胰腺癌類器官模型的構建及其對化療藥物的敏感性試驗

通信作者：張星光，zxg311@126.com（ORCID：0000-0002-3295-0890）

摘要：目的建立及鑒定患者來源的類器官模型，并利用該模型進行化療藥物敏感性檢測。方法利用已確診胰腺癌的2例女性患者的手術標本獲取腫瘤組織消化后獲取胰腺癌細胞，利用基質膠接種于培養(yǎng)皿中進行三維培養(yǎng)；制備石蠟切片并進行蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組化染色，通過與親本腫瘤組織對比，檢測其能否保留體內(nèi)腫瘤的組織病理學特征；利用不同濃度的7種化療藥物處理胰腺癌類器官，使用Cell Titer-Glo?3D試劑測定細胞活力，分析藥敏結果。結果成功建立了2例患者來源的胰腺癌類器官，HE染色和免疫組化染色結果顯示胰腺癌類器官與其來源的患者腫瘤在組織病理學特征上一致；2例胰腺癌類器官均對吉西他濱單藥、奧沙利鉑與SN38+氟尿嘧啶聯(lián)用更為敏感，患者1較患者2敏感性更高，來自不同患者的類器官對藥物反應存在個體差異。結論本研究成功構建的胰腺癌類器官模型能夠反映親本胰腺腫瘤的組織學分型，并能夠進行體外化療藥物敏感性試驗，有望為患者臨床用藥提供參考。

關鍵詞：胰腺腫瘤；類器官；藥物療法，聯(lián)合；敏感性試驗

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生健康科技計劃基金（202201227）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學面上資助項目（YKD2021MS001）

Construction of pancreatic cancer organoids and their sensitivity to chemotherapy drugs

WANG Jingyu1，HUANG Rong2，LU Yan2，CHEN Ziran2，ZHANG Xiaojie3，REN Hu3，ZHANG Nan1，ZHAO Dongbing3，SONG Wei2，ZHANG Xingguang1.（1.School of Public Health，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2.Department of Biochemistry，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100005，China；3.Department of Pancreatogastric Surgery，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100124，China）

Corresponding author：ZHANG Xingguang，zxg311@126.com（ORCID：0000-0002-3295-0890）

Abstract：Objective To construct and identify a patient-derived organoid model，and to investigate the sensitivity of chemotherapy drugs using this model.Methods Pancreatic cancer cells were obtained from the surgical specimens of two female patients with a confirmed diagnosis of pancreatic cancer after tumor tissue digestion，and then the cells were inoculated into a culture dish using matrigel for three-dimensional culture.Paraffin sections were prepared for HE staining and immunohistochemical staining and were compared with the parent tumor tissue to determine whether the histopathological features of the tumor in vivo were preserved.The pancreatic cancer organoids were treated with seven chemotherapy drugs at different concentrations；Cell Titer-Glo?3D reagent was used to measure cell viability，and the results of drug sensitivity were analyzed.Results Two patient-derived pancreatic cancer organoids were successfully constructed，and HE staining and immunohistochemical staining showed that the pancreatic cancer organoids had consistent histopathological features with the tumors of the corresponding patient.Both pancreatic cancer organoids were more sensitive to gemcitabine monotherapy and the combination of oxaliplatin+SN38+fluorouracil，and patient 1 was more sensitive than patient 2.There were individual differences in the response to drugs between the organoids from different patients.Conclusion The pancreatic cancer organoid model successfully constructed in this study can reflect the histological classification of parent pancreatic tumors and can be used for in vitro chemotherapy drug sensitivity test，which is expected to provide a reference for clinical medication.

