白細(xì)胞介素22對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響及其機(jī)制

摘要：目的探討肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中白細(xì)胞介素（IL）22發(fā)揮的作用及影響機(jī)制。方法選取人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞為研究對(duì)象，以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞構(gòu)建肝星狀細(xì)胞活化模型，以梯度濃度的IL-22處理LX-2細(xì)胞，通過(guò)Western Blot、qRT-PCR檢測(cè)活化標(biāo)志物Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)水平以確定適宜的藥物工作濃度、時(shí)間；通過(guò)Western Blot、qRT-PCR及免疫熒光方法檢測(cè)經(jīng)IL-22處理的活化肝星狀細(xì)胞中成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14（Fn14）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）及其活化標(biāo)志物水平；以衣霉素（TM）誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞ERS，通過(guò)Western Blot、qRT-PCR檢測(cè)經(jīng)IL-22處理后LX-2細(xì)胞ERS及其活化標(biāo)志物水平；使用腫瘤壞死因子樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）、小干擾RNA分別上/下調(diào)Fn14，再檢測(cè)磷酸化肌醇需求蛋白1α（p-IRE1α）、肌醇需求蛋白1α（IRE1α）、轉(zhuǎn)錄因子剪接型X-盒結(jié)合蛋白1（XBP1s）、COL1A1和α-SMA基因及蛋白水平；在IL-22處理TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞的基礎(chǔ)上加用TWEAK上調(diào)Fn14，通過(guò)Western Blot、免疫熒光方法檢測(cè)Fn14、ERS及其活化標(biāo)志物水平。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Sidak’s多重比較檢驗(yàn)。結(jié)果與TGF-β1組相比，TGFβ1+IL-22組COL1A1、α-SMA的蛋白和mRNA表達(dá)水平均下降，且在IL-22濃度為10 ng/mL以上作用24小時(shí)時(shí)效果更加顯著（P值均lt;0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+IL-22組Fn14、p-IRE1α、XBP1s表達(dá)水平均下降（P值均lt;0.05）；與TM組相比，TM+IL-22組p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達(dá)水平均下降（P值均lt;0.05）；與沉默對(duì)照（NC）組相比，F(xiàn)n14 siRNA組p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達(dá)水平均下降（P值均lt;0.05）；與正常對(duì)照組相比，TWEAK組Fn14、p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達(dá)水平均上升（P值均lt;0.01）；與TGF-β1+IL-22組相比，TGF-β1+IL-22+TWEAK組Fn14、p-IRE1α、XBP1s、COL1A1和α-SMA表達(dá)水平均上升（P值均lt;0.05）。結(jié)論IL-22通過(guò)抑制Fn14負(fù)調(diào)控肝星狀細(xì)胞ERS進(jìn)而抑制其活化增殖。

關(guān)鍵詞：肝纖維化；白細(xì)胞介素22；肝星狀細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81900552）；南京市衛(wèi)生科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目-杰出青年基金項(xiàng)目（JQX20005）

Effect of interleukin-22 on hepatic stellate cell activation and its mechanism

GAO Jun，CHEN Huan，LIU Yan，ZHANG Feng，ZHUGE Yuzheng.（Department of Gastroenterology，Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China）

Corresponding author：ZHUGE Yuzheng，yuzheng9111963@aliyun.com（ORCID：0000-0002-3829-5831）

