大豆胞囊線蟲相關(guān)基因GmWRKY-3克隆及功能探究

摘要：大豆是世界四大糧食作物之一，與小麥、水稻和玉米并列。大豆胞囊線蟲（SCN，Heterodera glycines Ichinohe）是全球大豆最有害的病原體之一。利用大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種（SCN 3）、感病品種綏農(nóng)14、抗病品種東農(nóng)L10為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出差異表達(dá)基因GmWRKY-3。為探究大豆GmWRKY-3基因的生物學(xué)功能及潛在用途，克隆GmWRKY-3基因，對(duì)GmWRKY-3基因的理化性質(zhì)、編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息學(xué)分析；構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3利用農(nóng)桿菌侵染煙草，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；構(gòu)建pCAMBIA3300-GmWRKY-3植物重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599后瞬時(shí)侵染大豆毛狀根，初步探究GmWRKY-3基因的功能。結(jié)果表明，GmWRKY-3基因編碼的蛋白分子量約為 24.93 ku，等電點(diǎn)為8.46，分子式為C1 086H1 722N312O343S9，不穩(wěn)定系數(shù)為67.73，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)由1個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊組成；該基因含有多個(gè)光響應(yīng)元件和多種激素順式作用元件等。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GmWRKY-3基因主要定位于細(xì)胞核。農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染大豆毛狀根結(jié)果表明，與pCAMBIA3300空載體轉(zhuǎn)基因植株相比，pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因受體植株東農(nóng)50中根部線蟲數(shù)量相對(duì)較少。上述結(jié)果表明，GmWRKY-3基因?qū)CN有一定的抵抗能力。

關(guān)鍵詞：大豆；大豆胞囊線蟲；GmWRKY-3；亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S435.651" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）23-0030-08

劉" 芳，曲" 碩，孫浩文，等. 大豆胞囊線蟲相關(guān)基因GmWRKY-3克隆及功能探究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：30-38.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.004

收稿日期：2023-10-18

基金項(xiàng)目：黑龍江省重點(diǎn)基金（編號(hào)：ZD2022C002）；黑龍江省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：JD22A015）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：U22A20473）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)崗位體系項(xiàng)目（編號(hào)：CARS-04-PS07）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研項(xiàng)目（編號(hào)：NEAU2023QNLJ-003）。

作者簡(jiǎn)介：劉" 芳（2000—），女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事大豆作物遺傳育種，E-mail：18846913802@139.com；共同第一作者：曲" 碩（1994—），男，吉林長(zhǎng)春人，博士研究生，主要從事大豆作物遺傳育種，E-mail：531140417@qq.com。

通信作者：韓英鵬，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事大豆基因組學(xué)遺傳育種研究，E-mail：hyp234286@aliyun.com；趙" 雪，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事大都基因組學(xué)和分子育種研究，E-mail：xuezhao@neau.edu.cn。

大豆［Glycine max （Linn.） Merr.］原產(chǎn)于我國(guó)，為豆科大豆屬一年生草本植物，是我國(guó)重要的糧食和油料作物［1］。生物脅迫是造成大豆減產(chǎn)的主要因素之一，其中大豆胞囊線蟲（SCN）病是大豆主要的病蟲害之一［2］。大豆胞囊線蟲在世界各地的大豆主產(chǎn)區(qū)均有廣泛分布，在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)于東北地區(qū)［3］。SCN平均每年造成的大豆產(chǎn)量損失為 10%～30%［4-6］。目前主要的防治措施為輪作和施用農(nóng)藥，但農(nóng)藥嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境，因此提高大豆對(duì)SCN的抵抗能力迫在眉睫。

