甘薯WRKY基因家族鑒定及其響應(yīng)莖腐病侵染的表達(dá)分析

摘要：WRKY基因家族是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中起到非常重要的調(diào)控作用。通過生物信息學(xué)方法在甘薯基因組（pasi3）鑒定了84個WRKY家族基因，分布于15條染色體，編碼氨基酸數(shù)量為120～838個，等電點(diǎn)為4.89～10.74。系統(tǒng)發(fā)育樹將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ簇，其中Ⅱ簇又分為5個亞群（Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e）。保守結(jié)構(gòu)域顯示，IbWRKY基因具有高度保守的WRKYGQK基序，其中有11個基因的保守基序發(fā)生了變異。IbWRKY基因的啟動子中存在多個與生長發(fā)育、激素響應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。共線性分析結(jié)果表明，甘薯與擬南芥、番茄和馬鈴薯等雙子葉植物的WRKY基因具有相似的進(jìn)化歷程。IbWRKY基因在甘薯中具有顯著的組織特異性，且在生物、非生物脅迫和激素處理下表達(dá)差異顯著。73個IbWRKY基因參與了莖腐病脅迫響應(yīng)，其中IbWRKY20/40/6/84等4個基因與莖腐病抗性密切相關(guān)。本研究鑒定了84個甘薯WRKY基因，并明確了其家族特征、進(jìn)化和表達(dá)模式。同時，挖掘到了4個與莖腐病抗性密切相關(guān)的WRKY基因。

關(guān)鍵詞：甘薯；WRKY；莖腐??；生物信息學(xué)；表達(dá)模式

中圖分類號：S531.03；S435.311 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0025-15

收稿日期：2023-10-13

基金項(xiàng)目：國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-10）；廣東省科技計(jì)劃（編號：2023B0202010019）。

作者簡介：丁夏威（1998—），女，河南周口人，碩士，從事甘薯抗病遺傳育種。E-mail：dingxiawei0224@163.com。

通信作者：黃立飛，博士，研究員，從事甘薯抗病遺傳育種研究，E-mail：hlf157@163.com；鄒宏達(dá)，博士，副研究員，從事甘薯遺傳育種，E-mail：zouhongda@gdaas.cn。

甘薯［Ipomoea batatas（L.） Lam］屬旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬 （Ipomoea），是典型的短日照作物，具有高產(chǎn)、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、利用價值高等特點(diǎn)，是我國重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和生物質(zhì)能源作物，是世界七大糧食作物之一^［1］。在甘薯栽培中，經(jīng)常受到不同類型的生物與非生物脅迫，導(dǎo)致甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)下降，其中由達(dá)旦提狄克氏菌（Dickeya dadantii）引起的甘薯莖腐病，是一種毀滅性的細(xì)菌性病害，為我國甘薯主產(chǎn)區(qū)發(fā)病面積較大、危害較嚴(yán)重的病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時可使甘薯產(chǎn)量降低50%～100%^［2］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子（WRKY transcription factors，TFs）是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，是調(diào)控植物多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分^［3］，在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中起到非常重要的調(diào)控作用。目前，關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子在甘薯莖腐病信息傳導(dǎo)途徑中的作用知之甚少，因此，本研究依據(jù)最新公布的甘薯全基因組信息，對甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行鑒定及分析，探究其在莖腐病脅迫下的表達(dá)模式，挖掘與抗莖腐病密切相關(guān)的WRKY基因，為解析WRKY基因在甘薯莖腐病脅迫響應(yīng)信息傳導(dǎo)中的功能提供參考。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有1～2個長度為60個氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域，包括一個N端DNA結(jié)合基序WRKYGQK（分別指色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸）和1個C端鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3個進(jìn)化群：Ⅰ群包含2個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，X 為任意的氨基酸）；Ⅱ群只有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，Ⅱ群分為5個亞群（IIa-e）；Ⅲ群含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）^［4］。首個WRKY轉(zhuǎn)錄因子是從甘薯中克隆的，Ishiguro等將其命名為SWEET POTATO FACTOR 1（SPF1）^［5］。此后，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物全基因組水平上得到了廣泛的鑒定，如擬南芥有72個^［6］，黃瓜有61個^［7］，番木瓜有41個^［8］，小麥有124個^［9］，玉米有125個^［10］，番茄有81個^［11］，大豆有182個^［12］，棉花有116個^［13］。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的發(fā)育過程，包括衰老、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、種子發(fā)育萌發(fā)等^［14-18］；也參與了調(diào)控植物多種防御脅迫反應(yīng)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及病原體觸發(fā)的免疫反應(yīng)^［19-20］。例如OsWRKY6直接激活OsICS1，調(diào)控水稻對白葉枯病的防御反應(yīng)^［21］；過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子TaWRKY2增強(qiáng)了小麥的抗旱性并提高了產(chǎn)量^［22］；AtWRKY71在水楊酸（salicylic acid，SA）調(diào)節(jié)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起負(fù)調(diào)控作用^［23］；AtWRKY22對暗處理下擬南芥葉片衰老過程中起正調(diào)控作用，加速葉片的衰老^［24］；PtWRKY23基因負(fù)調(diào)控胡楊對鐵銹病菌感染的抵抗力^［25］；AtWRKY3正調(diào)控?cái)M南芥對蕓苔鏈格孢（Alternaria brassicicola）引起的黑斑病和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病的防御作用^［26-27］；PlWRKY65對JA和SA信號發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)白芍對極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）的抗性^［28］。