Abstract：Objective To investigate the effect of interleukin-22（IL-22）on the activation of hepatic stellate cells（HSCs）and its mechanism.Methods The human HSC LX-2 cells were selected for the study，and the LX-2 cells induced by TGF-β1 were used to establish a model of HSC activation.LX-2 cells were treated with IL-22 at gradient concentrations，and Western blot and qRT-PCR were used to measure the expression levels of the activation markers COL1A1 andα-SMA and determine the appropriate working concentration and time of the drug.Western blot，qRT-PCR，and immunofluorescence assay were used to determine the levels of Fn14 and the markers for endoplasmic reticulum stress（ERS）and activation in activated HSCs treated by IL-22.ERS in LX-2 cells was induced by tunicamycin（TM），and Western blot and qRT-PCR were used to measure the levels of markers for ERS and activation in LX-2 cells treated by IL-22.TNF-like weak inducer of apoptosis（TWEAK）and small interfering RNA were used to upregulate and downregulate Fn14，and then the mRNA and protein expression levels of p-IRE1α，IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA were measured.After LX-2 cells induced by TGF-β1 were treated by IL-22，TWEAK was used to upregulate Fn14，and Western blot and immunofluorescence assay were used to measure the levels of Fn14 and the markers for ERS and activation.The independent-samples t-test was used for comparison of continuous data between two groups；a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the Sidak’s multiple comparison test was used for further comparison between two groups.Results Compared with the TGF-β1 group，the TGF-β1+IL-22 group had significant reductions in the protein and mRNA expression levels of COL1A1 andα-SMA，with a more significant effect after treatment with 10 ng/mL IL-22 for 24 hours（all Plt;0.01）.Compared with the TGF-β1 group，the TGF-β1+IL-22 group had significant reductions in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，and XBP1s（all Plt;0.05）.Compared with the TM group，the TM+IL-22 group had significant reductions in the expression levels of p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Compared with the silenced control group，the Fn14 siRNA group had significant reductions in the expression levels of p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Compared with the normal control group，the TWEAK group had significant increases in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.01）.Compared with the TGFβ1+IL-22 group，the TGF-β1+IL-22+TWEAK group had significant increases in the expression levels of Fn14，p-IRE1α，XBP1s，COL1A1，andα-SMA（all Plt;0.05）.Conclusion IL-22 negatively regulates ERS in HSCs by inhibiting Fn14，thereby inhibiting the activation of HSCs.

Key words：Hepatic Fibrosis；Interleukin-22；Hepatic Stellate Cells；Endoplasmic Reticulum Stress

Research funding：National Natural Science Foundation of China（81900552）；Nanjing Health Science and Technology Development Special Fund Project-Outstanding Youth Fund（JQX20005）

肝纖維化是肝硬化的必經(jīng)階段，目前尚缺乏有效的治療方法［1-2］。肝纖維化發(fā)生的核心機(jī)制是肝星狀細(xì)胞活化導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積［3］。因此，以活化的肝星狀細(xì)胞為治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索纖維化發(fā)展和逆轉(zhuǎn)的新機(jī)制具有重要意義。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14（fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14）是腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）的主要受體，TWEAK啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如NF-κB和MAPK［4］。Fn14具有重要的病理生理作用，參與組織損傷修復(fù)、血管生成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活和死亡等［5］。本課題組先前研究以Fn14為中心，相繼發(fā)現(xiàn)Fn14的上調(diào)通過(guò)激活經(jīng)典的NF-κB/MMP9信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞遷移［6］；Fn14還能抑制活化肝星狀細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)炎癥因子的分泌，下調(diào)Fn14則會(huì)增加細(xì)胞凋亡［7］。本研究繼續(xù)以Fn14為靶標(biāo)，進(jìn)一步探討其促進(jìn)纖維化的機(jī)制及可能逆轉(zhuǎn)的新方法。

