最高，達(dá)12.92 mg·g-1，高鉀施肥的CGA含量最低，為7.79 mg·g-1，鉀肥對(duì)CGA含量影響最顯著。HQT、4CL和HCT是造成不同施肥處理有柄石韋CGA含量差異的關(guān)鍵酶。

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（責(zé)任編輯? 周翠鳴）