基于邏輯門的鄰位核酸熒光傳感器同時(shí)檢測(cè)凝血酶和肌紅蛋白

摘要 基于分裂適配體的靶標(biāo)識(shí)別能力和分子邏輯門的智能分析能力，將兩種分裂適配體整合到“AND”邏輯門中，構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感器，用于凝血酶（Tob）和肌紅蛋白（Myo）的同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)僅存在一種目標(biāo)物時(shí)，信號(hào)的響應(yīng)為單一熒光輸出信號(hào)，可作為早期低風(fēng)險(xiǎn)判斷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)兩種目標(biāo)物同時(shí)存在時(shí)，分裂適配體與目標(biāo)物結(jié)合，形成三元復(fù)合物，分別導(dǎo)致首尾的鄰位核酸效應(yīng)，同時(shí)觸發(fā)G-四鏈體增強(qiáng)硫磺素T 熒光信號(hào)和Cyanine 3 的熒光信號(hào)猝滅，可作為早期高風(fēng)險(xiǎn)判斷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。在優(yōu)化條件下， 本方法檢測(cè)Tob 的線性范圍為3～200 nmol/L， 相關(guān)系數(shù)為0.9931， 檢出限（LOD）為0.97 nmol/L；檢測(cè)Myo 的線性范圍為6～400 nmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.9933， LOD 為2.14 nmol/L。將本方法應(yīng)用于臨床血清樣本中Tob 和Myo 的同時(shí)測(cè)定，加標(biāo)回收率分別為85.4%～118.3%和85.8%～119.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果相比，本方法的相對(duì)誤差的范圍為–8.8%～5.6%。此外， 4 例血清樣品的邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)2 例，低風(fēng)險(xiǎn)2 例。本研究提出的“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法具有選擇性高、快速、準(zhǔn)確和可同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，為急性心肌梗死早期診斷提供了重要參考，也為生物標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)提供了一種通用性檢測(cè)設(shè)計(jì)思路和平臺(tái)。

關(guān)鍵詞 邏輯門；分裂適配體；同時(shí)檢測(cè)；凝血酶；肌紅蛋白

心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成殘疾和死亡率最高的疾病之一，而急性心肌梗死發(fā)病前無(wú)癥狀是心血管疾病死亡率高的原因[1-2]。因此，快速和準(zhǔn)確診斷急性心肌梗死對(duì)于挽救患者生命、提高患者生命質(zhì)量至關(guān)重要。肌紅蛋白（Myoglobin， Myo）是心肌梗死的生物標(biāo)志物，是心肌損傷后首先釋放的蛋白質(zhì)，在急性心肌梗死的早期診斷中發(fā)揮了重要作用[3]。凝血酶（Thrombin， Tob）是一種重要的多功能酶，與血管損傷后形成血栓密切相關(guān)[4]。血栓形成可能導(dǎo)致血管閉塞和血流量減少，影響下游器官的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌梗死[5]。因此， Tob 可作為急性心肌梗死早期的輔助診斷標(biāo)志物。大多數(shù)疾病都具有多個(gè)生物標(biāo)志物，對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)不僅可縮短檢測(cè)時(shí)間，而且可更準(zhǔn)確地診斷疾病。因此，構(gòu)建一種快速、準(zhǔn)確和同時(shí)檢測(cè)Myo 和Tob 的生物傳感器具有非常重要的意義。

目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的用于生物標(biāo)志物定量分析的方法主要是免疫分析法。其中，放射免疫分析法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在放射性污染[6]；化學(xué)發(fā)光免疫分析法靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，但成本相對(duì)較高[7]；熒光免疫分析法以其良好的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度而備受關(guān)注[8]，但是，大部分的熒光免疫分析法只能檢測(cè)單一的生物標(biāo)志物，不能滿足目前的臨床診斷需求，尤其是在心血管疾病早期診斷的準(zhǔn)確性方面尚存在不足。因此，綜合多個(gè)標(biāo)志物的定量分析結(jié)果可以提供更全面的特征信息，有助于早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)識(shí)別心血管疾病，從而提高篩查的有效性和可靠性。

