芍藥苷對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制

摘要：目的 探討芍藥苷（PF）保護(hù)棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法 使用濃度為250 μmol/L的PA刺激HepG2細(xì)胞來建立非酒精性脂肪性肝病模型，濃度為10 μmol/L的Compound C作為抑制劑，濃度為25 μmol/L的PF進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗分為5組：正常組（CON組）使用完全培養(yǎng)基處理，模型組（MOD組）使用PA處理，PF治療組（MOD+PF組）使用PA+PF處理，模型加抑制劑組（MOD+COM組）使用PA+Compound C處理，模型加抑制劑加PF組（MOD+COM+PF組）使用PA+Compound C+PF處理。使用試劑盒檢測細(xì)胞脂質(zhì)沉積指標(biāo)、肝功能指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥指標(biāo)，油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況，Western Blot法檢測細(xì)胞中AMP活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1、LC3、P62蛋白表達(dá)。計量數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey’s檢驗。結(jié)果 與MOD組相比，PF改善了細(xì)胞中TC、TG水平（P值均lt;0.05），降低了細(xì)胞中ALT、AST、C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6水平（P值均lt;0.05），升高了細(xì)胞中SOD、CAT活性及GSH水平，降低了MDA水平（P值均lt;0.05）。油紅O染色結(jié)果顯示，PF減輕了細(xì)胞脂質(zhì)沉積。Western Blot結(jié)果顯示，與MOD相比，PF升高了p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)，降低了p-mTOR、P62蛋白表達(dá)（P值均lt;0.05）。結(jié)論 PF可抑制PA誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善脂質(zhì)沉積，促進(jìn)細(xì)胞自噬，具體作用可能是通過AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝?。簧炙庈?；Hep G2細(xì)胞

基金項目：國家自然科學(xué)基金（82205086）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項重點(diǎn)課題（2022JDZX006）；河南省衛(wèi)生健康委員會課題（2022JDZX114）；河南省科技攻關(guān)項目（232102310438）

Study on the protective efect and mechanism of paeoniflorin on palmitic acid-induced HepG2 cells

LIU Tong 1，2 ，LI Shanzheng 1，2 ，ZHOU Cheng 1，2 ，LIU Sutong 1 ，ZHANG Lihui 1 ，ZHAO Wenxia 1

1. Department of Hepatobiliary，Spleen and Stomach Diseases，The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，China；2. The First Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou450046，China

Corresponding author：ZHAO Wenxia，zhao-wenxia@163.com （ORCID：0000-0001-6666-9469）

Abstract：Objective To investigate the role and mechanism of action of paeoniflorin （PF） in protecting HepG2 cells induced by palmitic acid （PA）. Methods HepG2 cells were stimulated with PA at a concentration of 250 μmol/L to establish a NAFLD model. Compound C at a concentration of 10 μmol/L was used as an inhibitor，and PF at a concentration of 25 μmol/L was used for intervention. The experiment was divided into normal group （CON group） treated with complete culture medium，model group（MOD group） treated with PA，PF treatment group （MOD+PF group） treated with PA and PF，model+inhibitor group （MOD+COM group） treated with PA and Compound C，and model+inhibitor+PF group （MOD+COM+PF group） treated with PA，Compound C，and PF. Kits were used to measure lipid deposition indicators，liver function parameters，oxidative stress indicators，and inflammation indicators；oil red O staining was used to observe lipid deposition；Western Blot was used to measure the protein expression levels of AMPK，SIRT1，PGC-1α，mTOR，Beclin-1，LC3，and P62 in cells. The one-way analysis of variance was used for comparison of quantitative data between groups，while the Tukey’s test was used for comparison between two groups.Results Compared with the MOD group，PF improved the levels of TC and TG （Plt;0.05），reduced the levels of ALT，AST，CRP，TNF-α，IL-1β，and IL-6 （Plt;0.05），increased the activity of SOD and CAT and the level of GSH，and reduced the level of MDA in cells （all Plt;0.05）. Oil red O staining showed that PF alleviated lipid deposition in cells. Western blot results showed that compared with the MOD group，PF increased the protein expression levels of p-AMPK，SIRT1，PGC-1α，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，and Beclin-1and reduced the protein expression levels of p-mTOR and P62 （all Plt;0.05）. Conclusion PF can inhibit PA-induced oxidative stress and inflammatory response in HepG2 cells，improve lipid deposition，and promote autophagy via the AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR signaling pathway.

