中華絨螯蟹在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組SNP位點(diǎn)識(shí)別及其功能分析

摘要：為深入探究低溫環(huán)境對(duì)中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）轉(zhuǎn)錄組的影響，特別關(guān)注SNP標(biāo)記位點(diǎn)及其關(guān)聯(lián)基因SNP-Unigene在低溫脅迫條件下的作用。選擇在低溫環(huán)境和原產(chǎn)地條件下飼養(yǎng)的中華絨螯蟹作為研究對(duì)象，利用Illumina平臺(tái)對(duì)其肝胰腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。使用SOAPsnp軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)，并對(duì)這些SNP-Unigene進(jìn)行GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)及功能注釋。結(jié)果表明，在中華絨螯蟹中共發(fā)現(xiàn)了429 684個(gè)SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分散在22 249條SNP-Unigene上。SNP 位點(diǎn)的突變類型有 12 種，其中轉(zhuǎn)換SNP位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于顛換SNP位點(diǎn)，而其中又以C-T類型的突變數(shù)量最為顯著。功能分析結(jié)果顯示，在低溫脅迫下，中華絨螯蟹的SNP-Unigene主要涉及細(xì)胞活動(dòng)、代謝途徑和信號(hào)傳遞等關(guān)鍵生物學(xué)過程，尤其是與能量代謝相關(guān)的路徑。進(jìn)一步研究篩選出了599條SNP-Unigene被注釋到了磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路等26條與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路中，以及315條SNP-Unigene被注釋到了趨化因子信號(hào)通路等22條與免疫相關(guān)的通路中。本研究為未來深入探討中華絨螯蟹在低溫脅迫條件下的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)和基礎(chǔ)材料。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；單核苷酸多態(tài)性；功能分析

中圖分類號(hào)：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）21-0197-07

收稿日期：2024-05-27

基金項(xiàng)目：貴州省教育廳科技拔尖人才項(xiàng)目（編號(hào)：黔教技［2022］096）；畢節(jié)市揭榜掛帥項(xiàng)目（編號(hào)：畢科合重大專項(xiàng)字［2021］1）；畢節(jié)市科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（編號(hào)：畢科聯(lián)合字［2023］48）。

作者簡(jiǎn)介：李 青（1989—），女，山西臨汾人，博士，副教授，研究方向?yàn)樗飳W(xué)。E-mail：liqingdream@163.com。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），別稱河蟹，是我國(guó)一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)品種。隨著消費(fèi)市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，中華絨螯蟹的養(yǎng)殖區(qū)域已經(jīng)從傳統(tǒng)的江浙地區(qū)逐漸擴(kuò)展到全國(guó)范圍，包括云南、貴州、河北等地^［1］。然而，作為變溫動(dòng)物，水溫對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、抗病能力、攝食和蛻殼等生理過程具有顯著影響。研究表明，中華絨螯蟹在不同水溫下的攝食行為差異明顯。在5～10 ℃的低溫環(huán)境中，蟹幾乎不進(jìn)食；在20～26 ℃時(shí)，其攝食量達(dá)到最高水平；而當(dāng)水溫超過35 ℃時(shí)，蟹的攝食活動(dòng)幾乎停止。水溫也對(duì)其蛻殼和生長(zhǎng)過程產(chǎn)生重要影響，通常在19～25 ℃的適宜溫度下，中華絨螯蟹能夠正常蛻殼和生長(zhǎng)，但在低于10 ℃或高于30 ℃的條件下，生長(zhǎng)和蛻殼會(huì)受到抑制。此外，劇烈的水溫變化同樣會(huì)影響其生長(zhǎng)，尤其對(duì)幼蟹的影響更加顯著^［2-4］。盡管已有許多研究探討了水溫對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)及發(fā)育的影響，但低溫脅迫對(duì)其生理生化機(jī)制的具體作用仍不明確。因此，深入研究低溫脅迫如何影響中華絨螯蟹的生理生化反應(yīng)，特別是其生長(zhǎng)、發(fā)育與適應(yīng)能力，將有助于優(yōu)化養(yǎng)殖管理，提高養(yǎng)殖效益。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡(jiǎn)稱SNP）是指基因組中因單個(gè)核苷酸的變化而導(dǎo)致的DNA序列變異，主要包括堿基的顛換和轉(zhuǎn)換。SNP具有數(shù)量眾多、分布廣泛和遺傳穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，是最常見的可遺傳變異形式，也是生物進(jìn)化的重要途徑^［5-7］。相較于其他分子標(biāo)記技術(shù)，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR），SNP標(biāo)記法因其檢測(cè)自動(dòng)化、成本低廉和高效性等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源評(píng)估、遺傳圖譜的建立、基因定位、遺傳育種以及人類疾病預(yù)防等多個(gè)研究領(lǐng)域^［8-12］。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在篩選和識(shí)別特定性狀SNP位點(diǎn)方面逐漸成為有效工具^［5］。目前，已有多項(xiàng)研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選SNP位點(diǎn)，涉及多個(gè)經(jīng)濟(jì)甲殼類，如凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、方斑東風(fēng)螺（Babylonia areolata）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）等^［13-17］。然而，關(guān)于中華絨螯蟹的相關(guān)研究尚顯不足，現(xiàn)有文獻(xiàn)僅涉及MIH基因SNP多態(tài)性及其與性早熟的關(guān)系，以及與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)篩選等方面^［18-19］。至于中華絨螯蟹在低溫脅迫下的SNP位點(diǎn)挖掘和功能注釋，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究以不同水溫條件下養(yǎng)殖的中華絨螯蟹肝胰腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出大量SNP位點(diǎn)，并通過功能注釋和通路分析探討這些SNP位點(diǎn)所在基因的潛在功能。以期為中華絨螯蟹適應(yīng)低溫環(huán)境及相關(guān)性狀的分子標(biāo)記開發(fā)提供基礎(chǔ)，為未來研究中華絨螯蟹響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制和耐低溫品系的遺傳選育提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022年10月，分別從貴州省畢節(jié)市（27.15°N，104.94°E；年平均氣溫約為12.5 ℃，平均海拔約為1 600 m）和江蘇省蘇州陽澄湖（31.38°N，120.98°E；年平均氣溫約為18 ℃，平均海拔約2 m）的養(yǎng)殖基地采集了正常發(fā)育并性成熟的二齡雌性中華絨螯蟹。這些樣本被分為低溫處理組（TL）和對(duì)照組（TC），每組各有15只。測(cè)量雌蟹的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，并采集其肝胰腺組織，隨后將樣品迅速冷凍于液氮中，并儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中以備轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析使用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

