楊銳 趙興平 何明婕 劉敏 羅蓉 陳川龍 潘淑康 丁章貴

摘要：普洱茶素（Puerins）是從普洱熟茶中分離得到的兒茶素衍生物，是一類結(jié)構(gòu)獨特的含氮多酚化合物。開展普洱茶素Ⅴ～Ⅶ抗乳腺癌細胞作用的研究，以4種不同受體表型的乳腺癌細胞株為模型，進行噻唑藍（MTT）比色試驗、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測及細胞凋亡檢測等試驗。結(jié)果表明，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ等3個單體化合物對4種乳腺癌細胞都有顯著的抑制作用；蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，普洱茶素干預(yù)后乳腺癌細胞表達產(chǎn)生差異的蛋白主要集中于代謝通路，其次是癌癥通路和黏附斑信號通路；細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)3個普洱茶素化合物均可誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞的凋亡。本研究報道了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌細胞活性及初步作用機制，為研究普洱熟茶抗癌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)信息。

關(guān)鍵詞：普洱熟茶；普洱茶素；乳腺癌；蛋白質(zhì)組學(xué)；細胞凋亡

中圖分類號：S571.1；R737.9?????????????? 文獻標識碼：A?????????????? 文章編號：1000-369X（2024）03-501-14

Study on the Effects of Puerins Ⅴ-Ⅶ on Four Kinds of Breast Cancer Cells

YANG Rui1，2，6， ZHAO Xingping 1，2，6， HE Mingjie1，2，6， LIU Min1，2，6， LUO Rong1，2，6，

CHEN Chuanlong5，6， PAN Shukang1，2，6*， DING Zhanggui1，2，3，4，6*

1. Yunnan TAETEA Microbial Technology Co.， Ltd.， Kunming 650217， China; 2. Fermentation Engineering Research Center for Yunnan Pu-erh Tea， Kunming 650217， China; 3. Yunnan Institute of Microbiology， School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming 650091， China; 4. Key Laboratory for Southwest Microbial Diversity of the Ministry of Education， Yunnan University， Kunming 650091， China;

5. Menghai Tea Industry Co.， Ltd.， TAETEA Group， Menghai 666200， China; 6. Key Laboratory of Pu-erh Tea Processing Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming 650217， China

Abstract： Puerins， a kind of nitrogen-containing polyphenol compound with unique structure， is a kind of catechin derivative first isolated from ripened Pu-erh tea. In this paper， the effects of puerins Ⅴ-Ⅶ on breast cancer cells were studied. Four breast cancer cell lines with different receptor phenotypes were used as models， and MTT assay， proteomics detection and apoptosis detection were carried out. The results show that all puerins Ⅴ， Ⅵ and Ⅶ had obvious inhibitory effects on the four kinds of breast cancer cells. Proteomics analysis indicates that the differentially expressed proteins were mainly concentrated in the metabolic pathway， followed by cancer pathway and adhesion spot signal pathway under the intervention of puerins Ⅴ-Ⅶ. Apoptosis detection demonstrates that all three puerins compounds could induce the apoptosis of MDA-MB-231 cells. This study first reported the anti-breast cancer activity and preliminary mechanism of puerins Ⅴ-Ⅶ， which provided basic information for studying the anti-cancer active substances of ripened Pu-erh tea.

Keywords： ripened Pu-erh tea， puerins， breast cancer， proteomics， apoptosis

普洱茶，是一種由云南大葉種曬青毛茶加工制成的茶葉，是云南的地理標志產(chǎn)品，根據(jù)加工工藝的不同，普洱茶可分為普洱生茶和普洱熟茶，其中普洱熟茶由曬青毛茶經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成，是一種獨特的微生物發(fā)酵茶。普洱熟茶具有降脂減肥、調(diào)節(jié)腸道菌群、降糖、抗氧化、抗癌等多種保健功能，受到越來越多消費者的喜愛[1-2]。普洱熟茶的化學(xué)成分與曬青毛茶相比差異較大，除簡單兒茶素、黃酮及黃酮苷、簡單酚酸類、生物堿等成分外，普洱熟茶中的茶多糖、茶褐素等物質(zhì)的含量較高，此外，還存在一系列特殊的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如特征兒茶素類（A環(huán)取代產(chǎn)物普洱茶素puerins、B環(huán)衍生產(chǎn)物teadenols）、奎寧酸衍生物、他汀類和酰胺類化合物等[3]，這些特殊的成分是其成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多變的物質(zhì)基礎(chǔ)，普洱熟茶的一些特殊保健功能可能與這些特殊的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有關(guān)，因而通過對這些物質(zhì)成分的進一步研究，可為普洱熟茶的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和更多可能。