基于核酸的生物傳感策略通常由識(shí)別、信號(hào)傳輸和信號(hào)轉(zhuǎn)化等多模塊單元組成。適配體是一種單鏈寡核苷酸序列，對(duì)目標(biāo)物具有高選擇性[9]。分裂適配體通常指從一條完整適配體鏈中間的某處截?cái)酁閮蓷l適配體鏈，當(dāng)目標(biāo)物不存在時(shí)，兩條鏈單獨(dú)存在；當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，兩條鏈同時(shí)結(jié)合在目標(biāo)物上，可以呈現(xiàn)與完整適配體類似的構(gòu)象[9-10]。與完整的適配體相比，分裂適配體的長(zhǎng)度更短，二級(jí)結(jié)構(gòu)更少，在傳感中不易產(chǎn)生非特異性信號(hào)[11]。分子邏輯門是通過接收一個(gè)（或多個(gè)）化學(xué)過程作為輸入，并產(chǎn)生一個(gè)（或多個(gè)）容易檢測(cè)的分析信號(hào)作為輸出來(lái)實(shí)施邏輯運(yùn)算的信號(hào)傳輸策略[12]。分子邏輯門能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析物，簡(jiǎn)化分析程序，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，滿足臨床“快速篩查”的需求，在智能生物傳感領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[13-14]。迄今為止，已有電化學(xué)[15-16]、比色[17-18]、熒光[19]和其它類型的分子邏輯門用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分析物的報(bào)道。但是，這些方法通常需要繁瑣的洗滌步驟或復(fù)雜的擴(kuò)增反應(yīng)。鄰位效應(yīng)（Proximity effect）是指目標(biāo)物與兩個(gè)親和配體的結(jié)合使互補(bǔ)的寡核苷酸聚集，從而顯著增加其局部濃度[20-21]。鄰位效應(yīng)已被應(yīng)用于開發(fā)多種生物傳感器，具有快速、選擇性強(qiáng)和免洗滌等優(yōu)點(diǎn)[21]。

本研究將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時(shí)整合到“AND”邏輯門中，構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感檢測(cè)技術(shù)。由于Tob 和Myo 分別具有兩個(gè)分裂適配體，將其中一條分裂適配體單元通過poly-A 序列相連，從而將兩種識(shí)別模塊整合到同一個(gè)核酸電路結(jié)構(gòu)中。當(dāng)僅存在一種目標(biāo)物時(shí)，信號(hào)的響應(yīng)為單一熒光輸出信號(hào)；兩個(gè)目標(biāo)物同時(shí)存在時(shí)，分裂適配體與目標(biāo)物結(jié)合，形成三元復(fù)合物，分別導(dǎo)致首尾的鄰位核酸效應(yīng)，同時(shí)觸發(fā)G-四鏈體（G4）增強(qiáng)硫磺素T（Thioflavin T， ThT）熒光信號(hào)和Cyanine 3（Cy3）的熒光信號(hào)猝滅?！癆ND”邏輯運(yùn)算能夠同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo，可為急性心肌梗死早期診斷提供重要參考，也為生物標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)提供了一種通用性檢測(cè)平臺(tái)和設(shè)計(jì)思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FA1604 電子天平（上海天平儀器廠）；ZWYR-240 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；RF-5301PC 熒光分光光度計(jì)（日本島津醫(yī)療器械有限公司）；HE-120 Tanon 電泳儀（上海天能生命科學(xué)有限公司）；DigiGenius 凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene 公司）。

ThT 和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Tob 和Myo（人源，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；人凝血酶和肌紅蛋白酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（96 孔，武漢華美生物工程有限公司）；NaCl、CaCl2 和MgCl2（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。HEPES 緩沖溶液（pH 7.0）含20 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2 和120 mmol/L NaCl。寡核苷酸（HPLC 純化，上海生工生物科技有限公司）序列（５′→３′）如下：

