ε-聚賴氨酸對蘋果采后灰霉病防治效果及機(jī)理

摘要：為探尋高效、安全的蘋果采后灰霉病的控制方法，研究 ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）對蘋果采后灰霉病的防治效果及其抗性誘導(dǎo)機(jī)制，以無菌水為對照，采用不同濃度的 ε-PL誘導(dǎo)處理蘋果24 h后，探究 ε-PL 控制蘋果灰霉病的最佳使用濃度。將 ε-PL分別用打孔注入和整果浸泡的方法處理蘋果，研究其對蘋果抗性物質(zhì)分泌、抗性酶活性及其編碼基因表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)制，同時(shí)考察其對蘋果自然腐爛和貯藏品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，400 mg/L 的ε-PL防治蘋果采后灰霉病的效果最佳，其能誘導(dǎo)蘋果酚類化合物、類黃酮和木質(zhì)素含量顯著升高（Plt;0.05），同時(shí)能誘導(dǎo)提高多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）編碼基因的表達(dá)，提高抗性酶活性。此外，該濃度 ε-PL浸果處理0.25 h貯藏50 d后，蘋果的自然腐爛率相對于對照組降低了77.26%，貯藏品質(zhì)相比對照組更好。因此，ε-PL能有效控制蘋果采后灰霉病，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：ε-PL；生理機(jī)制；灰霉??；蘋果；誘導(dǎo)抗性；防治效果

中圖分類號：TS255.3" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0187-07

竇" 勇，閭懷中，孔令偉，等. ε-聚賴氨酸對蘋果采后灰霉病防治效果及機(jī)理［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：187-194.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.026

收稿日期：2024-05-26

基金項(xiàng)目：2024年江蘇高校“青藍(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目。

作者簡介：竇" 勇（1979—），安徽巢湖人，博士，副教授，研究方向?yàn)楣卟珊蟊ｕr技術(shù)。E-mail：douyong1979@163.com。

蘋果含有豐富的維生素和膳食纖維，是人們喜愛的水果之一。在貯藏和運(yùn)輸過程中，蘋果易受損傷而被霉菌侵染。由灰霉（Borytis cinerea）引起的灰霉病是蘋果的采后主要病害之一，采用化學(xué)防腐劑來控制灰霉病，效果雖好，但存在環(huán)境污染和食品安全問題［1］。為此，研發(fā)安全性高的蘋果灰霉病控制方法，市場前景廣闊［1］。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種無毒防腐劑，具有較強(qiáng)的抗菌效力，其作為一種天然的食品保鮮劑，已廣泛應(yīng)用于面包、飲料等食品［2］。近年來，ε-PL在水果采后病害防治領(lǐng)域的研究也已有開展。Sun等的研究發(fā)現(xiàn) ε-PL能提高龍眼ATP酶活性，增加ATP、ADP含量和能荷水平，進(jìn)而提高龍眼的抗病能力［3］。Shu等研究結(jié)果表明，ε-PL對蘋果、冬棗和番茄的采后黑斑病的防治效果顯著［4］。Jiao等報(bào)道了ε-PL能顯著抑制草莓、櫻桃番茄、葡萄和青椒灰霉病的發(fā)生。此外，有研究發(fā)現(xiàn) ε-PL可以作為一種生物源性化學(xué)激發(fā)子來誘導(dǎo)提高水果對采后病害的抗病能力［5］。Liu等研究發(fā)現(xiàn) ε-PL處理能誘導(dǎo)煙草苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）等抗性酶活性的提高，增強(qiáng)煙草的抗病毒能力［6］。Sun等的研究結(jié)果表明，ε-PL處理能誘導(dǎo)抗病物質(zhì)（木質(zhì)素和H2O2）含量和多酚氧化酶（PPO）、PAL、POD等抗病酶活性的提高［7］。Li等在研究 ε-PL對冬棗灰霉病的防治效果中，發(fā)現(xiàn) ε-PL能誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)氧化酶同源物編碼基因RBOH的上調(diào)表達(dá)，產(chǎn)生活性氧（ROS）來抑制冬棗中灰霉菌的生長［8］。