大豆胞囊線蟲的生命周期為3～4周，分為3個(gè)主要階段，即卵期、幼蟲期和成蟲期，其中幼蟲期又可以分為4個(gè)階段（J1～J4）［7］。卵在胞囊內(nèi)形成，卵蛻皮進(jìn)入J1階段，J1階段蛻皮進(jìn)入蠕蟲狀的J2階段，J2階段是線蟲唯一具有侵害大豆根系能力的階段［8］。SCN通過表皮細(xì)胞侵染大豆根部，使其不能正常生長(zhǎng)，進(jìn)而造成大豆減產(chǎn)。合胞體是SCN和大豆宿主之間的生物營(yíng)養(yǎng)界面，它的功能必須保持約3周的時(shí)間，線蟲才能通過J3、J4階段的生長(zhǎng)發(fā)育，形成成年雌性或雄性。雌性SCN的體內(nèi)攜帶幾百個(gè)卵，在根表皮生長(zhǎng)，同時(shí)在根維管圓柱體上保持不斷擴(kuò)大的合胞體攝食位點(diǎn)。雄性SCN放棄合胞體，離開根部，遷移給雌性受精。受精的雌性SCN通常會(huì)釋放一些卵，這些卵會(huì)釋放后不久孵化，從而在同一生長(zhǎng)季節(jié)實(shí)現(xiàn)線蟲種群增加和植物損傷。但仍有幾百個(gè)卵通常保留在雌性體內(nèi)，隨著雌性線蟲死亡，形成硬化的胞囊。目前大豆對(duì)SCN的主要抗性位點(diǎn)為Rhg1和Rhg4，伴隨著不同生理小種的突變和環(huán)境的變化，發(fā)現(xiàn)更多的抗性位點(diǎn)具有重要意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族之一，是調(diào)節(jié)許多植物過程信號(hào)網(wǎng)的組成部分［9］。WRKY在植物中的表達(dá)量非常豐富，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，其中最主要的作用是調(diào)節(jié)植物的免疫與病原體發(fā)育。目前，距第1次發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子已超過20年。近些年關(guān)于WRKY的研究越來越廣泛，如在耐旱、耐鹽、抗病等方面都有所研究，且在煙草、馬鈴薯、擬南芥、水稻等植物中均已被鑒定和分析［10-13］。WRKY第1次是在甘薯中被鑒定出來的［14］。WRKY功能主要是由其結(jié)構(gòu)域決定的，長(zhǎng)度約為60個(gè)氨基酸殘基，WRKYGQK位于其N末端，其C端還具有鋅指結(jié)構(gòu)。

WRKY基因在很多植物中都發(fā)揮著重要功能，但相關(guān)研究主要集中在擬南芥和一些其他作物中，而在大豆胞囊線蟲上的研究較為少見。楊雪梅等發(fā)現(xiàn)，擬南芥WRKY51轉(zhuǎn)錄因子可以抑制RPW8.1啟動(dòng)子的活性，通過敲除該基因可以調(diào)控RPW8.1啟動(dòng)子的活性，從而影響植物對(duì)白粉病的抗性，說明WRKY51介導(dǎo)基本防御反應(yīng)［15］。Meher等在對(duì)稻瘟病抗性基因進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，OsWRKY蛋白可與2個(gè)稻瘟病抗病基因Pi2和Pi54的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，對(duì)稻瘟病的發(fā)展具有重要意義［16］。劉麗麗等采用VIGS策略，沉默基因SlWRKY80，發(fā)現(xiàn)植株根部對(duì)線蟲的敏感性增強(qiáng)，根結(jié)數(shù)量增多，植株病情指數(shù)由感病態(tài)變?yōu)楦吒袘B(tài)，說明SlWRKY80可能作為正調(diào)控因子參與番茄對(duì)根結(jié)線蟲的抵抗［17］。Wang等在對(duì)柑橘的研究中發(fā)現(xiàn)，CsWRKY33定位于細(xì)胞核，瞬時(shí)過表達(dá)CsWRKY33可顯著增強(qiáng)寄主對(duì)綠霉病的抗性［18］。通過過往的研究發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物抵抗逆境脅迫具有重要意義。

目前，關(guān)于WRKY基因家族在SCN脅迫下發(fā)揮的功能和機(jī)制還沒有相關(guān)研究報(bào)道。因此對(duì)于抗SCN的研究提供了重要的基因資源。本研究利用大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種（SCN3）、感病品種綏農(nóng)14、抗病品種東農(nóng)L10為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出差異表達(dá)基因GmWRKY-3，通過克隆GmWRKY-3基因，對(duì)GmWRKY-3基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹生物信息學(xué)分析。構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3重組質(zhì)粒進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，并構(gòu)建pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌K599，對(duì)大豆毛狀根進(jìn)行瞬時(shí)侵染，初步探究GmWRKY-3基因的功能。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

本研究于2023年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。大豆感病品種綏農(nóng)14、東農(nóng)50和抗病品種東農(nóng)L10均來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽基地（45.76°N，126.93°E）。大豆胞囊線蟲3號(hào)生理小種取自黑龍江省大慶市安達(dá)試驗(yàn)基地。具體鑒定方法參照文獻(xiàn)［19］。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1" GmWRKY-3基因克隆