普洱茶素Ⅰ～Ⅷ（Puerins Ⅰ-Ⅷ）是普洱熟茶中一類特殊的含氮多酚化合物，由兒茶素與茶氨酸環(huán)化加合而成，是微生物作用下天然形成的兒茶素A環(huán)8位取代形成的N-乙基-2-吡咯烷酮取代的黃烷-3-醇化合物。Zhou等[4]在普洱茶中發(fā)現(xiàn)了一類新的8-C取代的黃烷-3醇化合物，普洱茶素A和B，證實了普洱熟茶中存在有特異的多酚類物質(zhì)。東方等[5]在普洱茶的抗氧化活性成分中檢測到了普洱茶素A和B，并推測這些特異多酚物質(zhì)可能具有較強的抗氧化活性。Wang等[6]在普洱熟茶中發(fā)現(xiàn)并分離得到了普洱茶素Ⅰ～Ⅷ化合物，并且發(fā)現(xiàn)普洱茶素Ⅰ～Ⅳ在1 μmol·L-1（0.401 μg·mL-1）劑量時對過氧化氫誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細胞（HMEC）損傷具有保護作用，且作用強于表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）等兒茶素類和酚酸物質(zhì)。上述研究表明，普洱茶素Ⅰ～Ⅷ作為普洱熟茶的活性成分，可能具有特殊的活性潛力。除抗氧化活性外，普洱茶素Ⅰ～Ⅲ還具有改善高脂血癥小鼠的糖脂代謝紊亂[7]、改善動脈粥樣硬化[8]和降脂[9]等作用，且濃度為500 μmol·L-1（200.5 μg·mL-1）普洱茶素Ⅲ對HepG2細胞的存活率沒有明顯影響，以50 mg·kg-1·d-1劑量連續(xù)給藥6周未見小鼠的明顯毒副反應(yīng)[9]。而普洱茶素Ⅴ～Ⅷ作為普洱熟茶中的特征性物質(zhì)之一，其活性研究尚未見報道。

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率不斷升高，據(jù)報道，2020年，全球約有230萬新發(fā)乳腺癌病例，預(yù)計到2040年，每年將有超過300萬例乳腺癌新病例，每年死亡人數(shù)將超過100萬[10]，乳腺癌的新發(fā)病例在女性癌癥中占31%，盡管增加了篩查并改進了治療方法，但乳腺癌仍是導(dǎo)致女性死亡的第二大癌癥原因[11]。乳腺癌并不是單一的疾病，根據(jù)其細胞雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長因子受體（HER2）表型特征的不同，可分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2陽性型及三陰性4種亞型[12-13]，其中，三陰性乳腺癌侵襲性強，對常規(guī)治療不敏感且容易產(chǎn)生耐藥性，是目前臨床治療預(yù)后最差的一類乳腺癌[14]。Xie等[15]研究表明，普洱熟茶水提物具有抑制三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，但其中的功能物質(zhì)尚不清楚。為探究普洱茶素Ⅴ～Ⅶ（化合物結(jié)構(gòu)式見圖1）在抗乳腺癌方面的作用，選用4種受體表型特征不同的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7

和BT474為研究對象，分析普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ對乳腺癌的抑制作用，以期為乳腺癌治療藥物的研發(fā)提供更多可能。

1 材料與方法

1.1 試劑

普洱茶素Ⅴ～Ⅶ從普洱熟茶中分離制備得到（云南大益微生物技術(shù)有限公司，純度≥98%），PBS緩沖液購自天津灝洋華科生物科技有限公司，L-15培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液均購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%胰蛋白酶購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司，胰島素購自上海阿拉丁試劑公司，噻唑藍（MTT）購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，他莫昔芬（TAM）購于Sigma-Aldrich公司，乙腈（ACN）和蒸餾水購自上海安譜實驗科技股份有限公司，增強型BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 儀器

酶標儀，美國Bioteck EON；Nano-UPLC EASY-nLC1200與UltiMate 3000聯(lián)用設(shè)備，美國Thermo Scientific；流式細胞儀，美國貝克曼公司。

1.3 細胞株及細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、BT474和MCF-7細胞購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司；MDA-MB-453細胞購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的有酚紅L-15培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 μg·mL-1胰島素的有酚紅MEM培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；BT474細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 ?g·mL-1胰島素的含酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃和CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT試驗

