黔中金蕎麥醇提物對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)、免疫指標(biāo)、腹瀉及腸道菌群的影響

摘要：為探究黔中金蕎麥醇提物的飼喂效果，選擇36頭28日齡巴克夏×可樂豬二元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為A50組（基礎(chǔ)日糧）和B50組（基礎(chǔ)日糧+1.5%黔中金蕎麥提取物），飼喂53 d后測定相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行Illumina NovaSeq測序。結(jié)果顯示，與A50組相比，B50組斷奶仔豬尿素氮（UREA）顯著降低（Plt;0.05），免疫球蛋白A（IgA）極顯著增加15.51%（Plt;0.01），白細(xì)胞介素6（IL-6）極顯著降低8.61%（Plt;0.01），腹瀉指數(shù)顯著降低（Plt;0.05）。細(xì)菌水平上，B50組厚壁菌門相較于A50組相對豐度增加，擬桿菌門、變形桿菌門和螺旋體門相對豐度降低，A50組密螺旋體屬（Treponema）、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）和普雷沃菌科_NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31）相較于B50組分別增加了21.30%、50.92%和50.41%；B50組乳桿菌屬（Lactobacillus）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）相較于A50組分別增加了298.34%和32.61%；真菌水平上，A50組新美鞭菌門為最優(yōu)菌門（52.78%），B50組子囊菌門為最優(yōu)菌門（48.53%）。由此可見，在飼料中添加黔中金蕎麥醇提取物可增強(qiáng)斷奶仔豬免疫功能，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群多樣性，減少腹瀉的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：金蕎麥；提取物；斷奶仔豬；免疫；腹瀉；腸道菌群

中圖分類號：S816.7""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0186-07

早期斷奶仔豬由于腸道尚未發(fā)育完全，消化和免疫功能發(fā)育不完善，飼料形態(tài)的改變會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失衡、仔豬腹瀉、炎癥反應(yīng)甚至死亡等應(yīng)激反應(yīng)，給生豬養(yǎng)殖造成極大的經(jīng)濟(jì)損失^［1］。目前，主要通過使用抗生素解決這一問題，但由于長期濫用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留、環(huán)境污染等問題，同時(shí)我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也頒布了減抗替抗相關(guān)法規(guī)。因此，尋找和開發(fā)新型天然無公害的抗生素替代物解決仔豬斷奶應(yīng)激問題勢在必行^［2］。黔中金蕎麥（Fagopyrum dibotrys Qian Zhong）屬蓼科（Polygonaceae）多年生草本植物，是貴州省畜牧獸醫(yī)研究所選育的牧草新品種，具有清熱解毒、活血化瘀、健脾止瀉等功效，其主要化學(xué)成分有黃酮類、甾體、有機(jī)酸類、萜類、苷類等，具有抑菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用^［3-5］。本研究以貴州地方豬品種資源可樂豬與巴克夏豬二元雜交斷奶仔豬為試驗(yàn)動(dòng)物，在基礎(chǔ)飼糧中添加1.5%的黔中金蕎麥醇提取物，旨在分析其醇提取物對斷奶仔豬免疫功能和腸道微生物菌群的影響，進(jìn)而為黔中金蕎麥功能性飼料添加劑的開發(fā)利用及貴州省地方豬高效健康飼養(yǎng)方式摸索提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

采用60%乙醇對黔中金蕎麥塊根進(jìn)行回流提取，提取3次，每次30 min，合并濾液后濃縮干燥制得黔中金蕎麥醇提取物。

1.2"試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在貴州省畜牧獸醫(yī)研究所位于貴陽市花溪區(qū)高坡村的養(yǎng)殖場進(jìn)行，選取36頭28日齡、健康、體重接近的巴克夏×可樂豬二元雜交斷奶仔豬，按體重隨機(jī)分為2組，分別為對照組（A50）和試驗(yàn)組（B50），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭，A50組飼喂基礎(chǔ)日糧，B50組飼喂基礎(chǔ)日糧+1.5%黔中金蕎麥醇提取物。試驗(yàn)從2023年2月9日開始，至2023年4月2日結(jié)束，預(yù)試驗(yàn)3 d，正式試驗(yàn)期為50 d。

