基于高效液相色譜法檢測鯽肌肉中5種氟喹諾酮類藥物

摘要：為檢測鯽肌肉中5種氟喹諾酮類（FQs）藥物（諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹）的殘留量，建立了一種高效液相色譜檢測方法。本方法使用T3色譜柱，流動相為01%的甲酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脫法，利用熒光檢測器檢測。結(jié)果表明5種氟喹諾酮類藥物在001～200 μg/mL藥物濃度條件下有良好線性關(guān)系（r2gt;0999）；5種藥物的檢出限為006～013 μg/kg；定量限為018～038 μg/kg；藥物回收率為9227%～11476%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為141%～850%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，滿足氟喹諾酮類藥物的檢測要求，可為水產(chǎn)品中FQs的檢測和研究提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：鯽；氟喹諾酮；高效液相色譜

中圖分類號：TS2547文獻標(biāo)識碼：A

作為人工合成的新型抗菌藥物，氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物具有抗菌作用強、抗菌譜廣、高效、低毒、半衰期較長、用藥次數(shù)少等特點，目前被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)［1-3］。中國是漁業(yè)大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖水域廣闊，水產(chǎn)品種類豐富，水產(chǎn)品產(chǎn)量持續(xù)上升［4］。然而，隨著FQs在水生生物養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，水產(chǎn)品體內(nèi)藥物殘留情況也愈發(fā)嚴(yán)重，這對人類生命健康構(gòu)成了一定的風(fēng)險［5］。因此，對水產(chǎn)品開展FQs藥物殘留檢測，對嚴(yán)控水產(chǎn)品質(zhì)量和保障人民食品安全具有重要意義。目前水產(chǎn)品藥物殘留檢測方法主要有色譜法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)傳感器法和光譜法等［6-7］，這些方法各有特點，適用于不同要求和目的的檢測項目。色譜法中的高效液相色譜法（HPLC）因其具有強大的分離能力和極高的靈敏度，是一種藥物檢測的經(jīng)典方法。

我國于2021年發(fā)布了關(guān)于液相色譜法測定水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)（GB 316563—2021）［8］，本研究以《GB 316563—2021》為基礎(chǔ)，通過改變色譜柱類型、流動相等進行試驗，用熒光檢測器的高效液相色譜儀梯度洗脫檢測，測定水產(chǎn)品中FQs殘留，旨在拓展和優(yōu)化當(dāng)前已有的檢測方法，提高檢測精度和效率，為后續(xù)水產(chǎn)品中FQs類藥物的研究和檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

11 材料與儀器

供試樣本：鯽，來自江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所。

藥品：諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹5種藥物標(biāo)準(zhǔn)品均為Stanford Analytical Chemical Inc生產(chǎn)。其中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氟甲喹純度均為99%，恩諾沙星和噁喹酸純度均為98%。

試劑：甲醇（Honeywell，GR）、乙腈（Honeywell，GR）、正己烷（Honeywell，GR）、甲酸（Honeywell，GR）、洗脫液（氨水＋甲醇，體積比為1∶3）；酸化乙腈溶液：取乙腈250 mL，加鹽酸溶液2 mL，充分混勻；乙腈飽和正己烷溶液：取正己烷200 mL于250 mL分液漏斗中，加適量乙腈后劇烈振蕩，待分配平衡后，棄乙腈層即得。

儀器：液相色譜儀（Agilent 8890）、分析天平（EX125DZH）、氮吹儀（HSC-24B）、高速離心機（TG10K）、固定式混勻儀（MX-F）和旋蒸儀（RE100-S）。

12 方法

121 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：稱取環(huán)丙沙星和恩諾沙星各001 g（精確至00001 g，下同），分別用色譜純級甲醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液；取諾氟沙星001 g，用01 mol/L鹽酸溶液10 mL使其溶解，用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液；取噁喹酸和氟甲喹各001 g，用01 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL使其溶解，分別用乙腈稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配置成100 μg/mL的母液。以上儲備液均4℃冷藏保存，有效期3個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）：量取5種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用01%的甲酸溶液稀釋至刻度，配制成10 μg/mL 5種藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別準(zhǔn)確吸取一定量的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作液于6個容量瓶中，用01%的甲酸溶液稀釋成濃度為001、005、010、050、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個容量瓶中5種藥物的濃度保持一致。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