MTT試驗測試普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和BT474等4種乳腺癌細胞的抑制作用。分別收集4種對數(shù)期乳腺癌細胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，細胞密度為每孔8 000個。CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，換用無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液，分別加入普洱茶素Ⅴ～Ⅶ（濃度梯度為0、1、10、20、50、100、150、200 ?g·mL-1）和TAM（濃度梯度為0、1.8、3.7、5.6、7.4、9.3、11.1 ?g·mL-1）進行處理，CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍后，每孔加入150 μL DMSO，輕輕振蕩，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解。置于酶標儀上，測定570 nm處各孔的吸光度值，同時設(shè)置空白調(diào)零孔和對照孔，每組5個重復(fù)。

1.5 蛋白樣品制備

培養(yǎng)瓶中的細胞用0.25%的胰酶消化后，在6孔板中按照每毫升5×105個細胞加入2 mL細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%后，加入30 ?g·mL-1普洱茶素Ⅴ～Ⅶ進行處理，每種細胞均設(shè)置普洱茶素處理組與溶劑對照組，普洱茶素處理組每孔添加2 mL處理液，溶劑對照組每孔添加2 mL溶劑對照液，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)1 h后，去掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（4 ℃）溶液洗滌細胞，將培養(yǎng)皿置于冰上，加入200 ?L預(yù)冷的PBS溶液并用細胞刮刀將細胞刮下，將細胞液轉(zhuǎn)至離心管，4 ℃，1 000 g離心1 min，去除上清液，液氮速凍后存于﹣80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測及數(shù)據(jù)處理

取凍存的蛋白樣品，加入適量RIPA裂解液進行裂解，離心得到蛋白樣品，用BCA試劑盒測定蛋白含量并將樣品調(diào)整至相同蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)胰蛋白酶酶解后進行Nano LC-MS/MS檢測，進樣量2 ?g，反相色譜柱Reprosil-Pur 120 C18-AQ（100 μm ID×15 cm），流動相為乙腈-水體系，A相為2%乙腈（含0.1%甲酸），B相為80%乙腈（含0.1%甲酸），流速300 nL·min-1。洗脫梯度：流動相B 2%～5%持續(xù)2 min，5%～22%持續(xù)88 min，22%～45%持續(xù)26 min，45%～95%持續(xù)2 min，95%持續(xù)2 min。質(zhì)譜原始文件使用MaxQuant軟件（版本1.6.5.0）在SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫中進行檢索分析，采用IBAQ（基于強度的絕對蛋白質(zhì)定量）算法進行定量分析，對比不同處理組以確定具有相似差異的蛋白質(zhì)，差異蛋白利用Proteome Discoverer軟件（2.4.0.305版本，Thermo Fisher Scientific公司）及京都基因與基因組百科全書通路（KEGG Pathway）數(shù)據(jù)庫（www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進行KEGG通路富集分析。

1.7 細胞凋亡檢測

取MDA-MB-231對數(shù)期細胞接種于6孔板，每孔加入2 mL，細胞密度為每孔5×107個，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，換用無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)液，添加2 mL普洱茶素Ⅴ（質(zhì)量濃度為20、40 ?g·mL-1）、普洱茶素Ⅵ（質(zhì)量濃度為15、30 ?g·mL-1）和普洱茶素Ⅶ溶液（質(zhì)量濃度為20、40 ?g·mL-1），分別培養(yǎng)6、12、24 h，進行凋亡誘導(dǎo)。樣品處理結(jié)束后，收集培養(yǎng)基上清液中的細胞，并用不含EDTA的胰酶將細胞從6孔板上消化下來，300 g離心5 min，與上清液中的細胞合并，取1×106個重懸的細胞，PBS洗滌后置于500 ?L稀釋的1×Annexin V-FITC緩沖液（含1%的Annexin V-FITC和PI染液）中重懸，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育20 min，樣品置于冰上，使用流式細胞儀檢測。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，用t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對4種乳腺癌細胞的抑制作用

普洱茶素Ⅴ對4種乳腺癌細胞的作用如圖2所示，與對照組（不添加普洱茶素）相比，當普洱茶素Ⅴ質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1后，MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1后，MCF-7細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1后，BT474細胞存活率顯著下降。