1.3"飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)日糧為常規(guī)玉米-豆粕型日糧，不含抗生素。日糧配方參照《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 65—2004）營養(yǎng)水平配制。日糧原料組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期間，所有仔豬自由采食和飲水，根據(jù)豬場規(guī)定流程進(jìn)行管理。

1.4"指標(biāo)測定

1.4.1"血清生化、免疫指標(biāo)測定

試驗(yàn)第50天，分別采集A50和B50組仔豬前腔頸靜脈血液2 mL，置于真空促凝管中，立即輕輕混勻，血樣經(jīng) 3 000 r/min 離心10 min，取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用上?？迫A公司卓越310全自動(dòng)生化分析儀測定尿素氮（UREA）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）、球蛋白（GLB）、總蛋白（TP）等血清生化指標(biāo)含量。使用酶免ELLSA試劑盒測定腫瘤壞死因子TNF-α、免疫球蛋白A（IgA）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）、免疫球蛋白M（IgM）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和免疫球蛋白G（IgG）等血清免疫指標(biāo)含量。

1.4.2"仔豬腹瀉情況統(tǒng)計(jì)

利用腹瀉指數(shù)評估仔豬腹瀉情況，腹瀉指數(shù)計(jì)算公式如下：

腹瀉指數(shù)=試驗(yàn)期間各重復(fù)糞便評分之和/試驗(yàn)期間各重復(fù)飼養(yǎng)仔豬總頭數(shù)；

糞便評分方法如下：

正常糞便（成形或顆粒）計(jì)0分，輕度腹瀉（軟糞，能成形）計(jì)1分，中度腹瀉（糞便呈稠狀，不成形，糞水無分離現(xiàn)象）計(jì)2分，嚴(yán)重腹瀉（糞便呈液狀，不成形，糞水有分離現(xiàn)象）計(jì)3分^［6］。

1.4.3"腸道微生物菌群測定

試驗(yàn)第50天，分別采集A50和B50組所有仔豬直腸深部糞便樣品，裝入無菌Eppen dorf管中，迅速放入-80 ℃液氮中。由北京諾禾致源生物信息技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA和ITS高通量測序。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分、拼接、過濾及校正后得到優(yōu)化序列。再去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)，并利用Uparse進(jìn)行聚類，默認(rèn)一致性為97%的序列聚類為分類操作單元（OTU），選取頻率最高的序列作為OTU代表，采用Mothur方法與SILVA138中SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。基于OTU聚類結(jié)果，利用Qiime軟件進(jìn)行樣本分析。

1.5"數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，利用秩和檢驗(yàn)分析腸道微生物菌群相對豐度。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”表示。

2"結(jié)果與分析

2.1"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，與A50組相比，B50組TP、TC、GLB、ALB等血清生化指標(biāo)含量均無顯著差異（Pgt;0.05），UREA含量顯著降低了19.67%（Plt;0.05）。

2.2"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，與A50組相比，B50組斷奶仔豬IgA含量極顯著增加（Plt;0.01），增加了15.51%，IL-6含量水平極顯著降低，降低了8.61%（Plt;0.01），IgG、IgM、IL-1β、TNF-α含量水平無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腹瀉的影響

由表4可知，與A50組相比，B50組腹瀉指數(shù)顯著降低（Plt;0.05），下降了78%。

2.4"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群的影響

2.4.1"序列拼接質(zhì)控與OTU聚類分析

經(jīng)Illumina NovaSeq測序分析得到細(xì)菌共獲得門32個(gè)、綱54個(gè)、目108個(gè)、科160個(gè)、屬316個(gè)、種192個(gè)。其中，A50組得到平均原始序列73 625條，可用于后續(xù)分析的有效序列共62 971條，B50組得到平均原始序列67 911條，可用于后續(xù)分析的有效序列共 60 073 條，按照97%相似性進(jìn)行聚類注釋分別得到OTU 1 339和1 117個(gè)（表5）。真菌共獲得門16個(gè)、綱63個(gè)、目161個(gè)、科381個(gè)、屬747個(gè)、種1 220個(gè)。其中，A50組得到平均原始序列 66 523，可用于后續(xù)分析的有效序列共60 402條，B50組得到平均原始序列69 585，可用于后續(xù)分析的有效序列共62 961條，按照97%相似性進(jìn)行聚類注釋分別得到OTU 674個(gè)和717個(gè)。