利用TRIzol法提取抗病大豆品種東農(nóng)L10 的mRNA，利用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2" GmWRKY-3基因擴(kuò)增

在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中查找GmWRKY-3基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物（表1）。反應(yīng)體系為20 μL，其中上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、模板2 μL、KOD ONE 10 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，68 ℃延伸5 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增程序結(jié)束后，取4 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3" GmWRKY-3基因亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)GmWRKY-3基因的CDS序列，選取pCAMBIA1302載體的NcoⅠ酶切位點(diǎn)側(cè)翼各15 bp同源序列進(jìn)行引物修飾，利用Primer 5設(shè)計(jì)基因亞細(xì)胞定位引物（表1）。以抗病品種東農(nóng)L10 的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同“1.2.2”節(jié)。參照南京諾唯贊生物科技股份有限公司的ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒的操作步驟，應(yīng)用同源重組技術(shù)，將目的片段與酶切后的pCAMBIA1302載體進(jìn)行in-fusion連接，取GmWRKY-3-sub PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL、pCAMBIA1302載體 3 μL、5×Mix Buffer 4 μL、酶2 μL、ddH2O 10 μL 混勻，30 ℃連接30 min。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增及測(cè)序，確定已成功將GmWRKY-3連接入pCAMBIA1302載體。參照說明書，將pCAMBIA1302-GmWRKY-3轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，涂布于含有Kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上，挑取的單菌落轉(zhuǎn)移至含有液體LB的2 mL EP管中，之后轉(zhuǎn)移至50 mL液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；室溫收集菌體；使用MES重懸至D600 nm=1.0，室溫黑暗靜置2～3 h；注射至 4 周齡煙草葉片背部，25 ℃ 黑暗培養(yǎng)12 h后，正常培養(yǎng) 2 d。采用注射器在侵染葉片上選取4～6個(gè)葉圓片進(jìn)行制片；隨后在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)綠色熒光信號(hào)。

1.3" 基因生物信息學(xué)分析

1.3.1" 理化性質(zhì)及編碼蛋白質(zhì)分析

利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)；使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org）分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。研究差異表達(dá)基因編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)。

1.3.2" 啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

利用PlantCARE分析GmWRKY-3轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件。

1.3.3" 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGA 10.0軟件對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法（NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析基因在不同物種中的分布情況和親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。

1.4" pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組質(zhì)粒連接及測(cè)序

根據(jù)GmWRKY-3基因的CDS序列、pCAMBIA3300載體的XbaⅠ酶切位點(diǎn)側(cè)翼各15 bp同源序列進(jìn)行引物修飾，利用Primer 5對(duì)GmWRKY-3基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，結(jié)果見表1。PCR擴(kuò)增、目的片段與載體的連接、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定過程參照“1.2.2”“1.2.3”節(jié)。

1.5" pCAMBIA3300-GmWRKY-3農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染

提取測(cè)序正確的大腸桿菌pCAMBIA3300-GmWRKY-3的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌K599中。初步鑒定過程參照“1.2.3”節(jié)。選取籽粒大小均勻、完整、無病斑的感病品種綏農(nóng)14與東農(nóng)50，播種至蛭石中。蘸取上述發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于28" ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，將菌落輕輕刮下，使用共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基重懸菌體，直至D600 nm=0.8，得到菌液侵染液。選取3～4 d苗齡的幼苗，使用1 mL注射器，在幼苗子葉節(jié)點(diǎn)或近端下胚軸處注射菌液，重復(fù)2～3次，進(jìn)行菌液接種，并在傷口下端約1 cm處剪斷，放回蛭石中培養(yǎng)2～3周，取適量根部組織利用Bar試紙條進(jìn)行轉(zhuǎn)基因根系鑒定。將在Bar試紙條水平上檢測(cè)為轉(zhuǎn)基因陽性的植株，保留陽性根部組織，移栽至接種大豆胞囊線蟲卵懸液的病土中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3周。