普洱茶素Ⅵ對4種乳腺癌細胞的作用如圖3所示，與對照組（不添加普洱茶素）相比，當普洱茶素Ⅵ質(zhì)量濃度≥1 μg·mL-1，MDA-

MB-453細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1，MDA-MB-453細胞存活率急劇下降，而MCF-7細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1，MDA-MB-231細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1，BT474細胞存活率顯著下降。

普洱茶素Ⅶ對4種乳腺癌細胞的作用如圖4所示，與對照組（不添加普洱茶素）相比，當普洱茶素Ⅶ質(zhì)量濃度≥1 μg·mL-1，MDA-MB-453細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥10 μg·mL-1，MDA-MB-231和MCF-7細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥20 μg·mL-1，BT474細胞存活率顯著降低，而MDA-MB-453和MCF-7細胞存活率急劇下降；當質(zhì)量濃度≥50 μg·mL-1，MDA-MB-231和BT474細胞存活率急劇下降。

陽性藥TAM對4種乳腺癌細胞的作用如圖5所示，與對照組（不添加TAM）相比，當TAM質(zhì)量濃度≥1.8 μg·mL-1，MDA-MB-453細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度≥3.7 μg·mL-1，MDA-MB-231和BT474細胞存活率顯著下降；當質(zhì)量濃度增加到5.6 μg·mL-1，MCF-7細胞存活率顯著下降，且MDA-MB-453、MCF-7和BT474細胞存活率急劇下降。

由上述結(jié)果可知，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ對4種乳腺癌細胞均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，普洱茶素Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ及TAM對4種乳腺癌細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）如表1所示。普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對于上述4種乳腺癌細胞的IC50均在較低范圍內(nèi)（5 ～30 μg·mL-1），特別是對MDA-MB-231、

MDA-MB-453和MCF-7細胞的IC50低至5～

20 μg·mL-1。陽性對照TAM對4種乳腺癌細胞的IC50在5～7 μg·mL-1。整體來看，普洱茶素Ⅴ和Ⅵ對MDA-MB-453細胞的抑制作用與陽性對照TAM相當。

2.2 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ抗乳腺癌潛在作用靶點的篩選

2.2.1 差異表達蛋白篩選

以FLOD CHANGE（FC）≤0.5或FC≥2，且蛋白有對應(yīng)基因名稱為標準，篩選出普洱茶素Ⅴ～Ⅶ處理組相較于溶劑對照組的差異蛋白，所有差異蛋白匯總?cè)绫?所示。

2.2.2 KEGG富集分析

對差異表達蛋白進行KEGG通路分析以研究普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對4種乳腺癌細胞發(fā)揮干預(yù)作用的生物學(xué)途徑，根據(jù)Fisher精確檢驗，蛋白表達差異前十的KEGG通路富集分析結(jié)果如圖6～圖8。

普洱茶素Ⅴ干預(yù)4種乳腺癌細胞的代謝通路分析結(jié)果如圖6所示。普洱茶素Ⅴ干預(yù)后，4種乳腺癌細胞中差異蛋白主要富集于代謝通路（Metabolic pathways，hsa01100），MDA-MB-231和MCF-7細胞映射到此通路中的蛋白差異最顯著，而MDA-MB-453和BT474細胞中富集差異蛋白最顯著的通路分別為肝細胞癌信號通路（Hepatocellular carcinoma，hsa05225）和黏附斑信號通路（Focal adhesion，hsa04510）。此外，普洱茶素Ⅴ干預(yù)后篩選得到的差異蛋白還與癌癥中蛋白聚糖信號通路（Proteoglycans in cancer，hsa05205）、癌癥信號通路（Pathways in cancer，hsa05200）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway，hsa04010）、人乳頭瘤病毒感染通路（Human papillomavirus infection，hsa05165）、人巨細胞病毒感染通路（Human cytomegalovirus infection，hsa05163）、神經(jīng)退行性病變通路（Pathways of neurodegeneration，hsa05022）、胞吞作用通路（Endocytosis，hsa04144）、阿爾茨海默病信號通路（Alzheimer disease，hsa05010）等相關(guān)。