甘薯WRKY基因家族的鑒定雖有報(bào)道，但選用的甘薯參考基因組（ipoBat4）為初始版本^［29］，另外，關(guān)于甘薯WRKY基因家族在莖腐病脅迫下的表達(dá)及信號傳導(dǎo)中的功能未見報(bào)道。本研究利用最新發(fā)布的甘薯基因組pasi3版本，對甘薯WRKY家族成員進(jìn)行全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析，探究在莖腐病脅迫下WRKY基因家族在抗莖腐病甘薯品種中的表達(dá)模式，挖掘與抗莖腐病密切相關(guān)的WRKY基因，以期為研究WRKY基因家族在甘薯抗莖腐病的功能、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及對莖腐病抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為甘薯抗性育種提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)方法

試驗(yàn)于2023年2—6月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地進(jìn)行。甘薯品種為廣薯87（GS87）和心香（XX），均種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地，按照大田條件正常管理。菌株Ech36由黃立飛研究員提供，提取RNA試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

剪取25 cm長的甘薯健康薯苗置于無菌水中培養(yǎng)3～4 d。使用滅菌剪刀去除0.5 cm的莖末端制造新鮮傷口，使用D_{620 nm}=0.15的菌液接種后，分別培養(yǎng)0、18、30 h，分別記作T0、T18、T30。取樣為莖末端的1 cm莖段，每個處理重復(fù)3次，液氮速凍后于-80" ℃保存，備用。

1.2 甘薯WRKY基因家族的生物信息學(xué)分析

1.2.1 甘薯WRKY基因家族的鑒定、染色體定位與特征分析

在甘薯基因組數(shù)據(jù)庫Ipomoea Genome Hub（http：//sweetpotato.com/download_genome.html）中下載甘薯pasi3版本基因組文件和gff3注釋文件，通過TBtools軟件提取所有甘薯基因的CDS序列并翻譯成蛋白序列^［30］。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）下載WRKY保守蛋白結(jié)構(gòu)域（PF03106）的隱馬爾科夫（hidden markov model，HMM）模型，通過HMM模型搜索篩選甘薯基因組中的候選WRKY基因，去除不同轉(zhuǎn)錄本后，利用NBCI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）、Pfam和SMART在線網(wǎng)站（http：//smart.embl.de/smart/batch.pl）對候選WRKY基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，確定甘薯WRKY基因家族成員。結(jié)合甘薯基因組注釋信息，通過TBtools繪制已染色體定位的WRKY家族成員的染色體分布圖。利用ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）分析甘薯WRKY基因家族蛋白分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和平均疏水指數(shù)；利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測甘薯WRKY基因的亞細(xì)胞定位^［31］。

1.2.2 甘薯WRKY基因系統(tǒng)發(fā)育分析、進(jìn)化樹構(gòu)建與保守結(jié)構(gòu)域序列分析

擬南芥WRKY蛋白序列下載于TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）^［32］，利用MEGA 11.0軟件對擬南芥和甘薯的WRKY家族基因進(jìn)行多重序列比對，通過鄰接法（NJ，neighbor-joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000次，通過Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview）對進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)用ClustalW軟件對甘薯WRKY蛋白進(jìn)行多序列比對，使用ESPript 3（https：//espript.ibcp.fr/ESPript）軟件完成甘薯WRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列分析。