Key words：Pancreatic Neoplasms；Organoids；Drug Therapy，Combination；Sensitivity Tests

Research funding：Inner Mongolia Autonomous Region Health Science and Technology Program Fund（202201227）；Project of Inner Mongolia Medical University（YKD2021MS001）

在全球范圍內(nèi)，胰腺癌是第12大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第7大原因［1］。在我國，近30年來胰腺癌發(fā)病率和死亡率均顯著上升［2］。由于大多數(shù)患者在早期診斷困難［3］，通常在中晚期確診并進行手術，致使手術效果不佳［4］，因此在手術后進行輔助化療仍然是治療胰腺癌的主要手段［5-7］。然而，胰腺癌患者對化療的反應較差［8］，且容易產(chǎn)生耐藥。因此，化療藥在患者臨床應用前亟需有效的藥敏評價方法預測治療方案的有效性，并及時調整治療策略以達到最佳臨床療效。

近年來，腫瘤基礎研究中的一個重要突破是在體外建立的腫瘤細胞3D培養(yǎng)技術。該技術從患者體內(nèi)直接獲取腫瘤組織，在體外快速地擴增，短時間內(nèi)形成與原始組織生理病理狀態(tài)高度相似的人源類器官。目前該技術已被用于培養(yǎng)來自小鼠和人類腸［9-10］、胃［11-12］、肝臟［13］等類器官。本研究擬建立胰腺癌類器官，并進行單用和聯(lián)用的化療藥物篩選，為胰腺癌的臨床治療提供了新思路。

1材料與方法

1.1胰腺癌組織收集2023年4月—8月于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院治療的2例患者的新鮮胰導管腺癌腫瘤組織，術后病理診斷明確，患者術前未接受新輔助治療。新鮮腫瘤組織在無菌條件下置于組織保存液中，冰上迅速轉移至實驗室，24 h內(nèi)對腫瘤組織進行處理。患者1：女性，59歲，病理提示中分化胰導管腺癌，腫瘤分期pT2N1；患者2：女性，62歲，病理提示低分化胰導管腺癌，腫瘤分期pT3N0。

1.2主要儀器及試劑細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國），多功能酶標儀（TECAN，瑞士），倒置生物顯微鏡（奧特光學，中國），顯微鏡（NIKON，日本），EVOS細胞成像系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國），石蠟包埋機（Gibco，美國），石蠟切片機（Leica，德國）?；|膠Matrigel、Noggin、R-spondin-1、Wnt-3a（Ramp;D Systems，美國），Advanced DMEM/F12培養(yǎng)液、Ⅰ型膠原酶（Gibco，美國），TrypLE Express Enzyme、GlutaMAX、HEPES、B27、DNaseⅠ（Thermo Fisher Scientific，美國），表皮生長因子、成纖維細胞生長因子10（PeproTech，美國），N-Acetylcysteine、Nicotinamide、Y27632（Sigma，美國），A83-01（Tocris Bioscience，英國），Primocin（Invitrogen，美國），蘇木精-伊紅（HE）染色液（賽維爾，中國），青霉素/鏈霉素（凱基生物，中國），PBS（中科邁晨，中國），Cell Titer-Glo?3D Reagent（Promega，美國），CK19、Ki67免疫組化抗體（Proteintech，美國）。

1.3方法

1.3.1主要試劑的配制胰腺癌類器官培養(yǎng)基：Advanced DMEM/F12培養(yǎng)液加Primocin（1×），B27（1×），表皮生長因子（50μg/L），Noggin條件培養(yǎng)基（4%），R-spondin-1條件培養(yǎng)基（2%），Wnt-3a條件培養(yǎng)基（30%），A83-01（500 nmol/L），成纖維細胞生長因子10（10μg/L），N-Acetylcysteine（1.56 mmol/L），Nicotinamide（10 mmol/L），Y-27632（10μmol/L）。清洗液及終止培養(yǎng)基：Advanced DMEM培養(yǎng)液加GlutaMAX（1×），HEPES（10 mmol/L），青霉素/鏈霉素（1×）。消化液：Advanced DMEM培養(yǎng)基加Ⅰ型膠原酶（2.5 g/L），DNase I（10 mg/L），Y-27632（10μmol/L）。