普洱茶素Ⅵ干預(yù)4種乳腺癌細胞的代謝通路分析結(jié)果如圖7所示。普洱茶素Ⅵ干預(yù)后，4種乳腺癌細胞中表達產(chǎn)生顯著差異的蛋白也主要富集于代謝通路，BT474細胞中富集于代謝通路的差異蛋白差異最顯著，而MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7細胞中差異蛋白富集差異最顯著的通路依次為脊髓小腦性共濟失調(diào)信號通路（Spinocerebellar ataxia，hsa05017）、癌癥信號通路和小細胞肺癌信號通路（Small cell lung cancer，hsa05222）。此外，普洱茶素Ⅵ干預(yù)后的差異蛋白還與肝細胞癌信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路（Ubiquitin mediated proteolysis，hsa04120）、癌癥中蛋白聚糖信號通路、病毒致癌作用通路（Viral carcinogenesis，hsa05203）、化學(xué)致癌作用通路（Chemical carcinogenesis，hsa05204）、癌癥中MicroRNA通路（MicroRNAs in cancer，hsa05206）、人乳頭瘤病毒感染通路、人巨細胞病毒感染通路、神經(jīng)退行性病變通路等相關(guān)。

普洱茶素Ⅶ干預(yù)4種乳腺癌細胞的代謝通路分析結(jié)果如圖8所示。與普洱茶素Ⅴ和Ⅵ類似，普洱茶素Ⅶ干預(yù)后，4種乳腺癌細胞中表達產(chǎn)生顯著差異的蛋白主要富集于代謝通路，且MDA-MB-231細胞富集于代謝通路的差異蛋白差異最顯著；而MDA-MB-453、MCF-7和BT474細胞差異蛋白差異最顯著的通路依次為志賀菌病信號通路（Shigellosis，hsa05131）、癌癥中蛋白聚糖信號通路、黏附斑信號通路。此外，普洱茶素Ⅶ干預(yù)后的差異蛋白還與肝細胞癌信號通路、病毒致癌作用通路、癌癥信號通路、胞吞作用通路、人乳頭瘤病毒感染通路、人巨細胞病毒感染通路、神經(jīng)退行性病變通路等相關(guān)。

綜上所述，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對4種乳腺癌細胞的干預(yù)作用比較一致，主要集中于代謝通路，對小細胞肺癌信號通路以及黏附斑信號通路的干預(yù)作用也比較明顯，表明這3條通路與普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的乳腺癌抑制作用機制直接相關(guān)，而其他與癌癥相關(guān)的通路如癌癥中蛋白聚糖信號通路等也可能與其抗乳腺癌作用有關(guān)。

2.3 普洱茶素Ⅴ～Ⅶ誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的效果及機制結(jié)果分析

Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力。當細胞發(fā)生凋亡時，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，被熒光染料FITC標記的Annexin V結(jié)合，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡進行檢測。由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，而PI可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細胞。

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ誘導(dǎo)了MDA-MB-231細胞凋亡（圖9～圖11和表3）。MDA-MB-231細胞在添加普洱茶素Ⅴ～Ⅶ分別培養(yǎng)6、12 h和24 h后，凋亡細胞數(shù)量明顯增加。培養(yǎng)6、12 h和24 h后，20 g·mL-1普洱茶素Ⅴ組細胞凋亡率分別為8.53%、14.96%和21.68%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅴ組細胞凋亡率分別為10.25%、14.22%和27.21%，隨著作用時間和作用濃度增加，細胞凋亡數(shù)量和細胞凋亡率增加；15 g·mL-1普洱茶素Ⅵ組細胞凋亡率分別為8.47%、19.43%和24.03%，30 g·mL-1普洱茶素Ⅵ組細胞凋亡率分別為24.18%、22.75%和22.44%，低劑量作用24 h的誘導(dǎo)凋亡效果略強于高劑量，且低劑量時普洱茶素Ⅵ的誘導(dǎo)凋亡效果與普洱茶素Ⅴ相當；20 g·mL-1普洱茶素Ⅶ組細胞凋亡率分別為8.29%、11.32%和32.36%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅶ組細胞凋亡率分別為14.10%、18.83%和40.10%，隨著作用時間和作用濃度增加，細胞凋亡數(shù)量和細胞凋亡率增加，且相同劑量下誘導(dǎo)凋亡效果強于普洱茶素Ⅴ。

綜合來看，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對乳腺癌細胞MDA-MB-231的凋亡都表現(xiàn)出了明顯的誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)程度及誘導(dǎo)機制基本一致，普洱茶素Ⅴ處理后，MDA-MB-231細胞的早期凋亡和晚期凋亡細胞數(shù)均增加，40 g·mL-1作用24 h時早期細胞凋亡率和晚期細胞凋亡率分別為15.49%和11.72%，差異不大，說明普洱茶素Ⅴ可以通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞的正常程序性死亡和非正常程序性死亡這兩條途徑抑制乳腺癌細胞的生長。同樣，普洱茶素Ⅵ和Ⅶ處理后，MDA-MB-231細胞的早期凋亡和晚期凋亡細胞數(shù)均增加，且早期凋亡數(shù)增加更明顯，30 g·mL-1普洱茶素Ⅵ作用24 h時早期細胞凋亡率和晚期細胞凋亡率分別為16.86%和5.58%，40 g·mL-1普洱茶素Ⅶ作用24 h時早期細胞凋亡率和晚期細胞凋亡率分別為29.65%、10.45%，說明普洱茶素Ⅵ和Ⅶ主要通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞的正常程序性死亡來抑制癌細胞的生長，細胞膜基本保持其完整性。