試驗(yàn)樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先，使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA的完整性。接著，利用附有多聚T寡核苷酸的磁珠從總RNA中提取mRNA。每組構(gòu)建3個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，文庫(kù)的RNA樣本由5只雌蟹的肝胰腺RNA等量混合而成，隨后進(jìn)行Illumina測(cè)序以獲得原始讀取數(shù)據(jù)（raw reads）。在去除含接頭序列和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，獲得讀取數(shù)據(jù)（clean reads）。最后，使用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，得到轉(zhuǎn)錄本序列。

1.3 SNP位點(diǎn)檢測(cè)及其所在Unigene 的注釋與功能分析

使用SAMtools和picard-tools對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序，并去除重復(fù)的reads。通過SAMtools/BCFtools進(jìn)行SNP Calling，對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點(diǎn)分析；統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)的數(shù)量及其分布情況。通過諾禾生物云平臺(tái)（https：//magic.novogene.com/customer/main#/homeNew）提供的生物信息學(xué)工具，將SNP位點(diǎn)的基因序列與GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以獲得SNP-Unigene序列的功能注釋，并進(jìn)一步篩選出與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫相關(guān)的KEGG通路^［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)分析

使用SOAPsnp軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析（表1），共識(shí)別出429 684個(gè)SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分布在22 249條Unigene中。其中，TL組識(shí)別到 224 565 個(gè)SNP位點(diǎn)，而TC組則發(fā)現(xiàn)了205 119個(gè)SNP位點(diǎn)。在所有識(shí)別的SNP中，有218 713個(gè)被歸類為純合SNP，TL組中有115 606個(gè)純合SNP，而TC組則包含103 107個(gè)純合SNP。

根據(jù)Unigene中SNP位點(diǎn)的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1），在TC、TL組中，含有超過10個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene數(shù)量均超過總數(shù)的一半以上，分別占到總數(shù)的52.55%、52.80%，其次為2～10個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene，分別有4 323、4 674條，分別占總數(shù)的40.48%、40.40%；而含有單個(gè)SNP位點(diǎn)的Unigene數(shù)量均最少，分別為744、786條，分別占總數(shù)的6.97%、6.20%。