1.2.3 甘薯WRKY基因保守基序分析和基因結(jié)構(gòu)可視化分析

利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org）鑒定分析甘薯WRKY蛋白序列的保守基序，保守基序個數(shù)設(shè)置為10個，其余參數(shù)為默認(rèn)值。甘薯WRKY家族基因的基因結(jié)構(gòu)信息提取于甘薯pasi3基因組gff3注釋文件，并通過TBtools實(shí)現(xiàn)甘薯WRKY家族基因聚類、蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)的可視化。

1.2.4 甘薯WRKY基因啟動子順式作用元件分析

利用Perl語言腳本獲取甘薯WRKY家族基因起始密碼子上游2 000 bp的核酸序列，通過PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測甘薯WRKY基因啟動子順式作用元件，使用TBtools對其進(jìn)行可視化分析。

1.2.5 甘薯WRKY基因共線性分析

利用MCScanX軟件分析甘薯與馬鈴薯、番茄、擬南芥、水稻等物種WRKY基因家族中的片段重復(fù)基因和串聯(lián)重復(fù)基因^［33］，使用TBtools可視化各物種WRKY基因家族的共線性關(guān)系。

1.2.6 甘薯WRKY基因在不同組織、不同脅迫和激素處理下莖的表達(dá)分析

從NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載甘薯品種徐薯18的莖、葉、薯梗、薯塊、薯塊近端、薯塊遠(yuǎn)端、初始膨大的貯藏根、纖維根等7種不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及3種非生物脅迫（冷、鹽和干旱）和3種激素（ABA、SA和MeJa）處理下莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號：PRJNA511028）。利用Trimmomatic軟件去除接頭和低質(zhì)量的序列^［34］，然后用hisat2比對到甘薯pasi3版本基因組^［35］，接著采用featureCounts計(jì)算甘薯WRKY基因的FPKM值^［36］，并通過R語言腳本轉(zhuǎn)換為TPM值，最后利用TBtools進(jìn)行表達(dá)熱圖分析。

1.3 甘薯WRKY基因家族在莖腐病菌脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析

1.3.1 甘薯WRKY基因在莖腐病菌侵染下的表達(dá)模式分析

基于前期課題組獲得的抗甘薯莖腐病品種廣薯87（GS87）和感病品種心香（XX）接種莖腐病菌后不同時間（0、18、30 h）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未公開），分析甘薯WRKY基因家族在甘薯應(yīng)答莖腐病菌侵染過程中的表達(dá)模式。轉(zhuǎn)錄組分析同“1.2.6”節(jié)，根據(jù)log₂（FoldChange）值≥1和FDR值lt;0.05篩選差異表達(dá)的IbWRKY基因，使用TBtools繪制表達(dá)熱圖。

1.3.2 甘薯WRKY基因的qRT-PCR 驗(yàn)證分析

使用植物RNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）提取樣本的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性，超微量分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度。使用HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR Sample 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，稀釋10倍后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以甘薯WRKY基因的CDS序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，內(nèi)參基因使用甘薯Actin（表1）。使用Bio-Rad CFX96（美國伯樂公司）熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量試驗(yàn)。試劑選用SYBR（瑞士羅氏公司），按照其說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，利用2^-ΔΔC_T方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007進(jìn)行qRT-PCR數(shù)據(jù)整理，利用GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯WRKY家族基因的鑒定、染色體定位與特征分析

共檢測到84個含有完整WRKY結(jié)構(gòu)域的甘薯WRKY基因，不均勻地分布在甘薯的15條單倍型染色體上，根據(jù)基因組注釋信息，依次命名為IbWRKY1～I(xiàn)bWRKY84（圖1）。IbWRKY主要分布在1號染色體和9號染色體，分別為10個和9個基因，占比分別為11.90%、10.71%。2、5、7號染色體各分布6個，13、14號染色體各分布7個，11、15號染色體各分布8個，4號染色體分布4個，3和8號染色體各分布3個，6、10、12號染色體各分布2個。IbWRKY編碼蛋白的大小和氨基酸數(shù)量有較大差異。IbWRKY基因家族蛋白序列的氨基酸數(shù)量為120～838個，分子量為13.19～90.73 ku，等電點(diǎn)為4.89～10.74，其中IbWRKY84編碼的蛋白最短，只有120個氨基酸，IbWRKY36編碼的蛋白最長，有838個氨基酸。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，有73個IbWRKY位于細(xì)胞核內(nèi)，11個IbWRKY位于細(xì)胞質(zhì)（表2）。