研究［8-10］表明，白細(xì)胞介素（IL）22可促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞衰老，還可通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞的活化和下調(diào)炎癥因子的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)纖維化。相反，也有研究［11-12］表明，IL-22在HBV感染小鼠模型中具有促纖維化作用，IL-22的高表達(dá)與HCV感染患者的纖維化進(jìn)展相關(guān)。這表明IL-22可能在不同的肝病中發(fā)揮不同的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集，以及鈣離子平衡紊亂等狀況，而激活未折疊蛋白反應(yīng)等信號(hào)途徑的反應(yīng)過(guò)程［13］。ERS促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化在相關(guān)研究中被證實(shí)：ERS引起的氧化應(yīng)激可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化［14］；丹酚酸A通過(guò)SIRT1介導(dǎo)的HSF1脫乙?；瘻p輕ERS，從而緩解肝纖維化［15］；在體外，用衣霉素（tunicamycin，TM）化學(xué)誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化［16］。IL-22可以調(diào)節(jié)INS-1細(xì)胞中棕櫚酸酯誘導(dǎo)的ERS［17］；IL-22可以逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞ERS的影響［18］。但目前未見(jiàn)有IL-22對(duì)肝星狀細(xì)胞ERS具有調(diào)控作用的研究報(bào)道。

目前的研究主要揭示Fn14促進(jìn)肝纖維化的現(xiàn)象，對(duì)機(jī)制的研究仍有欠缺。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n14能夠調(diào)控肝星狀細(xì)胞ERS相關(guān)分子表達(dá)，同時(shí)IL-22能夠抑制活化肝星狀細(xì)胞Fn14的表達(dá)。本研究通過(guò)觀察IL-22對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響，探討可能通過(guò)Fn14調(diào)控ERS的可能機(jī)制。為臨床治療肝纖維化提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理人肝星狀細(xì)胞LX-2購(gòu)自中國(guó)武漢普諾賽生物公司，在混合有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37℃，培養(yǎng)條件為5%CO2加濕空氣。培養(yǎng)基定期更換，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底部的70%～80%。然后根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求將細(xì)胞接種到6/12孔板中，貼壁12～24 h后，根據(jù)不同分組需要予以TGF-β1 5 ng/mL、IL-22 10 ng/mL、TM 2 ug/mL、TWEAK 100 ng/mL處理，24 h后收取細(xì)胞。

1.2試劑和抗體胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA溶液和磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自南京森貝伽生物公司；IL-22（貨號(hào)：HY-P7039）、TGF-β1（貨號(hào)：HY-P）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；TWEAK（貨號(hào)：RP01446）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物公司；Tunicamycin（N-連接的糖基化抑制劑）（貨號(hào)：SC0393）購(gòu)自碧云天公司；Fn14（貨號(hào)：ab109365）、p-IRE1α（貨號(hào)：ab124945）、XBP1s（貨號(hào)：ab220783）、ATF6（貨號(hào)：ab227830）、PERK（貨號(hào)：ab229912）一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IRE1α（貨號(hào)：A21021）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物公司；α-SMA（貨號(hào)：1E9A11）、COL1A1（貨號(hào)：1E9A7）和β-actin（貨號(hào)：4H1）購(gòu)自武漢三鷹生物公司。

1.3 Fn14小干擾RNA轉(zhuǎn)染Hs-Fn14-si1、Hs-Fn14-si2、Hs-Fn14-si3和陰性對(duì)照模擬物（NC組）由上海漢恒生物公司合成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000試劑（上海賽默飛公司），按照供應(yīng)商提供的方案進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48 h收取細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western Blot檢測(cè)取經(jīng)藥物干預(yù)處理的LX-2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗6孔板中的LX-2細(xì)胞3次，用含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解30 min，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（碧云天）測(cè)定總蛋白濃度。將等濃度的總蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到Immobilon?-PSQ PVDF膜上，用甲醇激活，與Fn14（1∶5 000）、IRE1a（1∶1 000）、p-IRE1a（1∶5 000）、XBP1s（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、COL1A1（1∶1 000）的一抗在4℃冰箱中孵育過(guò)夜。然后用HRP結(jié)合的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）或山羊抗鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影，曝光時(shí)間1～2 min，并使用Tanon 5200 Multi圖像分析系統(tǒng)收集和分析印跡產(chǎn)物的圖像。

