［摘 要］ 目的：探討尿石素A （UA） 對(duì)長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉所致小鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙 （POCD）的改善作用，并闡明其可能的作用機(jī)制。方法：24只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、麻醉組和UA 組，每組8 只。UA 組小鼠于麻醉前2 d 每天腹腔注射200 μL UA 溶液，空白對(duì)照組和麻醉組小鼠給予等體積生理鹽水，麻醉組和UA 組小鼠制備長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉模型，空白對(duì)照組小鼠不作處理。采用Y 迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠輪替正確率、移動(dòng)距離和移動(dòng)速度，條件恐懼實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠僵直時(shí)間百分率，Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中白細(xì)胞介素（IL） -1β、IL-10 和成熟腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mBDNF）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：Y迷宮實(shí)驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠輪替正確率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠輪替正確率明顯升高（Plt;0. 01）。條件恐懼實(shí)驗(yàn)中情境記憶測(cè)試，與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠僵直時(shí)間百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠僵直時(shí)間百分率明顯升高（Plt;0. 05）；線索記憶測(cè)試，各組小鼠僵直時(shí)間百分率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。Western blotting 法，與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01），IL-10 和mBDNF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠海馬組織中IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10 和mBDNF 蛋白表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 05或Plt;0. 01）。結(jié)論：UA可以改善小鼠的POCD，其作用機(jī)制可能與UA的抗炎活性可抑制POCD 小鼠的中樞炎癥且上調(diào)mBDNF 蛋白表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 尿石素A； 異氟醚； 術(shù)后認(rèn)知功能障礙； 白細(xì)胞介素； 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

［中圖分類號(hào)］ R742 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitivedysfunction， POCD） 的發(fā)生與手術(shù)創(chuàng)傷和全身麻醉有關(guān)。研究［1-2］ 顯示：長(zhǎng)時(shí)間暴露于揮發(fā)性麻醉藥會(huì)損害老年患者的神經(jīng)認(rèn)知能力。對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究［3］ 表明： 長(zhǎng)時(shí)程麻醉會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，長(zhǎng)期暴露于麻醉中會(huì)對(duì)動(dòng)物認(rèn)知功能產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響。異氟醚是使用最為廣泛的吸入麻醉劑之一， 已被證實(shí)會(huì)損害患者認(rèn)知功能［4］。鞣花酸（ellagic acid， EA） 是鞣花單寧（ellagitannin，ETs） 的一種水解產(chǎn)物，在石榴、漿果和堅(jiān)果中含量豐富［5］。人體對(duì)EA 和ETs 的吸收較差，但EA 和ETs 會(huì)被腸道微生物群進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生尿石素。尿石素A （urolithin A，UA） 是人體內(nèi)可被觀察到的腸道菌群主要代謝產(chǎn)物，可以通過血腦屏障［6］。近年來，UA 作為一種天然分子，因其具有抗衰老、抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)活性而受到廣泛關(guān)注［5］。研究［7］ 顯示：UA 能夠促進(jìn)線蟲有絲分裂、延長(zhǎng)線蟲壽命和提高嚙齒類動(dòng)物肌肉功能。UA 在體外和體內(nèi)均具有抗炎和抗氧化特性［5］。飲食中補(bǔ)充UA 可以緩解阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease， AD）模型小鼠在空間學(xué)習(xí)記憶、聯(lián)想學(xué)習(xí)和探索行為方面表現(xiàn)出的認(rèn)知障礙［8］。目前關(guān)于UA 改善POCD模型小鼠認(rèn)知功能障礙的作用尚未完全闡明。本研究構(gòu)建POCD 模型小鼠，探討UA 通過抑制中樞炎癥改善小鼠的認(rèn)知功能，并闡明其可能的分子作用機(jī)制，為臨床優(yōu)化POCD 治療方案提供新的策略。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 、藥物 、主要試劑和儀器