2.2 IbWRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育與多序列比對分析

利用72個擬南芥WRKY基因家族蛋白序列作為參考，構(gòu)建IbWRKY基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示，IbWRKY基因家族與AtWRKY基因家族分類基本一致，可分為Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群，Ⅱ群又進(jìn)一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e 5個亞群，Ⅰ群有13個成員（占比15.5%），Ⅱ群成員最多，有58個成員（占比69.0%），Ⅲ群有10個成員（占比11.9%）。值得注意的是，IbWRKY3/22/27等3個基因不屬于已知的3個進(jìn)化群，其中IbWRKY3和IbWRKY22成一簇，IbWRKY27則獨(dú)立分支。利用ClustalW軟件分析IbWRKY蛋白結(jié)構(gòu)域特征，結(jié)果表明IbWRKY基因家族的核心序列中含有保守的WRKYGQK七肽基序，但是存在不同類型氨基酸的替代與缺失，其中IbWRKY3保守基序中的谷氨酰胺（Q）變成蘇氨酸（T），IbWRKY7/8/9/10/22/76/80/81保守基序的谷氨酰胺（Q）變成賴氨酸（K）；此外，12個IbWRKY蛋白序列的鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生了缺失（圖2、圖3）。

2.3 IbWRKY基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

利用MEME軟件結(jié)合TBtools進(jìn)行WRKY家族基因聚類、蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)的可視化分析（圖4）。IbWRKY家族成員的Motif數(shù)量為2～7不等。84個IbWRKY基因結(jié)構(gòu)域都具有Motif1，表明Motif1是IbWRKY基因家族的最保守的核心基序。Motif10是最長的基序，包含46個氨基酸，而Motif9是最短的基序，僅有6個氨基酸（表3）。同群或親緣較近的IbWRKY家族成員具有相似的保守結(jié)構(gòu)，如Ⅱ群中的Ⅱ-e和Ⅱ-d亞群都具有Motif1、Motif9和Motif2。IbWRKY3/22/84僅包含1個外顯子，其他IbWRKY基因的外顯子數(shù)分布在2～12個。同一亞家族基因編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)和組成上高度相似，Ⅰ群的外顯子數(shù)量為5～12個，Ⅲ群中外顯子數(shù)量均為3個，Ⅱ-b亞群外顯子數(shù)量為4～6個。

2.4 IbWRKY基因啟動子順式作用元件分析

除去轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的核心啟動子區(qū)域的 TATA-box、CAAT-box外，IbWRKY順式作用元件可分為3類：激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和生長發(fā)育調(diào)節(jié)元件（圖5）。激素響應(yīng)元件包括生長素IAA（TGA-element，TGA-box，AuxRR-core，AuxRE）、脫落酸ABA（ABRE）、赤霉素GA（TATC-box，GARE-motif，P-box）、茉莉酸甲酯MeJa（CGTCA-motif，TGACG-motif）和水楊酸SA（TCA-element）。脅迫響應(yīng)元件包括干旱誘導(dǎo)（MBS）、傷口反應(yīng)（WUN-motif）、厭氧誘導(dǎo)（ARE、GC-motif）、防御與應(yīng)激響應(yīng)（TC-rich repeats）和低溫響應(yīng)（LTR）。生長發(fā)育調(diào)節(jié)元件包括種子特異性調(diào)控（RY-element）、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控（02-site）、分生組織表達(dá)（CAT-box）和胚乳表達(dá)（GCN4_motif）。有些IbWRKY基因包含多個順式作用元件，例如：IbWRKY39/56有多個干旱和低溫響應(yīng)元件（MBS，LTR），IbWRKY16/35/67有多個MeJa（CGTCA-motif，TGACG-motif）和SA（TCA-element）激素響應(yīng)元件，可與多種逆境相關(guān)的反式作用因子結(jié)合調(diào)控甘薯抗逆基因的表達(dá)。