1.6" 陽性根表型鑒定

以感病品種東農(nóng)50為受體試驗(yàn)材料，將含有pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組載體與pCAMBIA3300空載體的K599農(nóng)桿菌菌液接種于根系生長(zhǎng)點(diǎn)，接種15 d后，進(jìn)行側(cè)根取樣，采用Bar試紙條進(jìn)行鑒定，根據(jù)Bar試紙條驗(yàn)證結(jié)果，選取轉(zhuǎn)基因陽性根接種HG type 0（3號(hào)生理小種）。接種SCN 15 d后，采用酸性品紅染色法分別對(duì)2個(gè)試驗(yàn)組合（接種pCAMBIA3300-GmWRKY-3重組載體和pCAMBIA3300空載體農(nóng)桿菌菌液）發(fā)生突變和未發(fā)生突變的大豆根部進(jìn)行染色，在體式顯微鏡下觀察線蟲侵染情況，每株取3個(gè)側(cè)根作為生物學(xué)重復(fù)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" GmWRKY-3基因克隆

以抗病品種東農(nóng)L10大豆根部的cDNA為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，克隆載體測(cè)序結(jié)果（圖1）表明，目的片段大小為663 bp，該序列長(zhǎng)度與GmWRKY-3 CDS序列相符。

2.2" 基因序列生物信息學(xué)分析

2.2.1" GmWRKY-3基因理化性質(zhì)及編碼蛋白質(zhì)分析

使用Phytozome在線網(wǎng)站查找GmWRKY-3的基因信息，該基因的CDS序列長(zhǎng)度為663 bp，編碼220個(gè)氨基酸。利用ExPASy在線工具對(duì)GmWRKY-3編碼蛋白的基本理化特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該

蛋白分子量約為24.93 ku，等電點(diǎn)為8.46，分子式為C1 086H1 722N312O343S9，脂肪指數(shù)為51.37，不穩(wěn)定系數(shù)為67.73，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)中絲氨酸個(gè)數(shù)最多，占總氨基酸數(shù)量的10.0%，其次為谷氨酸、蘇氨酸，占比均在8.0%以上，最少的是蛋氨酸，占比為1.4%。通過SOPMA網(wǎng)站對(duì)GmWRKY-3編碼的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，不同結(jié)構(gòu)類型的占比分別為無規(guī)則卷曲48.64%、α-螺旋32.27%、延伸鏈15.91%、β-轉(zhuǎn)角3.18%。使用SWISS-MODEL對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)域主要由1個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊組成。

2.2.2" 啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

使用PlantCARE啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析GmWRKY-3基因的順式作用元件，結(jié)果（表2）表明，上游區(qū)域含有MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，G-box、TCT-motif光響應(yīng)元件，MBS參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，ABRE、Myb等脅迫相關(guān)激素的響應(yīng)元件。MYB轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)是最多作用元件。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，GmWRKY-3基因的表達(dá)可能受到光、脅迫、激素等多種信號(hào)的調(diào)控，從而影響植物抵抗生物脅迫的能力。

2.2.3" 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了解GmWRKY-3的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與GmWRKY-3基因編碼蛋白同源性較高的多種植物的WRKY蛋白序列，包括向日葵（sunflower）、傘形葡萄（umbrella grape）、角荬菜（endive）、菜豆（pea bean）、三葉草（whitetip clover）、日本蓮花（Japanese lotus）、白蕨（white fern）、龍眼雙果（longan double fruit）、本氏煙草（ben tobacco）等，同時(shí)利用MEGA 10.0軟件構(gòu)建與大豆同源度較高的物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹， 結(jié)果（圖3）表明，大豆的GmWRKY-3基因與同物種大豆WRKY40轉(zhuǎn)錄因子（XP 025983959.1）親緣關(guān)系最近，不同物種之間與野生大豆（RZC15262.1）、赤豆（XP 017429633.1 ）、洋紫荊（KAI4337249.1）、木豆（XP 020206663.1、KYP34952.1）等聚為同一分支，親緣關(guān)系較近，同源性較高。

2.3" pCAMBIA1302-GmWRKY-3載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

將重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-GmWRKY-3連接轉(zhuǎn)化至DH5α后，在具有Kana抗性的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，使用引物GmWRKY-3-1302-F和 GmWRKY-3-1302-R（表1）對(duì)陽性單菌落進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)獲得含有目的條帶的陽性菌液（圖4）進(jìn)行測(cè)序，并保存至-80 ℃冰箱中。