雄性C57BL/6J 小鼠24 只， 8 周齡， 體質(zhì)量20～25 g，購自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心。所有動(dòng)物分組飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境2 周以上，可自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （浙） 2019-0004。動(dòng)物房間維持在標(biāo)準(zhǔn)的12 h 光/暗周期，溫度（23±1） ℃和濕度50%～60%。本研究經(jīng)南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)： 2020AE01110）， 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的要求， 所有實(shí)驗(yàn)程序均按照歐盟關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的第2010/63/EU 號(hào)指令進(jìn)行。異氟醚購自山東魯南貝特制藥有限公司， UA 購自上海 Standard 公司。RIPA 裂解液（貨號(hào)：P0013B） 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司， 蛋白酶和磷酸酶抑制劑購自美國(guó)Thermo Fisher 公司， SDS- 聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophosesis， PAGE） （ 貨號(hào)： PG112） 和TBST （貨號(hào)： PS103） 購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，兔抗成熟腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mature brain-derived neurotrophic factor，mBDNF）（貨號(hào)：ab108319）、兔抗谷氨酸受體2B抗體（N-Methyl-d-Asprtate receptor-2B，NMDAR2B） （ 貨號(hào)： ab3856） 和兔抗白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β （貨號(hào)： ab9722） 購自美國(guó)Abcam 公司，兔抗IL-10 （貨號(hào)：12163S） 和兔抗β -actin （貨號(hào)： 4970） 購自美國(guó)Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG-HRP 二抗（貨號(hào)：BL003A） 購自北京蘭杰科技有限公司， 二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（enhacedchemiluminescence， ECL） 工作液（貨號(hào)： E412-02） 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。異氟醚揮發(fā)罐購自上海瑞曼信息科技有限公司，Y 迷宮為南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院麻醉科自制，條件恐懼研究系統(tǒng)Fear-Condition system 購自西班牙Panlab 公司，超低溫冰箱購自美國(guó)Thermo Fisher 公司，低溫冰箱購自安徽中科美菱公司，恒溫水浴槽購自美國(guó)Crystal SafeTemp 公司，核酸蛋白檢測(cè)分光光度計(jì)和蛋白電泳儀購自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模和分組

C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、麻醉組和UA 組， 每組8 只。UA 溶于DMSO［6］，注射前使用生理鹽水進(jìn)一步稀釋，終濃度為0. 5 g·mL－1。UA 組小鼠于麻醉前2 d 每天腹腔注射200 μL UA 溶液，空白對(duì)照組和麻醉組小鼠均給予等體積生理鹽水。麻醉組和UA 組小鼠置于含有5% 異氟醚的麻醉箱中誘導(dǎo)1 min，以2～3 L·min－1的流速于100% 氧氣中以1. 5% 異氟醚維持6 h。異氟醚暴露期間，使用麻醉監(jiān)護(hù)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)小室中異氟醚濃度，空白對(duì)照組小鼠于相同環(huán)境下飼養(yǎng)但不進(jìn)行麻醉處理。在麻醉期間，觀察小鼠的呼吸以判斷小鼠生命體征，防止出現(xiàn)呼吸抑制，并用加熱毯覆蓋箱子以維持小鼠的正常體溫，制備長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉小鼠模型。小鼠生命體征正常即為造模成功。

1. 3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠空間記憶能力

長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉模型小鼠全身麻醉后第 3 天進(jìn)行Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。Y 迷宮為長(zhǎng)方體空間，由3 個(gè)相同的臂組成， 各臂之間的夾角為 120°， 分別為 A 臂、B 臂和C 臂。理論上具有良好空間記憶的小鼠進(jìn)入Y 迷宮的新臂后， 不會(huì)立即探索先前訪問過的舊臂。實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠置于Y 迷宮的中心，使其在迷宮中自由探索8 min，使用Any-mzae 軟件記錄小鼠進(jìn)入每個(gè)臂的順序和次數(shù)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠進(jìn)入每個(gè)臂的次數(shù)、移動(dòng)距離和移動(dòng)速度。未重復(fù)的輪替探索順序，如ABC、BCA 和CAB，被定義為成功的輪替組合。儀器自動(dòng)記錄輪替次數(shù)，計(jì)算小鼠輪替正確率。輪替正確率=未重復(fù)的輪替探索次數(shù)/總輪替探索次數(shù)×100%。

1. 4 條件恐懼實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠恐懼記憶能力

長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉模型小鼠全身麻醉后第3 天進(jìn)行條件恐懼實(shí)驗(yàn)。將小鼠置于25 cm×25 cm×25 cm 箱子中進(jìn)行5 min 自由探索；然后接受4 kHz、90 dB 的聲音刺激28 s，聲音刺激結(jié)束后接受足部0. 8 mA 電擊刺激2 s。更換小鼠后，使用75% 乙醇擦拭箱子。第2 天進(jìn)行情境記憶測(cè)試和線索記憶測(cè)試，檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)期間小鼠僵直和運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。在情境記憶測(cè)試中，小鼠被放置于相同的房間內(nèi)5 min，無聲音和電擊刺激；在線索記憶測(cè)試中，人為改變箱子內(nèi)部隔板，小鼠暴露于相同的聲音刺激下，但無電擊刺激。采用PACKWIN 系統(tǒng)記錄小鼠僵直時(shí)間百分率。僵直時(shí)間百分率=測(cè)試時(shí)小鼠的僵直時(shí)間/總時(shí)間×100%。