P1：BHQ2-ACACCCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTTTTTTTTTTGGGTTGGG/isp9/GGTTGGTG

P2：TGGTTGG/isp9/GGGTAGGG

P3：TGCTGCGTTGTTCCGAGTGT-Cy3

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳

分別按邏輯輸入（0， 0）、（1， 0）、（0， 1）和（1， 1）的試劑順序添加寡核苷酸和待測(cè)物溶液，孵育60 min。分別將10 μL 上述溶液與2 μL 6×DNA 上樣緩沖溶液（pH 7.6，含溴酚藍(lán)、乙二胺四乙酸和甘油）混合，室溫孵育10 min，注入2%瓊脂糖凝膠（含Super red 染料），在1×Tris-Acetate-EDTA（TAE， pH 8.0）緩沖溶液中于100 V 恒壓下電泳70 min，采用DigiGenius 凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳后的凝膠。

1.2.2 定量檢測(cè)

鄰位核酸探針P1、P2 和P3 分別用HEPES 緩沖溶液稀釋成1.5、1.0 和1.0 μmol/L 的工作液。將P1溶液于95 ℃水浴孵育5 min，自然冷卻至室溫。將20 μL P1、20 μL P2、20 μL P3 和10 μL Tob 標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或10 μL Myo 標(biāo)準(zhǔn)溶液、20 μL 40 μmol/L 的ThT 溶液依次加入到0.6 mL 離心管中，加入HEPES 緩沖溶液至溶液總體積為200 μL；渦旋混勻，在37 ℃恒溫?fù)u床中避光孵育60 min。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定溶液的熒光發(fā)射光譜，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm，狹縫為10 nm。測(cè)量此溶液體系分別在483 和563 nm處的熒光強(qiáng)度（FTob 和FMyo），以相同體積的超純水代替Tob 和Myo 作為空白對(duì)照，并測(cè)定熒光強(qiáng)度（F0）。

1.2.3 實(shí)際樣品分析

血液樣本由廣東藥科大學(xué)附屬醫(yī)院提供，相關(guān)研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者知情同意。靜脈取血于無(wú)抗凝劑的采血管中，室溫靜置4 h，待血液完全凝結(jié)后， 1600 g （3700 r/min）離心10 min，將上層血清小心轉(zhuǎn)移至新離心管中， 8000 g （8400 r/min）離心20 min，再將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，于–20 ℃保存。測(cè)定時(shí)，將血清樣品用PBS 緩沖溶液稀釋至合適濃度，按照1.2.2 節(jié)中的方法進(jìn)行定量檢測(cè)。

作為對(duì)比，血清樣品分別用Tob 和Myo 的商業(yè)ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 “AND”邏輯門的檢測(cè)原理

與完整適配體相比，分裂適配體的結(jié)合能力幾乎不受影響[22]，其序列較短，適用于設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物的新型邏輯門策略。Tob 分裂適配體的解離常數(shù)（Kd）約為100 nmol/L[23]， Myo 分裂適配體的Kd≈5 nmol/L[24]，表明兩種分裂適配體與目標(biāo)物有較強(qiáng)的親和力。由圖1A 可見， P1 探針由Tob 分裂適配體（紅色）、分裂G4 序列（紫色）以及猝滅劑（BHQ2）標(biāo)記Myo 分裂適配體（藍(lán)色）構(gòu)成。P2 探針由Tob 分裂適配體序列（紅色）和分裂G4 序列（紫色）組成。P3 探針由Cy3 熒光探針（發(fā)射波長(zhǎng)：563 nm）標(biāo)記Myo 分裂適配體序列（藍(lán)色）組成。ThT 可與完整的G4 結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為483 nm， ThT 和Cy3 兩種熒光報(bào)告分子的最大發(fā)射波長(zhǎng)間隔為80 nm，發(fā)射峰區(qū)分明顯，可用于兩種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)。