1.3.2胰腺癌類器官的分離及培養(yǎng)組織離體后立即放入樣品保存液中保存，冷鏈運輸至實驗室。將腫瘤組織用清洗液清洗2次，剪取1塊組織塊，放入無菌1.5 mL EP管中，加入組織固定液固定，用于后續(xù)包埋切片做鑒定。按照流程圖（圖1），用手術剪將剩余組織充分剪碎至小塊，移入15 mL離心管中，加入消化液置于37℃振蕩器中消化15 min。如果第1次消化后沒出現(xiàn)細胞團塊，則重復上述步驟，繼續(xù)消化，直到出現(xiàn)細胞團塊。最后再用TrypLE消化1次，并加入終止培養(yǎng)基用于稀釋消化液。稀釋后的消化液在4℃離心機中300×g離心5 min，棄上清再加入預冷的清洗液洗滌，離心，棄上清液。5 000個/孔，每孔用50μL冰上化好的Matrigel混勻種入24孔板中，并將混有類器官的Matrigel用200μL槍頭涂勻，使類器官均勻地分布在Matrigel中。將24孔板在37℃細胞培養(yǎng)箱中放置10 min，待Matrigel完全凝固，加入胰腺癌類器官培養(yǎng)基。每3天換1次培養(yǎng)基，第1、3、5、7天拍照，觀察生長狀態(tài)。待人源類器官培養(yǎng)14天左右，直徑80μm左右，或者當基質膠底部肉眼可見白點，顯微鏡鏡下觀察可見類器官的腔長得比較大但還未塌陷，就可以進行類器官的傳代，通常按照1∶2～1∶3的比例傳代。

1.3.3胰腺癌組織及類器官HE染色及免疫組化染色HE染色：將胰腺癌組織及與其對應的類器官置于多聚甲醛固定液中24 h后進行常規(guī)脫水、石蠟包埋并切片。脫去石蠟至水后，用蘇木素染色液染細胞核，用伊紅染色液染細胞質，脫水透明后滴上中性樹脂封片。免疫組化染色：石蠟切片進行脫蠟復水、抗原修復、過氧化物酶阻斷及封閉后，將稀釋的免疫組化抗體CK19、Ki67于4℃孵育切片過夜。次日用PBS洗3次，先后滴加對應的生物素標記的二抗、DAB顯色液孵育，然后用蘇木素復染，脫水透明后用中性樹脂封片，干燥后置于顯微鏡下拍照。

1.3.4藥物敏感性實驗用1 mL移液槍將傳代后的類器官（患者1為第3代類器官，患者2為第7代類器官）從孔板中吹下，用消化液進行消化，將消化后的類器官用含5%Matrigel的胰腺癌類器官培養(yǎng)基重懸，以400個/孔的密度均勻種于384孔板中，50μL/孔。觀察細胞狀態(tài)，24 h后每孔加入250 nL化療藥物。根據(jù)《胰腺癌診療指南（2022年版）》［14］，選擇氟尿嘧啶、吉西他濱、卡培他濱、SN38、順鉑、奧沙利鉑進行單藥藥物敏感性檢測，濃度梯度見表1。聯(lián)合用藥的藥物及濃度分別為：吉西他濱與卡培他濱聯(lián)用，最高濃度分別為1、1.66μmol/L，3倍稀釋；吉西他濱與順鉑聯(lián)用，最高濃度分別為1、0.075μmol/L，3倍稀釋；吉西他濱與紫杉醇聯(lián)用，最高濃度分別為1、0.125μmol/L，3倍稀釋；吉西他濱與氟尿嘧啶聯(lián)用，最高濃度分別為1、0.12μmol/L，3倍稀釋；奧沙利鉑、SN38與氟尿嘧啶聯(lián)用，最高濃度分別為1.42、2.5、40μmol/L，2倍稀釋；均設置5個濃度，濃度為0的孔作為對照組。密切觀察類器官的變化，并拍照記錄。5 d后，吸取上層培養(yǎng)基，每孔加入5μL Cell Titer-Glo?3D試劑，使用多功能酶標儀讀取發(fā)光值。