2.5 IbWRKY基因共線性分析

共線性分析共檢測到8組，涉及了15個WRKY基因的片段復(fù)制事件，分別為IbWRKY6/36、IbWRKY11/18、IbWRKY29/32、IbWRKY41/75、IbWRKY42/74、IbWRKY50/53、IbWRKY50/77、IbWRKY53/77（圖6-A），可見IbWRKY基因的進(jìn)化主要由片段復(fù)制事件驅(qū)動。如圖6-B所示，甘薯12個WRKY基因與擬南芥15個WRKY基因存在11種共線性關(guān)系，甘薯34個和31個WRKY基因分別與馬鈴薯、番茄存在39種和34種共線性關(guān)系，而與單子葉植物水稻之間沒有發(fā)現(xiàn)同源基因?qū)Γ夜簿€性較差。除此之外，IbWRKY4/16/20/40/51/55和其他3種雙子葉植物都存在著共線性（圖6-C）。

2.6 IbWRKY基因在不同甘薯組織，以及冷、熱、鹽與激素脅迫下的表達(dá)分析

84個IbWRKY中有20個基因在7種組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)，其他64個IbWRKY基因至少在一種組織中表達(dá)（圖7）。IbWRKY16/50基因在莖組織中特異性表達(dá)，且表達(dá)量高于其他組織，IbWRKY5/18/40/5/62在根和莖組織中均高表達(dá)，這些基因可能是根和莖組織生長發(fā)育所必需的。12個IbWRKY基因在6種脅迫下表達(dá)量極低或不表達(dá)，其他72個IbWRKY基因在至少1種脅迫中表達(dá)。干旱和鹽脅迫下，WRKY基因的差異表達(dá)不顯著，但在冷脅迫下有6個差異表達(dá)基因，其中IbWRKY6/18/30/42上調(diào)，IbWRKY45/61下調(diào)（表4）。除此之外，ABA處理的莖有9個IbWRKY差異表達(dá)基因（7個上調(diào)，2個下調(diào)），SA處理的莖有8個IbWRKY差異表達(dá)基因（7個下調(diào)，1個上調(diào)），而MeJa處理的莖有14個差異表達(dá)基因（11個下調(diào)，3個上調(diào)），可見WRKY基因在甘薯莖的冷脅迫下發(fā)揮著重要作用。

2.7 甘薯WRKY基因家族在莖腐病菌侵染下的表達(dá)模式分析

去除表達(dá)量介于0～1之間的基因，繪制了73個IbWRKY基因表達(dá)熱圖（圖8）。莖腐病菌脅迫下的WRKY基因表達(dá)呈現(xiàn)以下特征：IbWRKY16/18/21/27/30/40/42/53/62基因初期表達(dá)量高，但隨著侵染時間的延長表達(dá)量逐漸降低，并且在抗病品種中表達(dá)量高于感病品種；IbWRKY59/63基因隨著侵染時間的延長表達(dá)量都逐漸增加，并且在抗病品種中的表達(dá)量高于感病品種；IbWRKY48/58/77在接種早期高表達(dá)，而在18 h和30 h則不表達(dá)；部分WRKY基因接種前后表達(dá)無變化。

以接種0 h為對照組（T0-GS87、T0-XX），分析抗病品種廣薯87和感病品種心香在18 h、30 h處理下的IbWRKY差異表達(dá)基因。如圖9-A所示，接種18 h后，廣薯87差異表達(dá)IbWRKY基因有46個（19個上調(diào)，27個下調(diào)），心香差異表達(dá)IbWRKY基因有40個（19個上調(diào)， 21個下調(diào)）。接種30 h后，廣薯87差異表達(dá)IbWRKY基因有45個（17個上調(diào)，28個下調(diào)），心香差異表達(dá)IbWRKY基因有40個（18個上調(diào)，22個下調(diào)）。因此受莖腐病菌侵染， 抗性品種廣薯87在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)動更多的差異表達(dá)IbWRKY基因響應(yīng)侵染。對甘薯2個品種接種莖腐病菌后的差異表達(dá)IbWRKY基因進(jìn)行Venn圖分析（圖9-B），接種18 h后抗性品種廣薯87中的IbWRKY基因數(shù)目為46個，其中6個為廣薯87特異表達(dá)基因；感病品種心香有40個IbWRKY基因，其中5個是心香特異表達(dá)基因。在接種后30 h后，廣薯87的IbWRKY基因減少1個，而心香未發(fā)生改變，其中10個為廣薯87特異表達(dá)基因，4個為心香特異表達(dá)基因，共有基因25個。由此可見，同一品種特異差異表達(dá)基因和2個品種間共同的差異表達(dá)基因可能是導(dǎo)致2個品種對莖腐病菌侵染后抗性差異的原因。