“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感器的檢測(cè)原理、邏輯電路和真值表分別如圖1A、圖1B 和圖1C所示。如圖1B 所示，此“AND”邏輯門以Tob 和Myo 濃度為輸入，熒光信號(hào)變化為輸出，以真值“0”（低風(fēng)險(xiǎn)）和“1”（高風(fēng)險(xiǎn)）表示邏輯判斷。當(dāng)Tob 和Myo 都不存在時(shí)，即輸入為（0， 0）時(shí)， P1 探針的Tob 分裂適配體和P2 探針的Tob 分裂適配體不結(jié)合， P1 和P2 探針無(wú)法有效結(jié)合形成G4 結(jié)構(gòu)，此時(shí)ThT 的熒光值較低。同時(shí)， P1 探針與P3 探針同樣距離較遠(yuǎn)， Cy3 由于無(wú)法發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET），熒光值較高，此時(shí)輸出為0（低風(fēng)險(xiǎn)）。當(dāng)僅存在Tob 時(shí)，輸入為（1， 0）， P1 探針和P2 探針的Tob 分裂適配體與Tob 緊密結(jié)合，形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致末端分裂的G4 序列鄰位效應(yīng)，形成G4 結(jié)構(gòu)，后者與ThT 結(jié)合，在483 nm 處熒光值增加，此時(shí)輸出也為0（低風(fēng)險(xiǎn)）。當(dāng)僅存在Myo 時(shí)，輸入為（0， 1）， P1 探針和P3 探針的Myo 分裂適配體序列與Myo 形成三元復(fù)合物， Cy3和BHQ2 發(fā)生FRET 使得Cy3 在563 nm 處的熒光值降低，此時(shí)輸出也為0（低風(fēng)險(xiǎn)）。當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí)，輸入為（1， 1）， P1 和P2 探針中的Tob 分裂適配體與Tob 結(jié)合形成G4 結(jié)構(gòu)， ThT 在483 nm 處的熒光信號(hào)增強(qiáng)；同時(shí)， P1 和P3 探針中的Myo 分裂適配體與Myo 結(jié)合，導(dǎo)致Cy3 熒光信號(hào)被猝滅，在563 nm 處的熒光信號(hào)降低，此時(shí)輸出為1（高風(fēng)險(xiǎn)），提示急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)較高。

2.2 “AND”邏輯門的可行性研究

研究了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 的可行性。熒光發(fā)射光譜圖如圖2A所示，圖2B 是483 和563 nm 處對(duì)應(yīng)的熒光峰值。當(dāng)Tob 和Myo 均不存在時(shí)，輸入為（0， 0）， 483 nm 處的熒光峰值較低， 563 nm 處熒光峰值較高；僅存在Tob 時(shí)，輸入為（1， 0）， 483 nm 處的熒光峰值增加，563 nm 處熒光峰值不變；僅存在Myo 時(shí)，輸入為（0， 1）， 483 nm 處熒光峰值不變， 563 nm 處熒光峰值降低；只有當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí)，輸入為（1， 1）， 483 nm 處熒光峰值增加， 563 nm 處熒光峰值降低，說明采用此“AND”邏輯門同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 可行。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證了此“AND”邏輯門策略同時(shí)檢測(cè)的可行性。如圖2C 所示，對(duì)于泳道a，當(dāng)Tob 和Myo 均不存在時(shí)，出現(xiàn)3 個(gè)游離的DNA 條帶；對(duì)于泳道b，僅存在Tob 時(shí)，出現(xiàn)了P1 和P2 與Tob 的結(jié)合條帶（藍(lán)框）；對(duì)于泳道c，僅存在Myo 時(shí)，出現(xiàn)了P1 和P3 與Myo 的結(jié)合條帶（黃框）；對(duì)于泳道d，當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí)，出現(xiàn)了P1、P2、P3、Tob 和Myo 的結(jié)合條帶（綠框）。上述結(jié)果進(jìn)一步說明采用此邏輯門策略同時(shí)檢測(cè)Tob和Myo 可行。