1.5定量實(shí)時(shí)PCR取經(jīng)藥物干預(yù)處理的LX-2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗加藥的LX-2細(xì)胞，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用TRIzol試劑從LX-2細(xì)胞中提取總RNA，并使用分光光度計(jì)進(jìn)行定量。使用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用qPCR Master Mix和相應(yīng)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。目標(biāo)mRNA的表達(dá)量與人β-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)量進(jìn)行比較，并采用?ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，使用GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析做圖。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.6免疫熒光檢測(cè)在帶有無(wú)菌載玻片的12孔板中培養(yǎng)LX-2細(xì)胞，每孔約4×104個(gè)。經(jīng)藥物處理后，用冷PBS沖洗載玻片上的LX-2細(xì)胞3次，室溫下用4%多聚甲醛固定20 min，室溫下用0.5%Triton-100通透20 min，室溫下用5%BSA封閉30 min，然后用稀釋為1∶100的一抗孵育過(guò)夜。最后，用PBST沖洗載玻片3次，并用稀釋為1∶100的FITC結(jié)合物山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。滴加DAPI進(jìn)行再染色。然后使用Leica DMi8倒置熒光顯微鏡觀察玻片，并存取圖片。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Sidak’s多重比較檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 IL-22對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響用TGF-β1（5 ng/mL）處理LX-2細(xì)胞24 h，同時(shí)予以不同濃度的IL-22（0、1、10、50和100 ng/mL）分組處理，Western Blot結(jié)果顯示，與TGF-β1組相比，隨著IL-22濃度升高，其抑制α-SMA和COL1A1表達(dá)的作用越強(qiáng)（圖1a、b）。同樣用TGF-β1（5 ng/mL）誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞24 h，同時(shí)用不同濃度的IL-22（0.1、0.5、1、10、100 ng/mL）分組處理，qRT-PCR結(jié)果顯示，與TGF-β1組相比，IL-22處理的LX-2組中α-SMA和COL1A1的表達(dá)水平也呈劑量依賴(lài)性（圖1c）。用TGF-β1（5 ng/mL）誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞24 h后分別用IL-22處理12 h和24 h，對(duì)α-SMA和COL1A1 mRNA的qRT-PCR檢測(cè)顯示，IL-22在處理12 h和24 h均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，且TGF-β1在24 h時(shí)誘導(dǎo)活化效應(yīng)更顯著（圖1d）。

2.2 IL-22抑制肝星狀細(xì)胞中Fn14的表達(dá)和ERS按對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+IL-22組不同分組對(duì)應(yīng)藥物處理LX-2細(xì)胞24 h，Western Blot結(jié)果顯示，TGF-β1促進(jìn)Fn14及ERS相關(guān)蛋白磷酸化的IRE1α和XBP1s的表達(dá)。加入IL-22后上述蛋白表達(dá)受到抑制，而未折疊蛋白反應(yīng)另外兩個(gè)通路蛋白ATF6、PERK的表達(dá)不受影響（圖2a），后續(xù)試驗(yàn)將主要聚焦于IRE1α-XBP1s信號(hào)通路。Fn14和XBP1s的免疫熒光染色結(jié)果與Western Blot和qRT-PCR結(jié)果一致（圖2b～d）。為進(jìn)一步研究IL-22是否通過(guò)抑制LX-2的ERS發(fā)揮作用，加入ERS誘導(dǎo)劑TM激活LX-2，將細(xì)胞分為對(duì)照組、TM組、TM+IL-22組。Western Blot結(jié)果顯示，TM處理的LX-2中IRE1α和XBP1s的表達(dá)明顯增加。此外，TM還上調(diào)了α-SMA和COL1A1的表達(dá)，IL-22處理可抑制這種現(xiàn)象（圖2e）。qRT-PCR結(jié)果顯示，XBP1、COL1A1和α-SMA的mRNA表達(dá)與Western Blot檢測(cè)結(jié)果一致（圖2f）。