1. 5 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-10和 mBDNF 蛋白表達(dá)水平

完成行為學(xué)測(cè)試后，對(duì)各組小鼠安樂死并取海馬組織，－80 ℃冰箱保存。小鼠海馬組織中加入RIPA 裂解液后勻漿，使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑防止降解。4 ℃離心， 收集上清。SDS-PAGE 上樣， 電泳后轉(zhuǎn)膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST 溶液漂洗，加入一抗4 ℃過夜，兔抗IL-1β （1∶2 000）、兔抗IL-10（1∶2 000）、兔抗mBDNF （1∶1 000） 和兔抗β-actin（1∶20 000） 稀釋，漂洗3 次，加入羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶20 000） 室溫?fù)u床孵育2 h。ECL 工作液顯影并拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad 9. 0 軟件繪制圖像。各組小鼠Y 迷宮實(shí)驗(yàn)輪替正確率、移動(dòng)距離和移動(dòng)速度，條件恐懼實(shí)驗(yàn)各組小鼠僵直時(shí)間百分率，海馬組織中IL-1β、IL-10 和mBDNF 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠輪替正確率、移動(dòng)距離和移動(dòng)速度

與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠輪替正確率明顯降低（Plt;0. 01），移動(dòng)距離和移動(dòng)速度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與麻醉組比較，UA 組小鼠輪替正確率明顯升高（Plt;0. 01）， 移動(dòng)距離和移動(dòng)速度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表1。

2. 2 各組小鼠僵直時(shí)間百分率

情境記憶測(cè)試結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠僵直時(shí)間百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠僵直時(shí)間百分率明顯升高（Plt;0. 05）。線索記憶測(cè)試結(jié)果顯示：各組小鼠僵直時(shí)間百分率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-10和mBDNF蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01），IL-10 和mBDNF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10和mBDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖1。

3 討 論

UA 可改善APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠突觸結(jié)構(gòu)蛋白丟失和行為學(xué)層面的認(rèn)知能力下降［9］。研究［10］ 顯示： UA 可促進(jìn)哺乳動(dòng)物海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知功能改善，在口服UA 的AD 小鼠模型中，小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡減少。同時(shí)， UA 處理的APP/PS1 小鼠顯著增加了海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生， 提示其具有對(duì)APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善作用［5］。UA 具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其對(duì)神經(jīng)元凋亡、海馬神經(jīng)發(fā)生、反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥信號(hào)等多個(gè)過程的調(diào)控有關(guān)［6］。研究［11］顯示：UA 可以緩解糖尿病相關(guān)的認(rèn)知障礙。在帕金森病小鼠模型中， UA 治療可以減少多巴胺能神經(jīng)元的丟失，改善認(rèn)知行為障礙和神經(jīng)炎癥［12］。研究［13］ 顯示UA 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化和保護(hù)作用。UA 可降低脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 處理的促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮（nitric oxide， NO） 水平，并降低腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor- α，TNF-α）、IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子水平［14］。此外，UA 可抑制TNF-α 的產(chǎn)生和LPS 刺激的巨噬細(xì)胞極化［15-16］。以上研究結(jié)果均提示，UA 在體內(nèi)和體外均具有抗氧化及抗炎的能力。本研究結(jié)果顯示：長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉模型小鼠的輪替正確率和僵直時(shí)間百分率均明顯降低，提示小鼠海馬依賴性記憶功能明顯受損，小鼠POCD 模型制備成功。在線索記憶測(cè)試中，各組小鼠僵直時(shí)間百分率無明顯差異，提示小鼠的非海馬依賴性記憶能力無明顯損傷。因此，長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉會(huì)導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致POCD。本研究結(jié)果顯示：長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉前2 d， 腹腔注射UA 可以緩解小鼠麻醉后產(chǎn)生的認(rèn)知功能障礙，與麻醉組比較，UA 組小鼠的輪替正確率和僵直時(shí)間百分率均明顯升高，提示UA 可改善小鼠長(zhǎng)時(shí)程異氟醚麻醉引起的POCD。尿石素具有抗炎和抗氧化作用，其中UA 顯示出最強(qiáng)的抗炎活性［10，17］。本研究結(jié)果顯示： 小鼠腹腔注射UA 后，小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低，IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯升高， 提示UA 可能抑制神經(jīng)炎癥，進(jìn)一步改善POCD 小鼠的認(rèn)知障礙。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derivedneurotrophic factor， BDNF） 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族成員之一，其表達(dá)水平變化會(huì)影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和存活，也是突觸傳遞和突觸可塑性的主要調(diào)節(jié)因子［18-19］。BDNF 的成熟體mBDNF 在海馬長(zhǎng)時(shí)程記憶形成的過程中發(fā)揮重要作用［20］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中mBDNF 蛋白表達(dá)水平明顯降低，給予UA 后，小鼠海馬組織中mBDNF 蛋白表達(dá)水平明顯升高。

綜上所述，UA 可以改善POCD 小鼠的認(rèn)知功能障礙，其作用機(jī)制可能與UA 的抗炎活性可抑制POCD 小鼠的中樞炎癥且上調(diào)mBDNF 蛋白表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：許敏慧、程曉雷和夏天嬌參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及結(jié)果討論，許敏慧、許繼巖和江林昊參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集、分析及論文撰寫。

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[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82101636）