2.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的分析性能，優(yōu)化了用于Tob 和Myo 檢測(cè)的適配體濃度和孵育時(shí)間等條件。首先，考察了不同濃度的P1（0.1、0.5、1.0、1.5 和2.0 μmol/L）對(duì)Tob 熒光強(qiáng)度差值（FTob–F0）的影響。如圖3A 所示，隨著P1 濃度增大，分裂適配體與Tob 的結(jié)合增加，形成的G4 增多， G4 與ThT 結(jié)合，熒光信號(hào)增強(qiáng)；P1 濃度達(dá)到1.5 μmol/L 時(shí)， FTob–F0 最大；隨著P1 濃度繼續(xù)增加， FTob–F0 略降，這可能是空白值增加所致?？疾炝朔跤龝r(shí)間（10、20、40、60 和90 min）對(duì)FTob–F0 的影響。如圖3B 所示，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，分裂適配體與Tob 的結(jié)合增加， FTob–F0 增大，孵育時(shí)間為60 min 時(shí)， FTob–F0 達(dá)到最大，此后基本保持穩(wěn)定。

考察了P1 與P3 的濃度比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1 和3∶1）對(duì)Myo 熒光強(qiáng)度差值（F0–FMyo）的影響。如圖3C 所示，隨著P1 與P3 的濃度比增大，分裂適配體與Myo 的結(jié)合增多，導(dǎo)致Cy3 和BHQ2 發(fā)生的FRET 效應(yīng)增強(qiáng)，熒光信號(hào)降低， F0–FMyo 增大；當(dāng)P1 與P3 的濃度比增至1.5∶1， F0–FMyo 變化不大，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇1.5∶1 作為最佳適配體濃度比?？疾炝薖1 和P3 與Myo 反應(yīng)的孵育時(shí)間（10、20、40、60 和90 min）對(duì)F0–FMyo 的影響。如圖3D 所示，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)， F0–FMyo 增大，在60 min 時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，說明反應(yīng)已基本完全。最終確定P1、P2 和P3 探針的最優(yōu)濃度分別為1.5、1.0 和1.0 μmol/L，最優(yōu)孵育時(shí)間為60 min。

2.4 方法的分析性能

2.4.1 分析參數(shù)

在最優(yōu)的反應(yīng)條件下，考察了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法的分析性能。如圖4A 所示，隨著Tob 濃度增大， 483 nm 處的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。483 nm 處熒光強(qiáng)度與Tob 濃度的關(guān)系如圖4B 所示，在3～200 nmol/L 濃度范圍內(nèi)， Tob 濃度與熒光強(qiáng)度的差值呈線性關(guān)系，線性方程為FTob–F0=2.65CTob+3.66，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9931，計(jì)算得到檢出限（LOD， S/N=3）為0.97 nmol/L。健康人血液中幾乎不含Tob，在凝血過程中， Tob 的濃度能夠達(dá)到nmol/L 水平[25]，因此，此策略能滿足對(duì)Tob 臨床診斷的要求。如圖4A 所示，隨著Myo 濃度增大， 563 nm 處的熒光信號(hào)逐漸降低。熒光強(qiáng)度差值與不同濃度Myo 的關(guān)系如圖4C所示，在6～400 nmol/L 濃度范圍內(nèi)， Myo 濃度與熒光差值呈線性關(guān)系，線性方程為F0–FMyo=0.53CMyo+11.49（r=0.9933）， LOD 為2.14 nmol/L，明顯低于正常人閾值（36 nmol/L）[26]，滿足對(duì)Myo 臨床檢測(cè)的要求。