2.3 Fn14調(diào)控IRE1α-XBP1s信號(hào)通路首先，使用小干擾RNA下調(diào)肝星狀細(xì)胞Fn14的表達(dá)，并通過(guò)Western Blot和qRT-PCR驗(yàn)證其下調(diào)效率（圖3a～b）。成功下調(diào)Fn14表達(dá)后，檢測(cè)IRE1α-XBP1s通路的表達(dá)情況，隨著Fn14的下調(diào)，XBP1s、α-SMA和COL1A1的mRNA表達(dá)均有所降低（P值均lt;0.01），蛋白表達(dá)的變化也一致，總的IRE1a蛋白變化不明顯，但磷酸化的IRE1a減少（圖3c、d），結(jié)果表明，F(xiàn)n14是通過(guò)IRE1α-XBP1s途徑激活肝星狀細(xì)胞。為了進(jìn)一步說(shuō)明兩者之間的關(guān)系，在先前研究的基礎(chǔ)上，使用TWEAK上調(diào)Fn14的表達(dá)，然后檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。將細(xì)胞分為NC組和TWEAK組，使用TWEAK處理細(xì)胞24 h后，TWEAK組Western Blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n14上調(diào)后，p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1的表達(dá)量增加（圖3e）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TWEAK處理的LX-2中Fn14、XBP1s和α-SMA的mRNA表達(dá)明顯增加（P值均lt;0.01）（圖3f）。Fn14和XBP1s的免疫熒光染色結(jié)果與Western Blot和qRT-PCR結(jié)果一致（圖3g）。

2.4 IL-22通過(guò)抑制Fn14/ERS信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化將細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β1組、IL-22+TGF-β1組、IL-22+TGF-β1+TWEAK組，使用對(duì)應(yīng)藥物處理LX-2細(xì)胞24 h，前三組Western Blot結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，IL-22抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Fn14、p-IRE1α、XBP1s、α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)。不同的是，在此基礎(chǔ)上加入TWEAK上調(diào)Fn14后，這種抑制作用反被抵消，F(xiàn)n14和XBP1s的免疫熒光結(jié)果與Western Blot結(jié)果相一致（圖4）。

3討論

對(duì)于慢性肝病導(dǎo)致的肝纖維化，目前尚無(wú)有效的療法獲得批準(zhǔn)［19］。TGF-β1是機(jī)體常見(jiàn)的一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，是正常肝細(xì)胞向成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要促進(jìn)因子［20］。本研究用TGF-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，探索IL-22在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的保護(hù)作用。

IL-22是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+Th細(xì)胞因子，具有抑制或促進(jìn)多種疾病的雙重功能［21］。在血吸蟲(chóng)感染的小鼠肝纖維化模型中，IL-22可激活肝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3，從而改善肝纖維化［22］。相反，在慢性病毒性肝炎患者中，IL-22水平顯著升高。IL-22在肝病中表現(xiàn)的雙重作用可能與疾病病因、疾病階段及機(jī)體免疫狀態(tài)相關(guān)［23］。在特異性皮炎相關(guān)研究［24］中發(fā)現(xiàn)，TWEAK在誘導(dǎo)許多與特異性皮炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因方面具有很強(qiáng)的炎癥活性，并且該細(xì)胞因子具有與兩種已識(shí)別的特異性皮炎特征細(xì)胞因子IL-13或IL-22相當(dāng)?shù)幕钚?。因此可以推斷TWEAK-Fn14信號(hào)軸與IL-22之間存在一定的調(diào)控關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)IL-22不僅能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化，還首次發(fā)現(xiàn)IL-22能抑制TGF-β1誘導(dǎo)后的肝星狀細(xì)胞Fn14以及ERS相關(guān)蛋白XBP1s的表達(dá)。