將含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-GmWRKY-3的農(nóng)桿菌K599菌液注射入本氏煙草中。結(jié)果顯示，在瞬時(shí)表達(dá)pCAMBIA1302-GmWRKY-3融合蛋白的煙草葉片細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均能檢測(cè)到熒光信號(hào)，但主要定位于細(xì)胞核；而單獨(dú)表達(dá)

pCAMBIA1302的對(duì)照細(xì)胞，熒光信號(hào)分布于整個(gè)細(xì)胞（圖5）。可見GmWRKY-3蛋白屬于核定位蛋白。

2.4" pCAMBIA3300-GmWRKY-3載體構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pCAMBIA3300-GmWRKY-3連接轉(zhuǎn)化至DH5α后，在具有Kana抗性的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，使用引物GmWRKY-3-3300-F和 GmWRKY-3-3300-R（表1）對(duì)陽性單菌落進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)獲得的目的條帶正確的菌液（圖6）進(jìn)行測(cè)序，并保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

2.5" GmWRKY-3基因抗病性驗(yàn)證

分別選取轉(zhuǎn)入pCAMBIA3300-GmWRKY-3基因與pCAMBIA3300空載體的植株，利用Bar試紙條在蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7）表明，pCAMBIA3300-GmWRKY-3基因與pCAMBIA3300空載體均成功轉(zhuǎn)入植株。由圖8可知，與對(duì)照相比，pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因植株在莖、葉水平上無明顯差別，但對(duì)照組毛狀根明顯少于pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因植株。接種SCN 15 d后，對(duì)大豆根部進(jìn)行酸性品紅染色，并在20×體式顯微鏡下觀察線蟲侵染情況。圖9-a～圖9-c 為pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因陽性植株根中大豆胞囊線蟲侵染情況，平均每個(gè)側(cè)根有 1～5頭大豆胞囊線蟲，根部線蟲數(shù)量平均值為 4.30個(gè)/cm；圖9-d為pCAMBIA3300空載體對(duì)照植株根部線蟲侵染情況，根部線蟲數(shù)量平均值為6.30個(gè)/cm，可見轉(zhuǎn)基因陽性植株根部線蟲數(shù)量明顯少于對(duì)照植株，初步證實(shí)，GmWRKY-3基因?qū)Υ蠖拱揖€蟲病有一定的抵抗能力。

3" 討論

大豆最早在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)，隨后傳入其他國(guó)家，

我國(guó)大豆胞囊線蟲主要分布于東北地區(qū)和黃淮海地區(qū)。大豆胞囊線蟲于1954年在美國(guó)北卡羅來納州第1次被發(fā)現(xiàn)，是一種土傳性病害，在土壤中沒有寄主存在時(shí)，在某些儲(chǔ)存條件下可以存活9年［20］。由于鑒別的寄主不同，大豆胞囊線蟲被分為16個(gè)生理小種， 我國(guó)主要有11個(gè)生理小種，其中關(guān)于3號(hào)生理小種的研究最為廣泛，4號(hào)生理小種的侵染能力最強(qiáng)［21］。