3 討論

隨著科技的發(fā)展，乳腺癌的治療方法不斷進步，從乳腺癌根治術(shù)、放療和化療方法的輔助應(yīng)用到靶向治療和內(nèi)分泌藥物的發(fā)展，乳腺癌患者的生存率不斷提升[16-17]，但不同亞型的乳腺癌治療效果和生存情況不盡相同，隨著新診斷人群的增加，死亡人數(shù)仍呈增加趨勢。因此，開發(fā)一種能夠用于乳腺癌安全防治的新型藥物顯得尤為必要。普洱茶作為一種日常飲品，具有多種保健功效，受到眾多消費者喜愛?，F(xiàn)有研究報道，普洱茶能抑制多種腫瘤細胞的增殖[18]，具有抗胃癌[19]、肝癌[20]、宮頸癌[21]、口腔癌[22]等多種抗癌活性，也具有抑制三陰性乳腺癌細胞生長和誘導(dǎo)凋亡的作用[15]。普洱熟茶經(jīng)微生物發(fā)酵后化學(xué)成分多樣，這些復(fù)雜的化學(xué)成分是其功能發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，普洱茶素系列化合物的活性研究報道較少，除普洱茶素Ⅰ～Ⅳ被報道具有抗過氧化氫誘導(dǎo)HMEC損傷的保護作用、改善高糖高脂攝入引起的糖脂紊亂和高脂血癥外，尚未見普洱茶素Ⅴ～Ⅶ化合物的活性研究報道。

本研究首次報道了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌作用，研究結(jié)果顯示，在MTT試驗中普洱茶素Ⅴ～Ⅶ都表現(xiàn)出對4種不同受體表型乳腺癌細胞的顯著抑制作用，其中，普洱茶素Ⅴ和Ⅵ對MDA-MB-453細胞的抑制作用更強，與陽性對照藥物TAM作用相當；在4種細胞中，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ均對BT474細胞的抑制作用較弱，這可能與其受體表型不同有關(guān)。采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法進一步分析普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的抗乳腺癌潛在作用機制，發(fā)現(xiàn)普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對4種乳腺癌細胞的干預(yù)作用比較一致，作用后差異最顯著的細胞信號途徑主要集中于代謝通路，其次是小細胞肺癌信號通路和黏附斑信號通路，表明普洱茶素Ⅴ～Ⅶ的乳腺癌抑制作用機制可能與這3條通路直接相關(guān)，這可為后續(xù)開展其抗癌機制研究提供一定的信息基礎(chǔ)?；谌幮匀橄侔㎝DA-MB-231細胞臨床預(yù)后最差，本研究進行了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對MDA-MB-231細胞凋亡的影響測試，結(jié)果顯示，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ均能誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞的凋亡，普洱茶素Ⅴ可能通過誘導(dǎo)細胞的正常程序性死亡和非正常程序性死亡這兩條途徑抑制MDA-MB-231細胞的生長，而普洱茶素Ⅵ和Ⅶ可能通過誘導(dǎo)細胞的正常程序性死亡來抑制MDA-MB-231細胞的生長。據(jù)此推測，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ極有可能是普洱熟茶抗乳腺癌活性的功能成分之一，其抗乳腺癌作用機制可能是通過誘導(dǎo)細胞凋亡抑制乳腺癌細胞的生長。

本研究初步證明了普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對4種乳腺癌細胞的抗癌活性以及對MDA-MB-231乳腺癌細胞的生長抑制作用，但其發(fā)揮抗乳腺癌活性的作用機制還有待進一步研究。此外，不同類型的乳腺癌細胞的敏感性不盡相同，普洱茶素Ⅴ～Ⅶ對不同類型乳腺癌的治療價值仍需進一步探討。本研究拓展了普洱茶素系列化合物的活性范圍，為乳腺癌防治藥物的研究在細胞水平上提供了新的理論依據(jù)。

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