在氧化應(yīng)激和炎癥等應(yīng)激條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能會(huì)不堪重負(fù)，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累以及隨之而來(lái)的ERS。輕度ERS有助于錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白正確折疊，并加強(qiáng)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞存活并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。然而，如果應(yīng)激因素持續(xù)存在，ERS將超過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)閾值，將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［25］。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在3個(gè)傳感器，PERK、ATF6和IRE1傳感器檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊并觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，是一個(gè)維持體內(nèi)平衡的復(fù)雜系統(tǒng)［26］。在3條信號(hào)通路中，IRE1是最保守的，IRE1的N端區(qū)域與未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，而細(xì)胞質(zhì)中的C端區(qū)域具有兩個(gè)激酶和RNase結(jié)構(gòu)域。激活未折疊蛋白反應(yīng)后，IRE1被自磷酸化，并將XBP1s mRNA與其Rnase結(jié)構(gòu)域剪接，剪接的XBP1通過(guò)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核來(lái)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)分泌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)和脂質(zhì)代謝的基因表達(dá)［27］。在慢性肝病中很容易觀察到ERS，許多致病因素如感染、炎癥、活性氧、營(yíng)養(yǎng)剝奪和缺氧等都會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路，而未折疊蛋白反應(yīng)的適應(yīng)性信號(hào)通路IRE1α-XBP1s可保護(hù)肝星狀細(xì)胞免受ERS誘導(dǎo)的凋亡［28］。研究［29］表明，IRE1α-XBP1s軸可在TGF-β處理后誘導(dǎo)TANGO1（一種參與膠原I分泌的蛋白質(zhì)）上調(diào)。未折疊蛋白反應(yīng)激活誘導(dǎo)TANGO1上調(diào)，從而促進(jìn)肝纖維化。這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)論Fn14通過(guò)調(diào)控IRE1α-XBP1s信號(hào)通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化不謀而合。

Fn14的促纖維化效應(yīng)已在之前的研究中得到證實(shí)［6-7］。本研究使用TWEAK上調(diào)Fn14，首次發(fā)現(xiàn)了Fn14的上調(diào)能夠影響IRE1α-XBP1s通路蛋白的表達(dá)。雙醋瑞因治療以劑量依賴(lài)的方式對(duì)膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化具有保護(hù)作用，并且這種作用可能與調(diào)節(jié)HMGB1/RAGE/NF-κB/JNK和ERS信號(hào)通路有關(guān)［30］。而Fn14是否通過(guò)類(lèi)似于NF-κB胞內(nèi)信號(hào)通路影響IRE1α-XBP1s通路有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明，IL-22能有效抑制肝星狀細(xì)胞的活化，并且這一作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Fn14以及由其介導(dǎo)的ERS通路抑制有關(guān)。由此表明，IL-22可能是臨床治療肝纖維化的潛在選擇。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高君負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作，起草論文；陳歡、劉燕負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作；張峰、諸葛宇征提供課題思路，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。

參考文獻(xiàn)：

[1]GINèS P，KRAG A，ABRALDES JG，et al.Liver cirrhosis[J].Lancet，2021，398（10308）：1359-1376.DOI：10.1016/s0140-6736（21）01374-x.

[2]DEWIDAR B，MEYER C，DOOLEY S，et al.TGF-βin hepatic stellate cell activation and liver fibrogenesis-updated 2019[J].Cells，2019，8（11）：1419.DOI：10.3390/cells8111419.

[3]KISSELEVA T，BRENNER D.Molecular and cellular mechanisms of liver fibrosis and its regression[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2021，18（3）：151-166.DOI：10.1038/s41575-020-00372-7.

[4]CROFT M，SIEGEL RM.Beyond TNF：TNF superfamily cytokines as targets for the treatment of rheumatic diseases[J].Nat Rev Rheu?matol，2017，13（4）：217-233.DOI：10.1038/nrrheum.2017.22.

[5]WANG M，XIE ZJ，XU J，et al.TWEAK/Fn14 axis in respiratory dis?eases[J].Clin Chim Acta，2020，509：139-148.DOI：10.1016/j.cca.2020.06.007.