然而，ε-PL在蘋果采后病害的防治中的應(yīng)用研究較少，特別是在 ε-PL控制蘋果采后灰霉病及其機(jī)制方面的研究較少。為探索安全、高效的蘋果采后灰霉病的防治方法，本研究通過打孔和整果浸泡的方法，用 ε-PL誘導(dǎo)處理蘋果，探究其對灰霉病和自然腐爛的防治效果及機(jī)理，并考察其對蘋果品質(zhì)指標(biāo)的影響，以期為蘋果采后灰霉病的防治提供試驗(yàn)參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

于2023年5月1日至9月30日，在江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2" 材料與試劑

1.2.1" 供試水果

商品熟的紅富士蘋果采自山東煙臺某果園，選擇未經(jīng)化學(xué)處理，大小基本一致，無病蟲害，未受機(jī)械損傷的果實(shí)作為供試蘋果。用0.1%（體積比）次氯酸鈉浸洗120 s，再用無菌水清洗殘留表皮的氯酸鈉和微生物后，晾干備用。

1.2.2" 供試病原菌

從自然發(fā)病的蘋果上分離、純化1株病原菌，經(jīng)鑒定為B.cinerea，為蘋果的致病菌。將B.cinerea孢子接種于馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)1 d，再將孢子懸液涂布接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)上，于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d，進(jìn)行菌種活化。用無菌鋼制角匙輕刮表面孢子，加入無菌水后再用移液器吸取孢子懸液經(jīng)4層無菌紗布過濾，用血球計(jì)數(shù)板法測定孢子濃度，并用無菌水調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×105個(gè)/mL，備用［9］。

1.2.3" 主要試劑

戊二醛、乙二胺四乙酸（EDTA）、愈創(chuàng)木酚、苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），分析純，淮安市科密化學(xué)試劑有限公司；ε-PL，化學(xué)純，美國Sigma公司。PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，大連TaKaRa公司。

1.3" 主要儀器與設(shè)備

D-50型移液器，德國BRAND公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）；JIDI-16R型冷凍離心機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司；JSF-7001型熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；LHP-400型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州普天儀器制造有限公司；HT-1112M型立式恒溫?fù)u床，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；TA-XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro System公司。

1.4" 試驗(yàn)方法

1.4.1" ε-PL對蘋果灰霉病的防治效果

用打孔器在蘋果中央均勻打孔4個(gè)，大小為5 mm×4 mm，處理組每孔分別注入25 μL的ε-PL（濃度分別為100、200、400、800、1 000 mg/L），以無菌水為對照（CK），將所有供試蘋果置于無菌框中，用聚乙烯（PE）膜密封，于室溫、相對濕度（RH）95%條件下貯存 24 h［1］。所有供試蘋果每孔接種25 μL的 1×105個(gè)/mL 的B.cinerea孢子懸浮液，于相同條件下貯存［10］。從第3天開始，每隔1 d，采用十字交叉法測定傷口腐爛直徑，并統(tǒng)計(jì)腐爛率。

1.4.2" ε-PL在蘋果體內(nèi)對B.cinerea菌絲生長的影響

按照“1.4.1”節(jié)中方法處理供試蘋果，每孔注入25 μL的400 mg/L的 ε-PL，以無菌水為對照，于RH 95%、室溫下貯存24 h。所有供試蘋果每孔注入25 μL 1×105 個(gè)/mL的B.cinerea孢子懸液，相同條件下繼續(xù)貯存［1］ 。分別在接種后的8、14、20 h 取樣，制備掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，簡稱SEM）樣品。用經(jīng)火焰滅菌并冷卻后的手術(shù)刀削取傷口孔內(nèi)圈厚約1 mm的組織，用2.5%的戊二醛浸泡，避光5 h，再將組織薄片浸沒在0.1 moL/L（pH值=7.2）的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，簡稱PBS）中5次，每次 30 s。依次用30%、60%、90%、100%的乙醇溶液浸洗，每次6 min［1，11-12］。處理好的蘋果切片經(jīng)真空冷凍干燥20 h后，固定于SEM樣品臺上，在SEM下觀察B.cinerea在蘋果體內(nèi)的生長情況。