122 檢出限和定量限

檢出限：根據(jù)儀器的信噪比（I/N）來計算方法的檢出限，計算公式為：

123 樣品前處理

取鯽背部肌肉5 g（準(zhǔn)確至±002 g），加酸化乙腈溶液20 mL、無水硫酸鈉10 g，高速均質(zhì)2 min，3000 r/min離心5 min，取上清液至分液漏斗，用酸化乙腈溶液20 mL重復(fù)提取2次后合并上清液。加乙腈飽和正己烷溶液60 mL，振蕩20 min后靜置，取下層乙腈至梨形瓶，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加磷酸鹽緩沖液4 mL，超聲振蕩1 min，靜置30 s，溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管。再重復(fù)提取殘余物2次，溶液轉(zhuǎn)移至同一離心管，合并3次殘余物溶解液，3000 r/min離心5 min，取上清液。取上清液過活化后的C18固相萃取柱，用3 mL水淋洗，抽干后加洗脫液5 mL，使用氮吹儀在50℃下吹干，加1 mL 01%的甲酸溶液溶解，過022 μm微孔濾膜后備用。

124 回收率和精密度

取5 g（準(zhǔn)確至±002 g）鯽肌肉樣品4份，其中1份為空白檢測樣，3份為測試樣。向每份測試樣中加入諾氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)工作液，使諾氟沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹在每份測試樣中的濃度分別為6、12、100 μg/kg；向測試樣中加入環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，使環(huán)丙沙星在每份測試樣中的濃度分別為5、10、100 μg/kg。按照“123”前處理方法處理空白檢測樣和測試樣后上機檢測。

每份樣品平行測定6次，計算樣品回收率，其計算公式為：

2 結(jié)果與分析

21 色譜分離

諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹在本色譜條件下的出峰時間分別為：9695、10534、13064、23186和24091 min，具體見圖1，結(jié)果表明，5種氟喹諾酮類藥物可以獲得良好的分離和峰型，并且樣品中其余雜峰對主峰基本無干擾。

22 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以藥物濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），得出5種氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸、氟甲喹的回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)見表3，5種藥物濃度和峰面積在001～200 μg/mL呈現(xiàn)出線性關(guān)系（r2gt;0999）。不同藥物濃度下色譜圖如圖2所示。

23 檢出限和定量限

當(dāng)進樣量為10 μL，濃度為001 μg/mL時，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹的信噪比（S/N）分別為726、476、988、609和931。檢出限和定量限結(jié)果如表4所示，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹檢出限分別為008、013、006、010和006 μg/kg，定量限分別為025、038、018、030和019 μg/kg。

24 回收率和精密度

環(huán)丙沙星在5、10、100 μg/kg添加水平下的加標(biāo)回收率分別為9650%～11476%；諾氟沙星在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標(biāo)回收率分別為9324%～11366%；恩諾沙星在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標(biāo)回收率分別為9227%～10705%；噁喹酸在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標(biāo)回收率分別為10672%～11464%；氟甲喹在6、12、100 μg/kg添加水平下的加標(biāo)回收率分別為9519%～10715%，具體見表5。諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、噁喹酸和氟甲喹的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為141%、486%、850%、141%和421%，具體見表6。結(jié)果表明回收率穩(wěn)定，精密度可滿足檢測需要。

25 樣品測定結(jié)果

本實驗的水產(chǎn)品樣品測定結(jié)果見表7，鯽背部肌肉中未檢測出諾氟沙星、環(huán)丙沙星、噁喹酸和氟甲喹，恩諾沙星檢測結(jié)果為35540 μg/kg。

3 討論

不同的流動相對藥物分離效果有著直接影響，本研究采用01%的甲酸水溶液和乙腈作為流動相，5種氟喹諾酮類藥物分離效果較好。馮濤等［9］以pH=30的甲酸水溶液（002%）和乙腈作為流動相，環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星等4種氟喹諾酮類藥物有著較好的分離度。蘭承興等［10］采用四丁基溴化銨和乙腈作為流動相，結(jié)果表明4種氟喹諾酮類藥物的方法回收率和分離效果較好。這說明檢測過程中pH值、流動相種類及其比例不是固定不變的，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和多次試驗才能優(yōu)化藥物分離效果，后續(xù)研究可以考慮通過調(diào)整以上色譜條件，摸索出可分離更多種FQs藥物、用時更短的色譜方法。

本研究利用T3色譜柱進行檢測，與C18色譜柱相比，T3色譜柱具有更寬的pH值適用范圍，具備應(yīng)對復(fù)雜、多組分樣品分離的能力，而本研究中流動相為01%甲酸溶液，選擇T3色譜柱也能較大程度降低對色譜柱的損害。T3色譜柱已經(jīng)被應(yīng)用于多種化學(xué)藥物殘留檢測領(lǐng)域，比如測定畜禽肉及內(nèi)臟中的新生霉素、莫匹羅素、豐加霉素和茴香霉素［11］，化妝品中葡糖酸、葡糖酸內(nèi)酯和乳糖酸［12］，保健品中的脂溶性維生素［13］等藥物。

本研究選用T3色譜柱，以甲酸和乙腈為流動相對鯽背部肌肉中的5種FQs藥物進行測定，分離效果好，檢測靈敏度高，基線平穩(wěn)，且流動相配制簡單，適用于實際工作中水產(chǎn)品中FQs物質(zhì)的檢測。

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