2結果

2.1胰腺癌類器官模型的建立腫瘤組織消化得到的胰腺癌細胞培養(yǎng)第3天可見明顯球形結構，并且隨時間變大，第7天直徑可達100μm以上（圖2），成功建立胰腺癌類器官模型。

2.2胰腺癌類器官組織形態(tài)學鑒定HE染色結果顯示，胰腺癌組織與胰腺癌類器官均可見細胞膨大，呈現(xiàn)管腔形態(tài)，細胞核異型性，類器官較好地維持了原腫瘤的形態(tài)結構（圖3）。進一步免疫組化染色結果顯示，2例類器官在上皮細胞分化標志物（CK19）和增殖標志物（Ki67）染色均呈陽性（圖4），與原腫瘤組織的染色結果一致，胰腺癌類器官能較好地維持原腫瘤組織的特性。

2.3胰腺癌類器官藥敏性試驗患者1對吉西他濱單藥、SN38單藥、奧沙利鉑與SN38+氟尿嘧啶聯(lián)用最為敏感，患者2對氟尿嘧啶單藥、吉西他濱單藥、奧沙利鉑與SN38+氟尿嘧啶聯(lián)用最為敏感，隨著藥物濃度的增高細胞均出現(xiàn)不同程度的崩解（圖5）。兩例患者均對卡培他濱、奧沙利鉑、吉西他濱+卡培他濱聯(lián)用不敏感，細胞形態(tài)較完整。

不同胰腺癌患者對同一種化療藥物的敏感性不盡相同，同一患者對不同化療藥物的敏感性也不同。其中患者1類器官對氟尿嘧啶、SN38呈劑量依賴關系，且對SN38高度敏感，隨著藥物濃度增加，類器官活力呈明顯的下降趨勢，但是對氟尿嘧啶的敏感度欠佳。此外，患者1類器官對卡培他濱、奧沙利鉑及吉西他濱+卡培他濱聯(lián)用表現(xiàn)出明顯的抵抗，尤其是卡培他濱，隨著藥物濃度增加，細胞活力未見明顯變化，甚至呈增加趨勢?；颊?類器官對氟尿嘧啶、吉西他濱、SN38及吉西他濱+紫杉醇聯(lián)用高度敏感，對其余藥物表現(xiàn)出抵抗力，尤其是卡培他濱。整體來看，兩例患者相比，患者1較患者2對藥物敏感性高，這體現(xiàn)出類器官模型可以反映出不同患者的異質性（圖6）。根據(jù)指南及兩位患者自身病情而制定的臨床術后化療方案，與對應類器官進行藥物篩選的結果相比較，敏感程度基本一致。

3討論

無法復制腫瘤異質性是限制使用傳統(tǒng)細胞系指導精準醫(yī)學的關鍵原因之一。胰腺癌是一種具有較高致死率的惡性腫瘤，早期癥狀往往難以察覺，進而錯過最佳治療時機，并且胰腺癌發(fā)病部位鄰近許多重要血管和器官，手術難度較大且易出現(xiàn)并發(fā)癥，再加上不同患者以及個體內(nèi)的不同腫瘤表現(xiàn)出顯著異質性，使得針對性治療以及藥物的篩選難度加大。胰腺癌細胞存在高度的纖維化，在體外培養(yǎng)較為困難，這給基礎研究和藥物開發(fā)帶來挑戰(zhàn)。因此建立個體化的臨床前模型對于預測胰腺癌的藥物反應和制定有效的治療策略至關重要。