為了進(jìn)一步分析抗感品種之間的差異表達(dá)基因，以感病品種心香0、18、30 h 3種處理作為對照，與抗病品種廣薯87對應(yīng)的處理進(jìn)行比較，獲得3個比較組（T0-XX _vs _T0-GS87，T18-XX_ vs _T18-GS87，T30-XX_ vs _T30-GS87）的差異表達(dá)基因韋恩圖（圖9-C），差異表達(dá)基因隨著接種時間的延長而增加，接種30 h的特異表達(dá)基因高于0 h和18 h，其中有6個（IbWRKY6/9/16/20/40/84）基因在3個時間點(diǎn)共有。上調(diào)基因數(shù)量隨著接種時間延長先降低再增加，而下調(diào)基因則一直增加，共同差異表達(dá)上調(diào)基因IbWRKY20/40，差異表達(dá)上調(diào)基因?yàn)镮bWRKY6/84（圖9-D、圖9-E）。受莖腐病菌侵染，2個品種之間的IbWRKY基因在不同的時間點(diǎn)表達(dá)明顯不同。

2.8 甘薯WRKY基因的qRT-PCR 驗(yàn)證分析

共同差異表達(dá)上調(diào)基因IbWRKY20/40在抗病品種上調(diào)表達(dá)，在感病品種下調(diào)表達(dá)；共同差異表達(dá)下調(diào)基因IbWRKY6/84在抗病品種下調(diào)表達(dá)，感病品種上調(diào)表達(dá)。對4個IbWRKY基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證分析見圖10，IbWRKY20/40在抗病品種上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量高于感病品種；而IbWRKY6/84在抗病品種下調(diào)表達(dá)，感病品種上調(diào)表達(dá)，4個基因的表達(dá)特征與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相一致。因此，IbWRKY20/40/6/84基因在甘薯響應(yīng)莖腐病菌的侵染過程發(fā)揮重要作用。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子通過自我調(diào)節(jié)和調(diào)控下游靶基因表達(dá)，在植物生長和對非生物脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用^［37-38］。植物中WRKY基因家族數(shù)量龐大，目前167種植物的WRKY基因家族已被鑒定，其中已報(bào)道的單子葉植物玉米125個、水稻103個^［39］、香蕉164個^［40］；雙子葉植物擬南芥中有72個，番茄有81個等。畢楚韻等利用甘薯基因組版本（ipoBat4）鑒定出82個WRKY基因，其中12號、14號染色體分布WRKY基因最多，平均為11個^［29］。杜泰峰等在甘薯二倍體近緣野生種Ipomoea trifda鑒定出82個itfWRKY基因^［41］。本研究基于最新發(fā)布的甘薯基因組（pasi3）版本中共鑒定了84個IbWRKY成員，比先前版本報(bào)告多了2個WRKY基因，并發(fā)現(xiàn)1號和9號染色體上WRKY基因數(shù)量最多，獲得了更加準(zhǔn)確的甘薯WRKY基因家族信息。

鑒定的84個IbWRKY基因都包含WRKY保守結(jié)構(gòu)域，其中11個IbWRKY高度保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生了變異，10個從WRKYGQK變異為WRKYGKK，1個從WRKYGQK變異為WRKYGTK。在單子葉植物水稻中，部分OsWRKY蛋白的氨基酸序列發(fā)生變異，突變?yōu)閃RRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY^［42］。在雙子葉植物大豆中，發(fā)現(xiàn)GmWRKY6和GmWRKY21含有WRKYGKK基序，但是不能與W-box 結(jié)合^［43］。煙草中NtWRKY12具有WRKYGQK基序，可以特異性結(jié)合序列 TTTTCCAC，而不是正常的W-box ^［44］。因此，推測WRKYGQK基序的變異可能導(dǎo)致與W-box的結(jié)合能力顯著降低甚至完全喪失，或者它可以與其他新基序結(jié)合并產(chǎn)生新功能。