對(duì)SNP位點(diǎn)突變類型的分析結(jié)果（圖2）表明，在TC組中，顛換位點(diǎn)有64 735個(gè)，占總SNP位點(diǎn)的31.56%；而轉(zhuǎn)換位點(diǎn)則有140 384個(gè)，占68.44%。在TL組中，顛換位點(diǎn)為72 161個(gè)，占32.13%；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為152 404個(gè)，占67.87%。在12種核苷酸變異類型中，T-A發(fā)生顛換的比例最高，分別占SNP位點(diǎn)總數(shù)的18.52%（TC組11 987個(gè)）和17.37%（TL組12 537個(gè)）；而C-T的轉(zhuǎn)換比例最高，分別占SNP位點(diǎn)總數(shù)的29.55%（TC組41 485個(gè)）和29.76%（TL組45 360個(gè)）。

2.2 SNP-Unigene 的注釋與功能

與GO數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果（圖3）表明，共計(jì)4 736條SNP-Unigene與GO條目相匹配，涵蓋生物過程（biological process，BP）（74.41%）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）（13.98%）以及分子功能（molecular function，MF）（11.61%）這3個(gè)主要功能類別的34個(gè)亞類。在生物過程的分類中，涉及細(xì)胞過程和代謝過程的SNP-Unigene數(shù)量最多；在細(xì)胞組分中，參與細(xì)胞解剖實(shí)體和胞內(nèi)區(qū)的SNP-Unigene數(shù)量較高；而在分子功能方面，涉及結(jié)合和催化活性的SNP-Unigene數(shù)量最為豐富。

與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果顯示，共有2 532條SNP-Unigene成功匹配到KOG注釋信息，并根據(jù)功能分為26類。其中，功能預(yù)測(cè)類占比最高，包含360條SNP-Unigene，占被注釋總數(shù)的14.22%；其次是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，涉及292條SNP-Unigene，占比11.53%；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)伴侶基因則位列第三，包含235條SNP-Unigene，占比9.28%（圖4）。

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果顯示，共有263條SNP-Unigene參與了環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)、遺傳信息處理和代謝這五大類生化途徑（圖5）。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的SNP-Unigene數(shù)量最多，共有32條；其次是免疫系統(tǒng)相關(guān)的SNP-Unigene，有22條；內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的SNP-Unigene則排在第3位，數(shù)量為16條。

2.3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的SNP-Unigene富集及特異SNP位點(diǎn)

由表2可知，通過對(duì)KEGG信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，共有599條SNP-Unigene被注釋到26條與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路中。其中， 注釋到PI3K-Akt信號(hào)通路的SNP-Unigene數(shù)量最多，達(dá)50條；其次是MAPK信號(hào)通路，包含38條SNP-Unigene；Ras信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路各有37條SNP-Unigene。

2.4 免疫系統(tǒng)相關(guān)的SNP-Unigene富集及特異SNP位點(diǎn)

由表3可知，通過KEGG信號(hào)通路的富集分析，共有315條SNP-Unigene被注釋到22條與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路中。其中，Chemokine信號(hào)通路注釋的SNP-Unigene數(shù)量最多，達(dá)到33條，其次是NOD-like受體信號(hào)通路，有26條；Toll和Imd信號(hào)通路有24條，而Fc gamma R介導(dǎo)的吞噬作用則有21條。