腫瘤類器官技術是腫瘤基礎研究中的一個重要突破。類器官是細胞的三維組裝體，包含一種以上的細胞類型，可以很好的保留原位腫瘤組織的各種特性［15］。相比于傳統(tǒng)2D細胞系培養(yǎng)和動物移植瘤模型，腫瘤類器官既能完整反映患者腫瘤的遺傳信息和腫瘤表型，同時也能保證腫瘤的異質性［16-17］，而且經(jīng)濟效益高，因此無論在科研上還是在臨床上都備受青睞，是評估藥物反應和篩選藥物的有效工具。

有研究［18］表明，利用活檢或手術切除包括新輔助化療后手術切除的組織建立胰腺癌類器官是可行的。2013年利用小鼠胰腺分離出來的細胞可培養(yǎng)成胰腺類器官，2015年患者來源的胰導管腺癌類器官也成功建立，多數(shù)胰導管腺癌類器官的成功率約為75%［19-20］。然而胰腺癌治療僅使用單藥治療容易導致患者耐藥，而腫瘤藥物的聯(lián)合治療對克服耐藥性、加強藥物療效、降低單藥劑量毒性以及擴大藥物適應證有益，本研究選擇不同一線聯(lián)合化療方案，對胰腺癌類器官進行藥物敏感性試驗，觀察到類器官以濃度依賴的方式經(jīng)歷細胞死亡，來自不同患者的類器官之間的差異表明患者的藥物反應存在個體差異。然而胰腺癌類器官模型也有一定的局限性，比如缺少與血管、血液、免疫細胞、微生物群等腫瘤微環(huán)境成分的相互作用。有研究采用免疫細胞或成纖維細胞共培養(yǎng)來彌補這一缺點［21-22］，建立類器官與免疫細胞的共培養(yǎng)體系，用于免疫抑制劑的篩選，用于評價腫瘤免疫治療藥物的敏感性［23-24］，這也是未來類器官面臨的挑戰(zhàn)之一。此外，類器官與基質細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞的3D共培養(yǎng)是一種前沿的方法，可以概括腫瘤微環(huán)境，將靶向藥物作用于抗基質或免疫途徑，為臨床研究提供基礎［21］。

本研究的胰腺癌類器官來源于胰腺癌女性患者供體2例，均可培養(yǎng)出可以穩(wěn)定傳代的類器官，表明本培養(yǎng)體系可靠。進而進行7種藥物單藥和聯(lián)合用藥的篩選，發(fā)現(xiàn)患者1對吉西他濱單藥、SN38單藥、奧沙利鉑與SN38+氟尿嘧啶聯(lián)用較為敏感，患者2對氟尿嘧啶單藥、吉西他濱單藥、奧沙利鉑與SN38+氟尿嘧啶聯(lián)用較為敏感，整體來講患者1較患者2對藥物更敏感。入組的2例患者按照指南結合自身病情的化療方案，與對應類器官進行藥物篩選的結果相比較，其敏感程度基本一致。本研究表明，使用類器官作為藥物測試模型指導癌癥患者的個性化治療具有潛在的應用價值。下一步需招募大量胰腺癌患者進行前瞻性臨床研究，這對于胰腺癌的治療具有重大意義。

倫理學聲明：本研究方案于2023年6月7日經(jīng)由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，批號：NCC2023C-558，患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王靖宇、黃容、張星光負責設計論文框架，起草論文；王靖宇、陳子然負責實驗操作，研究過程的實施；張曉杰、任虎、趙冬兵負責數(shù)據(jù)收集；王靖宇負責統(tǒng)計學分析，繪制圖表；王靖宇、黃容、張楠、張星光負責論文修改；黃容、盧艷、宋偉、張星光負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-02-26；錄用日期：2024-04-15

本文編輯：王瑩

引證本文：WANG JY， HUANG R， LU Y， et al. Construction of pancreatic cancer organoids and their sensitivity to chemotherapy drugs[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（9）： 1853-1858. 王靖宇， 黃容， 盧艷， 等 . 胰腺癌類器官模型的構建及其對化療藥 物的敏感性試驗[J]. 臨床肝膽病雜志， 2024， 40（9）： 1853- 1858.