2.4.2"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群α多樣性分析

α多樣性分析中，Chao 1和ACE指數(shù)用來估計(jì)群落中生物豐富度；Simpson和Shannon指數(shù)用來描述物種多樣性和均勻度。由表6可知，B50組細(xì)菌和真菌的Chao 1、ACE、Simpson、Shannon及Observed species等各指數(shù)與A50組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4.3"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群組成的影響

由表7可知，細(xì)菌門水平分布主要以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形桿菌門（Proteobacteria）和螺旋體門（Spirochaetota）為主。與A50組相比，B50組厚壁菌門相對豐度增加了4.75百分點(diǎn)，變形桿菌門和螺旋體門占比分別降低了1.54、1.60百分點(diǎn)。屬水平結(jié)果顯示，A50組主要有密螺旋體屬（Treponema）、埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）和普雷沃菌科_NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31）等，與B50組相比分別增加了1.60、3.33、2.47百分點(diǎn)；B50組主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）等，其中，乳桿菌屬（Lactobacillus）和克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）與A50組相比，分別增加了5.40、1.21百分點(diǎn)。

由表8可知，真菌門水平分布主要以新美鞭菌門（Neocallimastigomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主，A50組新美鞭菌門（Neocallimastigomycota）為最優(yōu)菌門，相對豐度為52.78%，B50組子囊菌門（Ascomycota）為最優(yōu)菌門，相對豐度為48.53%。屬水平結(jié)果顯示， A50組主要有新美鞭菌屬（Neocallimastix）、枝頂孢屬（Acremonium）和曲霉屬（Aspergillus），其中，新美鞭菌屬（Neocallimastix）和枝頂孢屬（Acremonium）高于B50組；B50組未鑒定屬（unidentified）相對較高，占26.68%，后依次為新美鞭菌屬（Neocallimastix）（11.73%）和曲霉屬（Aspergillus）（10.09%）。

2.4.4"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群差異物種的影響

利用LEfSe篩選不同組差異顯著的細(xì)菌群類，由圖1可知，細(xì)菌LDA為2水平上，共發(fā)現(xiàn)26個(gè)菌群結(jié)構(gòu)有差異；與A50組比較，B50組腸道中主要有腸球菌屬（Enterococcus），而A50組腸道中主要有鏈球菌屬（Streptococcus）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、纏結(jié)優(yōu)桿菌（Eubacterium Nodatum）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。由圖2可知，真菌LDA為4水平上，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)菌群結(jié)構(gòu)有差異；與A50組比較，B50組腸道中主要有曲霉屬（Aspergillus）和散囊菌屬（Eurotium），而A50組腸道中主要有新美鞭菌屬（Neocallimastix）。

3"結(jié)論與討論

3.1"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)是動(dòng)物機(jī)體的代謝情況和生理狀態(tài)的綜合反映^［7］，血清總蛋白（TP）由白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）組成，能反映機(jī)體蛋白合成效率高低，其含量升高代表機(jī)體對蛋白質(zhì)的消化吸收增強(qiáng)，提高蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積率^［8］，尿素氮（UREA）是蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)分解代謝后的最終物質(zhì)，其含量越低代表蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)利用率越高，對飼料的轉(zhuǎn)化率越高^［9］。本研究中，在飼糧中添加黔中金蕎麥醇提取物后，斷奶仔豬血清中總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）和白蛋白（ALB）含量水平與對照組相比無顯著差異，尿素氮（UREA）顯著降低，說明黔中金蕎麥醇提取物不影響蛋白質(zhì)在斷奶仔豬體內(nèi)的吸收和合成，但能加強(qiáng)蛋白質(zhì)在斷奶仔豬體內(nèi)的代謝，提升對飼料的利用率。李冬光等在斷奶仔豬飼糧中添加含金蕎麥的復(fù)方中草藥，當(dāng)添加量為0.3%和0.5%時(shí)，斷奶仔豬料重比顯著低于對照組，說明金蕎麥能提升機(jī)體對飼料的利用^［10］，本研究結(jié)果與其一致。膽固醇作為血脂的主要成分，一定程度上能反映脂肪在斷奶仔豬機(jī)體內(nèi)的代謝情況^［11］，本研究中試驗(yàn)組和對照組血清總膽固醇含量無顯著差異，表明添加1.5%黔中金蕎麥醇提取物不會(huì)對斷奶仔豬機(jī)體的脂肪代謝造成不利影響。