1.4.3 ""ε-PL對蘋果抗性相關(guān)酶活性的影響

試驗(yàn)設(shè)置CK組和處理組，采用“1.4.2”節(jié)中的方法處理供試蘋果，CK組經(jīng)無菌水處理后接種B.cinerea孢子，處理組經(jīng) ε-PL處理后接種B.cinerea孢子。分別于試驗(yàn)當(dāng)天和隨后每隔1 d取樣，用無菌手術(shù)刀削取傷口處組織薄片2 g，于事先滅菌并冷凍的研缽中，加入約2 g石英砂和1 mL含0.038% EDTA和1% PVP的50 mmol/L（pH值為7.8）的PBS溶液，充分研磨后加入9 mL PBS，將所有組織轉(zhuǎn)入無菌離心管中，于 0 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于測定酶活性，以U/g 鮮重（fresh weight，簡稱FW）表示［1，13］。PPO活性測定參考Godana等的方法，略作修改，酶活定義為D398 nm每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活單位（U）［1，14］。PAL活性的測定參考Xi等的方法，稍作改動，酶活定義為D290 nm每小時(shí)增加0.01為 1 U［15］。POD活性的測定參照Godana等的方法，略作改動，酶活定義為D470 nm每分鐘增加0.01為 1 U［16］。CAT活性的測定參考Zhou等的方法，稍作調(diào)整，酶活定義為D420 nm每分鐘降低0.01為1 U［17］。

1.4.4" 蘋果抗性相關(guān)酶編碼基因表達(dá)量的測定

采用“1.4.3”節(jié)中使用的蘋果組織樣品約2 g，于事先滅菌并冷凍的研缽中，立刻倒入液氮，快速磨成粉末，分別用試劑盒提取總RNA，并對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參考Dou等的方法，測定蘋果抗性酶編碼基因相對表達(dá)量［2，18］。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)蘋果抗性相關(guān)酶編碼基因的RT-qPCR特異性引物，見表1。

1.4.5" "ε-PL對蘋果抗性物質(zhì)分泌的影響

采用“1.4.3”節(jié)中使用的蘋果組織樣品，測定蘋果抗性物質(zhì)含量。參照Deng等的方法，測定蘋果總酚和類黃酮的含量，分別用D280 nm /g FW和D325 nm /g FW表示［19］。參考Morrison等的方法，測定蘋果木質(zhì)素的

含量，用D280 nm /g FW表示［20］。

1.4.6 ""ε-PL對蘋果采后自然腐爛和貯藏品質(zhì)的影響

選擇未經(jīng)化學(xué)處理，大小基本一致，無病蟲害，未受機(jī)械損傷的蘋果，用400 mg/L" ε-PL溶液浸泡蘋果0.25 h，以無菌水為對照。隨后，置于無菌塑料框中密封，于RH 95%、室溫下貯藏50 d。然后，統(tǒng)計(jì)腐爛率并測定貯藏品質(zhì)指標(biāo)。參照彭貞貞等的方法，測定蘋果的可滴定酸（titrable acidity，簡稱TA）含量［21］；參照Semyalo等的方法，測定蘋果的可溶性固形物（soluble solid content，簡稱SSC）含量［22］；參照Tokala等的方法，使用物性儀測定蘋果的硬度［23］；參照Wang等的方法，測定蘋果的維生素C含量［24］；失重率參照Li等的方法［25］進(jìn)行測定。

2" 結(jié)果與分析

2.1" ε-PL對蘋果灰霉病的控制效果

圖1是蘋果經(jīng)不同濃度 ε-PL處理24 h后，接種灰霉菌孢子，貯存6 d的腐爛情況?？梢钥闯?，當(dāng)ε-PL濃度在100～800 mg/L時(shí)，能夠有效地抑制灰霉菌引起的腐爛，其中400 mg/L處理組蘋果的腐爛率和腐爛直徑顯著低于其他試驗(yàn)組（Plt;0.05）。ε-PL濃度升到800 mg/L時(shí)，蘋果傷口腐爛率和腐爛直徑開始增大；濃度升到1 000 mg/L時(shí)，腐爛率和貯藏4 d的腐爛直徑與CK組相比差異不顯著（Pgt;0.05）。這說明，400 mg/L的 ε-PL對蘋果灰霉病的抑制效果最佳，過高的濃度可能引起蘋果自身組織細(xì)胞的損傷，反而加速傷口腐爛進(jìn)程，不利于 ε-PL控制蘋果采后灰霉病。