[6]XU MC，ZHANG F，WANG AX，et al.Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis promotes hepatic stellate cells migration via canoni?cal NF-κB/MMP9 pathway[J].PLoS One，2016，11（12）：e0167658.DOI：10.1371/journal.pone.0167658.

[7]WANG AX，ZHANG F，XU H，et al.TWEAK/Fn14 promotes pro-in?flammatory cytokine secretion in hepatic stellate cells via NF-κB/STAT3 pathways[J].Mol Immunol，2017，87：67-75.DOI：10.1016/j.molimm.2017.04.003.

[8]LIU YM，VERMA VK，MALHI H，et al.Lipopolysaccharide downregu?lates macrophage-derived IL-22 to modulate alcohol-induced hepato?cyte cell death[J].Am J Physiol Cell Physiol，2017，313（3）：C305-C313.DOI：10.1152/ajpcell.00005.2017.

[9]KONG XN，F(xiàn)ENG DC，WANG H，et al.Interleukin-22 induces he?patic stellate cell senescence and restricts liver fibrosis in mice[J].Hepatology，2012，56（3）：1150-1159.DOI：10.1002/hep.25744.

[10]LU DH，GUO XY，QIN SY，et al.Interleukin-22 ameliorates liver fibro?genesis by attenuating hepatic stellate cell activation and downregu?lating the levels of inflammatory cytokines[J].World J Gastroen?terol，2015，21（5）：1531-1545.DOI：10.3748/wjg.v21.i5.1531.

[11]ZHAO JJ，ZHANG Z，LUAN Y，et al.Pathological functions of inter?leukin-22 in chronic liver inflammation and fibrosis with hepatitis B vi?rus infection by promoting T helper 17 cell recruitment[J].Hepatol?ogy，2014，59（4）：1331-1342.DOI：10.1002/hep.26916.

[12]WU LY，LIU SH，LIU Y，et al.Up-regulation of interleukin-22 medi?ates liver fibrosis via activating hepatic stellate cells in patients with hepatitis C[J].Clin Immunol，2015，158（1）：77-87.DOI：10.1016/j.clim.2015.03.003.

[13]YAP KN，YAMADA K，ZIKELI S，et al.Evaluating endoplasmic reticu?lum stress and unfolded protein response through the lens of ecol?ogy and evolution[J].Biol Rev Camb Philos Soc，2021，96（2）：541-556.DOI：10.1111/brv.12667.

[14]JALAN R，CHIARA FD，BALASUBRAMANIYAN V，et al.Ammonia produces pathological changes in human hepatic stellate cells and is a target for therapy of portal hypertension[J].J Hepatol，2016，64（4）：823-833.DOI：10.1016/j.jhep.2015.11.019.

[15]ZHU J，WANG RW，XU T，et al.Salvianolic acid A attenuates endo?plasmic reticulum stress and protects against cholestasis-induced liver fibrosis via the SIRT1/HSF1 pathway[J].Front Pharmacol，2018，9：1277.DOI：10.3389/fphar.2018.01277.

[16]KIM RS，HASEGAWA D，GOOSSENS N，et al.The XBP1 arm of the unfolded protein response induces fibrogenic activity in hepatic stel?late cells through autophagy[J].Sci Rep，2016，6：39342.DOI：10.1038/srep39342.

[17]HU ML，YANG SL，YANG L，et al.Interleukin-22 alleviated palmitate-induced endoplasmic reticulum stress in INS-1 cells through activa?tion of autophagy[J].PLoS One，2016，11（1）：e0146818.DOI：10.1371/journal.pone.0146818.

[18]GULHANE M，MURRAY L，LOURIE R，et al.High fat diets induce co?lonic epithelial cell stress and inflammation that is reversed by IL-22[J].Sci Rep，2016，6：28990.DOI：10.1038/srep28990.

[19]ROEHLEN N，CROUCHET E，BAUMERT TF.Liver fibrosis：Mechanis?tic concepts and therapeutic perspectives[J].Cells，2020，9（4）：875.DOI：10.3390/cells9040875.