3.2"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬免疫指標(biāo)的影響

免疫球蛋白（Ig）是反映機(jī)體體液免疫水平的重要指標(biāo)，IgA、IgG、IgM作為主要的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫功效^［12］，其含量的提高代表機(jī)體免疫水平的提高。黃酮作為金蕎麥中的重要次級代謝產(chǎn)物，具有抑菌抗病毒、提高機(jī)體免疫力等多種功能活性^［13-16］，李冬光等在飼糧中添加含金蕎麥的復(fù)方中草藥，當(dāng)添加量為0.3%和0.5%時(shí)，斷奶仔豬血清IgA含量分別提高60.78%和52.55%，IgG含量分別提高29.15%和26.70%，有效提高斷奶仔豬機(jī)體免疫力^［10］。譚露霖等在肉仔雞飼料中添加1%的金蕎麥塊根粉，能顯著提高肉仔雞血清中IgA、IgG、IgM的含量^［17］。本研究中，在斷奶仔豬日糧中添加1.5%金蕎麥醇提取物后，仔豬血清IgA含量極顯著提高（Plt;0.01），提高了15.51%，IgG含量雖無顯著性差異（Plt;0.05），但也有提高趨勢，提高了6.7%，與上述研究結(jié)果一致。IL-1β、IL-6和TNF-α是最具代表性的炎性細(xì)胞因子，IL-1β能促進(jìn)B細(xì)胞的成熟和增生，活化自然細(xì)胞殺手，是一種敏感且特異的急性期炎性指標(biāo)^［18-19］；TNF-α作為強(qiáng)致炎因子，能激活巨噬細(xì)胞和PMN等炎性白細(xì)胞，進(jìn)而刺激其釋放更多的IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞趨化因子，這些因子能造成機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的損傷及促進(jìn)炎癥反應(yīng)^［20］。唐艷芬等利用金蕎麥飲片醇提取物持續(xù)灌胃慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型小鼠21 d，與模型組相比，能顯著降低小鼠血清IL-6、TNF-α含量水平^［21］。本研究中，在斷奶仔豬日糧中添加1.5%金蕎麥醇提取物飼喂后，與對照組相比，斷奶仔豬血清 IL-1β、IL-6、TNF-α含量水平分別降低了16.28%、8.61%、2.62%，其中，IL-6含量水平呈極顯著差異（Plt;0.01）。綜上所述，1.5%添加量的金蕎麥醇提取物能提升斷奶仔豬免疫水平，降低炎癥反應(yīng)。

3.3"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腹瀉的影響

仔豬在斷奶后不僅要面臨環(huán)境改變帶來的應(yīng)激壓力，還要面對飲食改變帶來的不適應(yīng)的壓力。由于斷奶仔豬腸道發(fā)育不完全，斷奶后面臨的最大威脅是腹瀉問題，仔豬斷奶腹瀉是影響生豬養(yǎng)殖效益的重要因素。大量研究表明，在飼料中添加植物提取物能減少腹瀉的發(fā)生。楊凡等在飼糧中添加 1 mL/kg 的博落回水提物能有效緩解斷奶仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)生^［22］；曹林等在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中按500 g/t添加蒲公英、甘草植物提取物，能顯著抑制斷奶仔豬腹瀉^［23］，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果接近。張濤等發(fā)現(xiàn)，金蕎麥醇提取物對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均有較好的抑制效果，MIC分別為31.25、62.50、250.00 mg/mL^［14］；韓芳芳等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金蕎麥莖葉醇提取物濃度為 250 μg/mL 時(shí)，能抑制豬腸道上皮細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，顯著上調(diào)豬小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白 ZO-1 和Occludin蛋白的表達(dá)，改善腸道上皮細(xì)胞連接障礙，保護(hù)腸道健康^［24］；譚露霖等將金蕎麥為主的復(fù)合中藥制劑按2%添加到仔豬日糧中飼喂，能降低有害菌群豐度，改善仔豬腸道微生物環(huán)境^［25］。綜上所述，金蕎麥能有效抑制仔豬腹瀉，可能與其具有抗菌功效、抑制腸道炎癥因子表達(dá)、減少腸道有害菌群等功能相關(guān)。