2.2" ε-PL對蘋果自然腐爛和貯藏品質(zhì)的影響

用400 mg/L的 ε-PL對蘋果浸果處理 0.25 h，于20 ℃、RH 95%條件下貯藏50 d，考察蘋果腐爛情況及品質(zhì)指標(biāo)。如表2所示，處理組自然腐爛率顯著低于CK組， 相較于CK， 蘋果自然腐爛率降低了77.26%；失重率降低了17.75%；相反，硬度提高了10.22%。與CK相比，處理組的TA、SSC、

維生素C含量的差異均不顯著?？梢?，400 mg/L的 ε-PL防止蘋果自然腐爛效果顯著，且能提高蘋果的貯藏品質(zhì)。

2.3" ε-PL在蘋果體內(nèi)對B.cinerea菌絲生長的抑制效果

蘋果經(jīng)400 mg/L的 ε-PL處理后再接種B.cinerea孢子，其菌絲生長情況見圖2。CK組B. cinerea 在接種后的8 h內(nèi)孢子均未萌發(fā)，14 h后孢子已萌發(fā)且出現(xiàn)明顯的菌絲生長，20 h后菌絲已布滿蘋果組織表面。從CK組SEM圖可以看出，在接種14 h后，蘋果組織變得粗糙，代謝物增多，B. cinerea 孢子能正常生長并侵染未經(jīng) ε-PL處理的蘋果組織。處理組SEM圖顯示，B.cinerea孢子在接種后的20 h內(nèi)均未萌發(fā)，孢子干癟，蘋果組織表面較為完整，未見明顯代謝物。可見，在蘋果體內(nèi)，400 mg/L 的 ε-PL對B.cinerea菌絲生長控制效果明顯。

2.4" ε-PL對蘋果抗性物質(zhì)分泌的影響

2.4.1" ε-PL對蘋果總酚含量的影響

酚類物質(zhì)是水果抵御真菌侵染的重要的抗病物質(zhì)，在苯丙烷代謝途徑中合成，該途徑受到PAL和POD活性的調(diào)控［1，25］。由圖3可知，從1 d起，處理組的總酚含量顯著高于CK（Plt;0.05），其中在3 d時(shí)總酚含量最高，在隨后的4～7 d，維持著較高的水平?？梢钥闯?，ε-PL能誘導(dǎo)蘋果酚類物質(zhì)的分泌，來提高其對灰霉病的抗病力。

2.4.2" ε-PL對蘋果類黃酮含量的影響

類黃酮包括查爾酮、根皮苷、高圣草素和表兒茶素等物質(zhì)，它是水果體內(nèi)一類重要的抗菌物質(zhì)，當(dāng)水果受到病原菌侵染時(shí)，會釋放此類物質(zhì)，來抵御外來脅迫作用。由圖4可知，ε-PL處理組蘋果類黃酮含量在貯藏的1～3 d不斷上升，在3～7 d 維持著較高的水

平，且從2 d開始，處理組蘋果類黃酮含量均顯著高于CK組（Plt;0.05），這說明 ε-PL處理能誘導(dǎo)提高蘋果抗菌物質(zhì)類黃酮的含量。

2.4.3" ε-PL對蘋果木質(zhì)素含量的影響

木質(zhì)素是構(gòu)成水果細(xì)胞壁的主要成分， 為細(xì)胞壁纖維素骨

架的填充物，它能提高細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度，加速組織木質(zhì)化，來抵御外來脅迫作用［1，26］。從圖5可以看出，在貯藏的2～5 d，經(jīng) ε-PL處理的蘋果木質(zhì)素含量維持較高水平，其中2 d時(shí)含量最高，5 d后含量開始下降。由此可見，ε-PL能誘導(dǎo)蘋果木質(zhì)素分泌，提高細(xì)胞壁強(qiáng)度，增強(qiáng)其對灰霉病的抗病力。

2.5" ε-PL對蘋果抗性酶活性及其編碼基因表達(dá)的影響

2.5.1" ε-PL對蘋果PPO活性及其編碼基因表達(dá)的影響

PPO能催化水果組織中多酚物質(zhì)氧化成醌，醌類物質(zhì)可以形成含棕黑素的痂來保護(hù)自身組織細(xì)胞，在水果抗病中發(fā)揮著重要作用［27-28］。圖 6-A 顯示，ε-PL處理組蘋果的PPO活性顯著高于CK，且在貯藏的3～5 d其活性處于較高的水平，6 d時(shí)開始，活性下降。同樣，圖6-B顯示其編碼基因PPO相對表達(dá)量呈現(xiàn)相應(yīng)的變化趨勢。