[20]ZHOU X，WANG Z，HE XR，et al.Research advances in signaling pathways associated with potential anti-liver fibrosis drugs and tar?gets[J].J Clin Hepatol，2023，39（12）：2932-2941.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.12.027.

周鑫，王智，何雪茹，等.潛在抗肝纖維化藥物與靶點(diǎn)相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2023，39（12）：2932-2941.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.12.027.

[21]WU Y，MIN J，GE C，et al.Interleukin 22 in liver injury，inflammation and cancer[J].Int J Biol Sci，2020，16（13）：2405-2413.DOI：10.7150/ijbs.38925.

[22]EL-SHORBAGY AA，SHAFAA MW，SALAH ELBELTAGY R，et al.Li?posomal IL-22 ameliorates liver fibrosis through miR-let7a/STAT3 signaling in mice[J].Int Immunopharmacol，2023，124（Pt B）：111015.DOI：10.1016/j.intimp.2023.111015.

[23]MENG YX，HUO LJ.Role of interleukin-22 in the development and progression of liver fibrosis[J].J Clin Hepatol，2021，37（12）：2924-2927.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2021.12.039.

孟昱希，霍麗娟.IL-22在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2021，37（12）：2924-2927.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2021.12.039.

[24]GUPTA RK，F(xiàn)UNG K，F(xiàn)IGUEROA DS，et al.Integrative keratinocyte responses to TWEAK with IL-13 and IL-22 reveal pathogenic tran?scriptomes associated with atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol，2024，144（5）：1071-1074.DOI：10.1016/j.jid.2023.11.009.

[25]NA M，YANG XB，DENG YK，et al.Endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of alcoholic liver disease[J].PeerJ，2023，11：e16398.DOI：10.7717/peerj.16398.

[26]NAGAR P，SHARMA P，DHAPOLA R，et al.Endoplasmic reticulum stress in Alzheimer’s disease：Molecular mechanisms and therapeu?tic prospects[J].Life Sci，2023，330：121983.DOI：10.1016/j.lfs.2023.121983.

[27]ZARAFSHANI M，MAHMOODZADEH H，SOLEIMANI V，et al.Expres?sion and clinical significance of IRE1-XBP1s，p62，and caspase-3 incolorectal cancer patients[J].Iran J Med Sci，2024，49（1）：10-21.DOI：10.30476/IJMS.2023.96922.2856.

[28]LIU L，ZHAO ML，JIN X，et al.Adaptive endoplasmic reticulum stress signalling via IRE1α-XBP1 preserves self-renewal of haemato?poietic and pre-leukaemic stem cells[J].Nat Cell Biol，2019，21（3）：328-337.DOI：10.1038/s41556-019-0285-6.

[29]MAIERS JL，KOSTALLARI E，MUSHREF M，et al.The unfolded pro?tein response mediates fibrogenesis and collagen I secretion through regulating TANGO1 in mice[J].Hepatology，2017，65（3）：983-998.DOI：10.1002/hep.28921.

[30]ABDELFATTAH AM，MAHMOUD SS，EL-WAFAEY DI，et al.Dia?cerein ameliorates cholestasis-induced liver fibrosis in rat via modu?lating HMGB1/RAGE/NF-κB/JNK pathway and endoplasmic reticu?lum stress[J].Sci Rep，2023，13（1）：11455.DOI：10.1038/s41598-023-38375-4.

收稿日期：2024-03-03；錄用日期：2024-05-17

本文編輯：林姣

引證本文：GAO J， CHEN H， LIU Y， et al. Effect of interleukin22 on hepatic stellate cell activation and its mechanism[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（11）： 2229-2237.

高君， 陳歡， 劉燕， 等. 白細(xì)胞介素22對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響及 其機(jī)制[J]. 臨床肝膽病雜志， 2024， 40（11）： 2229-2237.