目前，選育并種植抗大豆胞囊線蟲病大豆品種是防治SCN最經(jīng)濟(jì)有效的措施，而篩選抗源是抗性品種選育的基礎(chǔ)。Concibido等使用遺傳標(biāo)記，分析了3種分離大豆F2代種群，并將結(jié)果與之前涉及PI 209332的研究結(jié)果進(jìn)行了比較，總結(jié)了有關(guān)SCN相互作用的廣泛遺傳數(shù)據(jù)，為SCN研究人員和大豆育種者提供了資源［22］。有研究表明，在不同的大豆產(chǎn)區(qū)，SCN也可以在PI 88788、PI 437654、Peking上繁殖，嚴(yán)重影響產(chǎn)量及其他農(nóng)藝性狀。因此迫切需要從不同抗性來源培育穩(wěn)定的抗性品種。近年來，關(guān)于大豆胞囊線蟲抗性基因的篩選取得了重大進(jìn)展，Rhg1（18號(hào)染色體）和Rhg4（8號(hào)染色體）為主要的抗性位點(diǎn)。來自PI 88788的Rhg1位點(diǎn)是商業(yè)品種中可用的抗性的主要來源，可以最大限度地減少侵染SCN的產(chǎn)量損失。Rhg1包含3個(gè)主要的基因，其中1個(gè)為t-SNARE，是大豆Rhg1基因抵抗胞囊線蟲的關(guān)鍵決斷因素［23］。為抵御細(xì)菌、真菌和線蟲等病原體的入侵，許多植物利用囊泡運(yùn)輸來應(yīng)對(duì)免疫反應(yīng)，t-SNARE編碼的蛋白是囊泡運(yùn)輸?shù)闹饕鞍字唬?4］。來自Peking的Rhg4位點(diǎn)主要抵抗3號(hào)生理小種和14號(hào)生理小種。目前大多數(shù)抗性品種的抗性均來源于PI88788、Peking和PI437654基因型背景，主要抵抗3號(hào)生理小種［22，25］，因此，挖掘新的抗性基因至關(guān)重要。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲的取食位點(diǎn)還受信號(hào)激素的影響，Kammerhofer等于2015年發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的茉莉酸（JA）對(duì)甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）取食起著防御作用，乙烯則對(duì)線蟲取食起著積極作用，水楊酸（SA）抑制合胞體的形成［26］；Nahar等于2011年在對(duì)水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，外源施加乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）后，線蟲在抵消根系防御途徑方面效果較差，從而增強(qiáng)植物對(duì)線蟲的抵抗能力［27］。胡巖峰等于2018年研究發(fā)現(xiàn)了茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）對(duì)SCN的防御效應(yīng)和作用機(jī)制［28］。SCN是植物病原體中最具挑戰(zhàn)性的病原體之一，主要原因在于胞囊在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，它的卵在胞囊內(nèi)孵化，可免受破壞性環(huán)境的影響，包括免受迄今為止已知的最具侵略性（不可接受的侵略性）殺蟲劑的侵害［29］。一旦SCN在農(nóng)田中建立，就很難根除。遠(yuǎn)離大豆輪作5～7年是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，在下一個(gè)種植季節(jié)仍然會(huì)有未孵化的SCN卵孵化，并且在有利于發(fā)病的環(huán)境范圍內(nèi)廣泛傳播。SCN侵?jǐn)_的地理范圍延伸到美國(guó)中部和加拿大的主要大豆產(chǎn)區(qū)以及巴西和阿根廷，現(xiàn)在在我國(guó)也很常見［30］。

WRKY蛋白可以根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指基序的類型分為Ⅰ～Ⅲ組。WRKY也可以根據(jù)其基因內(nèi)含子類型分為2組，即R型或V型。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合順式作用元件激活下游基因，涉及生理變化以及對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物先天免疫系統(tǒng)許多方面的核心組成部分，包括MTI或PTI、ETI、基礎(chǔ)防御和全身性抵抗。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與種子發(fā)育、種子休眠和發(fā)芽、開花、衰老、代謝途徑以及毛狀體形態(tài)發(fā)生和植物生長(zhǎng)。它們主要通過與特定基因啟動(dòng)子中存在的保守W-box元件結(jié)合來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子，尤其是Ⅲ組，可參與對(duì)食草動(dòng)物、病原體和線蟲的反應(yīng)?，F(xiàn)在有許多例子證明，WRKY基因的過表達(dá)或敲除對(duì)植物防御能力有影響，Grunewald等已初步探索了AtWRKY23在擬南芥中對(duì)線蟲的抵抗能力，為后續(xù)從WRKY轉(zhuǎn)錄因子中挖掘大豆胞囊線蟲抗性基因提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)［31］。

4" 結(jié)論

本研究成功克隆了大豆GmWRKY-3基因，該基因的CDS序列長(zhǎng)度為663 bp，共編碼220個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GmWRKY-3基因編碼的蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)由1個(gè)α-螺旋和5個(gè) β-折疊組成。由啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果可知，該基因含有多個(gè)光響應(yīng)元件和多種激素順式作用元件等。為了進(jìn)一步研究其功能，本研究構(gòu)建pCAMBIA1302-GmWRKY-3重組質(zhì)粒，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GmWRKY-3基因主要在細(xì)胞核中行使功能。本研究構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pCAMBIA3300-GmWRKY-3，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大豆毛狀根，結(jié)果表明，pCAMBIA3300-GmWRKY-3轉(zhuǎn)基因陽性植株根中線蟲數(shù)量平均值為4.30個(gè)/cm；pCAMBIA3300空載體對(duì)照植株根部線蟲數(shù)量平均值為6.30個(gè)/cm，說明轉(zhuǎn)基因陽性植株根部雌蟲平均數(shù)明顯少于對(duì)照植株，初步證實(shí)GmWRKY-3對(duì)大豆胞囊線蟲有一定的抵抗能力。結(jié)果可為進(jìn)一步探究在SCN脅迫下，GmWRKY2-3增強(qiáng)大豆抵抗能力的相關(guān)研究提供重要的理論依據(jù)。

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