3 討論

3.1 SNP位點(diǎn)特征分析

SNP標(biāo)記作為一種先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)，因其具有更高的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用潛力和前景。相比于許多魚類和貝類，甲殼類動(dòng)物由于其染色體數(shù)量較多^［20-21］，給SNP標(biāo)記的開發(fā)帶來了一定的挑戰(zhàn)。然而，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有效地克服了這些困難，為甲殼類動(dòng)物的SNP標(biāo)記開發(fā)提供了重要的支持。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，從中華絨螯蟹的TL和TC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出分布于22 249條SNP-Unigene序列上的429 684個(gè)SNP位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換型SNP位點(diǎn)占67.87%，這一結(jié)果與在方斑東風(fēng)螺和軍曹魚等物種上的研究^［5-8］相似。SNP堿基替換是推動(dòng)基因突變及生物進(jìn)化的重要因素^［7］，主要包括顛換（如A-T、C-G、A-C、T-G的相互置換）和轉(zhuǎn)換（如A-G和T-C的相互置換）2種類型。理論上，SNP中轉(zhuǎn)換與顛換的比例應(yīng)為1∶2，當(dāng)轉(zhuǎn)換與顛換的比例超過0.5時(shí)，稱為“轉(zhuǎn)換偏差”^［22］。在本研究中，TL和TC轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)換與顛換的SNP數(shù)量比值分別為2.11和2.17，表明轉(zhuǎn)換的比例顯著高于顛換，符合“轉(zhuǎn)換偏差”的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象同樣在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）、軍曹魚（Rachycentron canadum）和大口黑鱸（Micropterus salmoides）等水產(chǎn)動(dòng)物中得到證實(shí)^{［5，16-17，23-24］}， 表明SNP位點(diǎn)的堿基突變并非隨機(jī)生成，可能與不同物種的生物堿基組成及其在進(jìn)化過程中所承受的環(huán)境壓力和選擇機(jī)制有關(guān)^［24］。在自然選擇的過程中，轉(zhuǎn)換突變一般導(dǎo)致同義突變，這也解釋了為何SNP轉(zhuǎn)換類型在蛋白編碼序列中數(shù)量多于顛換類型^［25］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)C-T轉(zhuǎn)換在12種核苷酸變異類型中占比最高，這一結(jié)果與大多數(shù)物種的研究一致，可能是由于CpG二核苷酸中5-甲基胞嘧啶容易發(fā)生脫氨基反應(yīng)，從而導(dǎo)致堿基C變?yōu)閴A基T^［26］。

3.2 中華絨螯蟹對(duì)低溫的適應(yīng)性

水溫對(duì)水生生物的適應(yīng)性機(jī)制具有重要影響，不同水域的溫度和壓力差異會(huì)促使水生動(dòng)物形成本地適應(yīng)性^［27］。例如，俞夢(mèng)超研究發(fā)現(xiàn)，不同海拔梯度下的裂腹魚類在低溫適應(yīng)機(jī)制上存在差異^［28］；羅慧等則指出，青海湖裸鯉在不同環(huán)境中形成了適應(yīng)不同水溫的特征^［6］。本研究結(jié)果表明，低溫處理組與對(duì)照組的SNP數(shù)量和位置并不完全相同，顯示中華絨螯蟹在低溫環(huán)境下發(fā)生了SNP位點(diǎn)的變異，可能形成了與低溫環(huán)境相適應(yīng)的本地適應(yīng)性及分子機(jī)制。在對(duì)中華絨螯蟹的SNP-Unigene進(jìn)行功能注釋時(shí)，結(jié)果顯示在22 249條SNP-Unigene中，分別有 4 736、2 532、263條分別被注釋到GO、COG及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。這些SNP-Unigene大多數(shù)參與了細(xì)胞過程、代謝過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制，尤其是與能量代謝相關(guān)的通路，這些基因在中華絨螯蟹適應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。作為變溫動(dòng)物，中華絨螯蟹可能通過體內(nèi)的多種酶和代謝模式來應(yīng)對(duì)低溫脅迫，利用儲(chǔ)存的能量以適應(yīng)環(huán)境變化，因此能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)運(yùn)顯得尤為重要。KEGG信號(hào)通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）、糖代謝（carbohydrate metabolism）、聚糖生物合成與代謝（glycan biosynthesis and metabolism），以及氨基酸代謝（amino acid metabolism）等4條主要代謝通路均與能量代謝相關(guān)，且會(huì)影響中華絨螯蟹的生長(zhǎng)和免疫過程。為了深入研究中華絨螯蟹的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫防御機(jī)制，本研究篩選出了599條與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的SNP-Unigene，主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路等重要通路。同時(shí)，篩選出315條與免疫防御相關(guān)的SNP-Unigene，這些基因大部分被注釋到趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll和Imd信號(hào)通路以及Fc gamma R介導(dǎo)的吞噬作用等免疫信號(hào)通路中。這些篩選到的SNP-Unigene及其相關(guān)通路可能與中華絨螯蟹對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)，為深入研究其適應(yīng)低溫環(huán)境的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究基于低溫脅迫下中華絨螯蟹肝胰腺的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定出了429 684個(gè)SNP位點(diǎn)。通過對(duì)22 249條SNP-Unigene的序列比對(duì)與功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)。其中，599條和315條SNP-Unigene分別被注釋到與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫防御相關(guān)的重要信號(hào)通路中。這些與低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)的SNP-Unigene及其通路可能直接影響中華絨螯蟹對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力。這一研究為深入探討中華絨螯蟹在低溫脅迫下的分子機(jī)制提供了重要的理論支持和基礎(chǔ)材料。

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