3.4"黔中金蕎麥醇提取物對斷奶仔豬腸道菌群的影響

腸道是動(dòng)物體重要的消化吸收器官和免疫器官，腸道內(nèi)微生物菌群的平衡直接影響著斷奶仔豬消化吸收、免疫性能、健康狀態(tài)等^［26］。對直腸深部糞便樣品進(jìn)行16S rRNA和ITS分析能有效反映腸道微生物菌群情況，本試驗(yàn)中，黔中金蕎麥醇提取物組與對照組相比，細(xì)菌Chao 1、ACE、Simpson、Shannon及Observed species等各指數(shù)無顯著差異，說明2組微生物菌群豐度和多樣性差異較小。研究表明，細(xì)菌門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門為哺乳動(dòng)物體內(nèi)微生物的優(yōu)勢門^［27］，本研究結(jié)果顯示，黔中金蕎麥醇提取物組與對照組細(xì)菌優(yōu)勢門依次為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形桿菌門（Proteobacteria）和螺旋體門（Spirochaetota），與上述研究結(jié)果一致。厚壁菌門可促進(jìn)機(jī)體對碳水化合物和蛋白質(zhì)的分解利用，提高對飼料的利用率^［28］，本試驗(yàn)中，黔中金蕎麥醇提取物組與對照組相比，厚壁菌門雖無顯著差異，但提高了4.75百分點(diǎn)，說明添加黔中金蕎麥可促進(jìn)斷奶仔豬對飼料的利用，這與黔中金蕎麥醇提物對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響研究結(jié)果一致。

仔豬受到斷奶應(yīng)激，胃腸道中的pH值會(huì)升高，導(dǎo)致適宜在中性或者堿性環(huán)境中生存的致腹瀉微生物如大腸桿菌等大量繁殖，從而造成仔豬腹瀉^［29］。乳酸桿菌屬作為腸道中的有益菌，不僅可通過產(chǎn)生乳酸、乙酸等物質(zhì)，降低腸道pH值，抑制腸道有害菌的增長來改善宿主腸道菌群平衡；還能產(chǎn)生如細(xì)菌素類的抗菌物質(zhì)，增強(qiáng)宿主對病原體的防御屏障功能，從而在宿主腸道中發(fā)揮有益作用，促進(jìn)機(jī)體健康^［30-31］。志賀菌屬作為腸道有害菌，是一種從大腸桿菌逐漸進(jìn)化分離出來的細(xì)菌種屬，是常見的細(xì)菌型痢疾的致病菌，以引起人和動(dòng)物腹瀉為主要發(fā)病特征^［32］。本研究中，添加黔中金蕎麥醇提取物飼喂后，仔豬腸道細(xì)菌屬水平上乳酸桿菌屬、埃希菌-志賀菌屬豐度與對照組相比無顯著差異，但分別上升5.40百分點(diǎn)和降低3.33百分點(diǎn)。說明黔中金蕎麥醇提取物能通過提升有益菌豐度、降低有害菌豐度從而促進(jìn)斷奶仔豬腸道菌群平衡，減少斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生，這與黔中金蕎麥醇提物對斷奶仔豬腹瀉的影響研究結(jié)果一致。

真菌在動(dòng)物腸道微生物中所占比重較低，只占腸道微生物總數(shù)的0.1%左右，主要與腸道細(xì)菌通過協(xié)同、對抗或共生作用，維持腸道黏膜屏障功能及穩(wěn)定腸道微生態(tài)環(huán)境^［33-34］。研究表明，腸道內(nèi)真菌優(yōu)勢菌門主要有子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門^［35］，本研究中，飼喂黔中金蕎麥醇提取物組斷奶仔豬子囊菌門為最優(yōu)菌門，相對豐度為48.53%，與對照組相比提高了24.30百分點(diǎn)，與牛、綿羊、藏子豬等動(dòng)物腸道優(yōu)勢真菌研究結(jié)果^［36-38］相似，說明黔中金蕎醇提取物為對斷奶仔豬腸道真菌菌群多樣性具有一定調(diào)節(jié)作用，維持腸道真菌菌群平衡。

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