2.4.2 選擇性和穩(wěn)定性

選擇性是評(píng)估分析性能的另一個(gè)關(guān)鍵因素。為了評(píng)價(jià)此傳感器同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 的選擇性，分別加入100 μmol/L K+、1 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Ca2+、10 μmol/L Fe3+、1 μmol/L血紅蛋白（Hb）、1 mmol/L葡萄糖氧化酶（GO）、1 μmol/L C-反應(yīng)蛋白（CRP）、1 μmol/L溶菌酶（LZM）、1 mmol/L 人血清白蛋白（HSA）、1 mmol/L 免疫球蛋白G（IgG）、50 nmol/L Tob 和100 nmol/L Myo 及其混合物，測(cè)定被測(cè)物加入前后傳感器的熒光峰值變化。如圖5A 所示，共存物質(zhì)K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Hb、GO、CRP、LZM、HSA 和IgG存在時(shí)的熒光強(qiáng)度差值均很低。此外，其混合物的熒光強(qiáng)度差值與Tob 和Myo 的結(jié)果無(wú)顯著差異，說明此傳感方法對(duì)Tob 和Myo 具有良好的選擇性。

為了進(jìn)一步評(píng)估傳感器的穩(wěn)定性，對(duì)3 個(gè)不同濃度水平（10、50 和100 nmol/L）的Tob 和Myo 進(jìn)行了5 次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果如圖5B 所示，此傳感器檢測(cè)Tob 和Myo 的RSDs 分別為4.3%～8.4%和3.2%～7.2%，說明此傳感方法檢測(cè)Tob 和Myo 具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品分析

為了評(píng)價(jià)建立的方法在實(shí)際樣品中的分析性能，采用此方法同時(shí)檢測(cè)臨床血清中的Tob 和Myo。如表1 所示， 1 號(hào)樣品和2 號(hào)樣品中Tob 濃度為9.68 和10.93 nmol/L，3 號(hào)樣品和4 號(hào)樣品未檢出。1 號(hào)樣品和2 號(hào)樣品中Myo 濃度為50.47 和36.92 nmol/L，超過正常值（36 nmol/L）， 3 號(hào)樣品和4 號(hào)樣品未檢出。血清樣品1 和2 中Tob 和Myo 濃度均超過正常閾值，邏輯判斷為1，邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)。樣品3 和4 中Tob 和Myo 濃度均未檢出，邏輯判斷為0，邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死低風(fēng)險(xiǎn)。此外，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行單一目標(biāo)物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)得Tob 和Myo 的加標(biāo)回收率分別為85.4%～118.3%和85.8%～119.9%， RSD 分別小于5.9%和6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 檢測(cè)Tob 和Myo 的結(jié)果進(jìn)行比較，相對(duì)誤差范圍為–8.8%～5.6%， RSD 小于7.9%，說明本方法的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 一致。然而， ELISA方法檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)物的時(shí)間需要180 min，本方法在60 min 內(nèi)即可完成兩個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)，顯著縮短了分析時(shí)間。

3 結(jié)論

將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時(shí)整合到“AND”邏輯門中，構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感方法，用于Tob 和Myo 的同時(shí)檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，本方法檢測(cè)Tob 的線性范圍為3～200 nmol/L， LOD 為0.97 nmol/L；檢測(cè)Myo 的線性范圍為6～400 nmol/L， LOD 為2.14 nmol/L。將此傳感器應(yīng)用于臨床血清樣本分析， Tob 和Myo 的回收率分別在85.4%～118.3%和85.8%～119.9%之間， RSD 均小于6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 的測(cè)定結(jié)果相比，相對(duì)誤差范圍為–8.8%～5.6%。4 例血清樣品的邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)2 例，低風(fēng)險(xiǎn)2 例。此外，此方法能夠在60 min 內(nèi)對(duì)兩種生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，縮短了分析時(shí)間。此適體傳感器具有選擇性高、穩(wěn)定性好、快速、準(zhǔn)確和可同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，在急性心肌梗死疾病標(biāo)志物的快速檢測(cè)和多重篩查方面具有極大的應(yīng)用潛力。

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國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 22134007）和廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2024A1515011077）資助。