2.5.2" ε-PL對蘋果PAL活性及其編碼基因表達(dá)的影響

PAL是水果苯丙素合成過程中首步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶，其活性直接影響蘋果酚類化合物等抗性物質(zhì)的合成。由圖7-A可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，PAL活性不斷升高，在貯藏4 d時(shí)達(dá)到峰值103.59 U/g FW，隨后開始下降；從2 d開始，經(jīng) ε-PL 誘導(dǎo)處理的蘋果PAL活性顯著高于CK。從

圖 7-B 可以看出，從1 d開始PAL的編碼基因PAL的相對表達(dá)量均高于CK，在4 d時(shí)達(dá)到最大值，是CK組的5.34倍。

2.5.3" ε-PL對蘋果POD活性及其編碼基因表達(dá)的影響

POD是水果主要抗氧化防御酶之一，它能有效清除水果因外來病原菌侵染而釋放過量的ROS，其參與催化苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素的生物合成，進(jìn)而增加細(xì)胞壁強(qiáng)度［29］。從圖8-A可以看出，處理組POD活性在貯藏的2～7 d內(nèi)均顯著高于CK，且隨著貯藏時(shí)間延長，活性不斷上升，在5 d時(shí)達(dá)到峰值104.36 U/g FW，隨后開始降低。由圖 8-B 可知，POD相對表達(dá)量從貯藏的1 d開始不斷增大，到5 d時(shí)達(dá)到峰值，為CK組的3.98倍，隨后開始下降。

2.5.4" ε-PL對蘋果CAT活性及其編碼基因表達(dá)的影響

CAT是水果體內(nèi)重要的ROS清除酶，它能夠有效清除體內(nèi)過量的H2O2，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其在維持水果體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用［30］。由圖9-A可知，ε-PL處理組蘋果的CAT活性在貯藏的1～7 d內(nèi)均顯著高于CK組，且在2、3、5 d時(shí)CAT活性較高，分別達(dá)到7.7、 7.9、 8.4 U/g FW。而從圖9-B可以看出，在貯藏1～7 d時(shí)處理組CAT表達(dá)量高于CK，且2、3、5 d的CAT相對表達(dá)量也較

高，分別是CK組的3.17、3.20、3.78倍。

3" 討論與結(jié)論

400 mg/L的 ε-PL能有效控制蘋果采后灰霉病，濃度低于100 mg/L的 ε-PL無法控制蘋果采后灰霉病，高于800 mg/L的 ε-PL控制效果減弱，過高的 ε-PL濃度可能引起蘋果自身組織細(xì)胞的損傷，加速腐爛進(jìn)程，反而不能控制由灰霉病引起的蘋果腐爛。400 mg/L的 ε-PL浸泡處理蘋果 15 min，能有效抑制蘋果的自然腐爛，并提高蘋果的貯藏品質(zhì)，這一研究成果將有助于 ε-PL作為一種安全的食品防腐劑應(yīng)用于蘋果和其他水果采后病害防治和貯藏保鮮領(lǐng)域。ε-PL在蘋果體內(nèi)能有效抑制B.cinerea孢子萌發(fā)和菌絲生長，與 ε-PL自身抑菌效力和其誘導(dǎo)蘋果釋放抗性酶和抗性物質(zhì)有關(guān)。ε-PL 能誘導(dǎo)蘋果抗性物質(zhì)的合成，增強(qiáng)其對灰霉病的抗病能力，如能誘導(dǎo)抗性酶編碼基因PPO、PAL、POD和CAT的上調(diào)表達(dá)，提高抗性酶PPO、PAL、POD和CAT的活性；ε-PL能誘導(dǎo)蘋果分泌抗菌物質(zhì)酚類化合物、類黃酮和木質(zhì)素。本研究從生理角度探討了ε-PL控制蘋果采后灰霉病的抗性誘導(dǎo)機(jī)制，但在分子層面的研究不夠深入，后續(xù)將開展 ε-PL對蘋果抗性基因表達(dá)和對 B. cinerea 侵染基因表達(dá)的影響等分子層面的研究。

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