在擬南芥和花生中，WRKY基因擴(kuò)增主要通過串聯(lián)復(fù)制發(fā)生^［45-46］。而在本研究中有8對基因在甘薯WRKY基因家族發(fā)生片段重復(fù)。甘薯與擬南芥、馬鈴薯、番茄等3個雙子葉植物分別有15對、39對、34對同源基因?qū)?，而與單子葉植物的水稻沒有同源基因?qū)?，表明這些同源基因?qū)赡苁窃陔p子葉和單子葉植物分化后形成的。WRKY家族各成員的保守基序數(shù)量和種類不同，但同一亞族蛋白質(zhì)成員的保守基序和種類大致相同，具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。Motif1是IbWRKY基因家族的核心保守結(jié)構(gòu)域。深入分析內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)特征是基因家族進(jìn)化過程中的關(guān)鍵步驟^［47］。IbWRKY基因家族不同進(jìn)化群具有不同數(shù)量的外顯子，其中Ⅱ群成員外顯子數(shù)量較多，表明在進(jìn)化過程中，Ⅱ群WRKY基因的分子結(jié)構(gòu)保守，有利于蛋白質(zhì)多樣性引起的進(jìn)化^［48］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過與下游基因中相應(yīng)的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)控目的基因在特定時空的表達(dá)，參與多種代謝途徑和脅迫響應(yīng)過程，從而增強(qiáng)植物對環(huán)境的適應(yīng)性^［49］。例如棉花GhWRKY25過度表達(dá)降低了對干旱的耐受性并增加了耐鹽性^［50］，VbWRKY32正向調(diào)節(jié)冷反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而維持膜穩(wěn)定性并提高馬鞭草在冷脅迫下的生存能力 ^［51］。本研究甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的上游發(fā)現(xiàn)了豐富的順式作用元件，這些元件可與脫落酸、茉莉酸、水楊酸、干旱、低溫等脅迫有關(guān)的作用因子結(jié)合，調(diào)控甘薯抗逆基因的表達(dá)和響應(yīng)。大部分IbWRKY基因在干旱、冷、鹽脅迫下表達(dá)，尤其在冷脅迫下，4個IbWRKY差異表達(dá)基因正向調(diào)控甘薯對冷脅迫的誘導(dǎo)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的功能通常與防御相關(guān)的植物激素有關(guān)。ABA可以通過減弱OsWRKY5對其下游基因OsMYB2的抑制來提高耐旱性^［52］ 。AtWRKY39通過協(xié)同參與SA和JA信號通路來響應(yīng)高溫^［53］。在ABA、SA、MeJa 3種激素處理下，IbWRKY18/30/40/45等4個差異表達(dá)基因下調(diào)，只有IbWRKY17上調(diào)表達(dá)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長過程中具有免疫調(diào)控的功能，而這種免疫調(diào)控功能既可以正向調(diào)控也可以反向調(diào)控^［54］。擬南芥AtWRKY25在水楊酸介導(dǎo)的紫丁香假單胞菌（P. syringae）防御反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用^［55］。辣椒CaWRKY58受青枯病菌誘導(dǎo)后下調(diào)表達(dá)，而CaWRKY6和CaWRKY40則在抗青枯病菌中起正調(diào)控作用^［56-57］。本研究抗感莖腐病品種下調(diào)基因數(shù)量均多于上調(diào)基因，且在接種初期，抗病品種的基因表達(dá)量要高于感病品種，此外IbWRKY20和IbWRKY40在抗病品種表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)量高于感病品種，而IbWRKY6、IbWRKY84卻表達(dá)下調(diào)，在感病品種表達(dá)量高于抗病品種。據(jù)報(bào)道IbWRKY6、IbWRKY20和IbWRKY40的同源基因AtWRKY4、AtWRKY48和AtWRKY40在擬南芥響應(yīng)細(xì)菌病原體丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）抗性過程中起負(fù)調(diào)控作用^［58-60］。過表達(dá)IbWRKY84的同源基因AtWRKY75，作為GA介導(dǎo)的信號通路的新組成部分，積極調(diào)節(jié)擬南芥開花^［61］。通過qRT-PCR試驗(yàn)，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。因此，這些差異表達(dá)基因可能參與甘薯的抗病反應(yīng)過程。

綜上所述，本研究基于甘薯基因組pasi3版本鑒定分析了WRKY基因家族，鑒定了84個IbWRKY基因，全部位于15條染色體上。IbWRKY基因分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中Ⅱ群又分為5個亞群。啟動子順式作用元件預(yù)測，IbWRKY基因參與甘薯的生長發(fā)育、激素響應(yīng)與逆境脅迫響應(yīng)過程。初步挖掘到IbWRKY20、IbWRKY40、IbWRKY6和IbWRKY84等4個基因與抗莖腐病密切相關(guān)，為WRKY基因克隆、功能分析以及在莖腐病抗病過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式研究提供基礎(chǔ)。

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