Key words：Non-alcoholic Fatty Liver Disease；Paeoniflorin；Hep G2 Cells

Research funding：National Natural Science Foundation of China （82205086）；Key Project of Traditional Chinese Medicine Science Research in Henan Province （2022JDZX006）；Project of Henan Provincial Health Commission （2022JDZX114）；Henan Province Science and Technology Attack Fund （232102310438）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特征是肝細(xì)胞脂質(zhì)儲存過多和脂肪變性，不包括乙醇引起的代謝應(yīng)激和肝損傷及其他明確的肝細(xì)胞脂肪變性原因［1］。NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂肪酸的生成和氧化、自噬被認(rèn)為是NAFLD的關(guān)鍵因素之一［2］，因此減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保持脂質(zhì)代謝平衡，改善自噬是預(yù)防和治療NAFLD的重要策略［3］。

AMP 活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）被稱為能量平衡傳感器，是調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵分子［4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子 1（silencing information regulator transcription 1，SIRT1）被上游激酶如 AMPK 等直接激活后，可影響下游糖、蛋白質(zhì)、脂肪的合成與分解，維持 ATP 的動態(tài)平衡［5］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）參與線粒體的生物合成、葡萄糖利用和脂肪酸氧化等代謝過程［6］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target protein of rapamycin，mTOR）作為AMPK的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，對自噬過程具有負(fù)調(diào)控作用［7］。上述信號通路通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、脂肪酸氧化和脂吞噬等過程，減少脂質(zhì)沉積，從而改善NAFLD［8］。

芍藥苷（paeoniflorin，PF）是芍藥中的主要活性成分，具有保肝、抗炎、抗氧化、改善糖脂代謝等多種藥理作用［9］，但PF改善NAFLD的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立NAFLD體外模型，并選擇AMPK抑制劑Compound C作為工具藥，探討 PF 改善 NAFLD 的具體機(jī)制是否與 AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料 PF購自武漢天植生物技術(shù)有限公司，HepG2細(xì)胞購自普諾賽生命科技有限公司，PA購自上海阿拉丁生化科技有限公司，胎牛血清購自賽默飛世爾科技股份有限公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自上海阿拉丁生化科技有限公司。油紅O檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、ALT試劑盒、AST試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)基中，并在37 °C及5% CO 2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法測定細(xì)胞增殖 根據(jù)CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒的說明進(jìn)行操作。HepG2細(xì)胞（5×10 3 個/孔）接種在96孔板上，加入不同濃度的含PF和PA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育后測量吸光度。

1.4 PA 溶液的制備 0.030 72 g PA 加入 3 mL 濃度為0.1 m/L的NaOH溶液中，在70 ℃的水浴中充分溶解來制備40 mmol/L PA溶液；1.2 g BSA加入3 mL水中，離心至完全溶解來制備40% BSA溶液；取3 mL PA溶液在37 ℃水浴中滴加至 3 mL 40% BSA 溶液中，過濾除菌，得到20 mmol/L PA母液，將上述 PA母液加入培養(yǎng)基稀釋為濃度0.25 mmol/L，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞與實(shí)驗設(shè)計 細(xì)胞分為5組：正常組（CON組）使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組（MOD組）使用含有PA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，PF治療組（MOD+PF組）使用含有PA+PF的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型加抑制劑組（MOD+COM組）使用PA+Compound C的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型加抑制劑加 PF 組（MOD+COM+PF 組）使用含有 PA+Compound C+PF的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)［10］。PF濃度為25 μmol/L，PA濃度為250 μmol/L，Compound C濃度為10 μmol/L。Compound C是一種選擇性、ATP競爭性的AMPK抑制劑，在細(xì)胞實(shí)驗中被廣泛用于阻斷AMPK有關(guān)通路［11］。上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.6 HepG2細(xì)胞蛋白的提取和測定 棄去培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞。洗凈后加入裂解液、抑制劑等，冰浴裂解細(xì)胞。使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，然后用槍將刮下的細(xì)胞混懸液移至離心管中并反復(fù)吹打，于4 ℃離心。將離心后的上清分裝，置于?80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肂CA試劑盒，檢測各組OD值，根據(jù)說明書計算出各組蛋白的濃度。

1.7 HepG2 細(xì)胞中 TC、TG 的檢測 根據(jù)試劑盒說明書，按順序依次加入蒸餾水、校準(zhǔn)品、樣本和工作液?；靹?，37 ℃孵育10 min，波長500 nm，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，公式計算出HepG2細(xì)胞中TC、TG水平。

1.8 HepG2細(xì)胞中油紅O染色檢測 移除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗后，加油紅O固定液固定30 min。棄去固定液，用蒸餾水洗2次，加入60%異丙醇浸洗30 s。棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液，浸染10～20 min。棄去染色液，60%異丙醇漂洗30 s后，水洗3次，加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染細(xì)胞核1～2 min。棄去染液后水洗3次，加入油紅O緩沖液孵育1 min，棄去。加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。

1.9 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST的檢測 根據(jù)說明書加入ALT基質(zhì)液、2，4-二硝基苯肼鹽酸溶液、NaOH溶液，用多功能微孔板讀數(shù)儀檢測OD值，根據(jù)說明書提供的計算公式計算出ALT、AST的水平。

1.10 HepG2細(xì)胞中 SOD、MDA、CAT、GSH 的檢測 根據(jù)試劑盒說明書，用制備好的細(xì)胞勻漿檢測SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。

1.11 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的檢測 準(zhǔn)備所需試劑和樣本，加入洗液靜置浸泡酶標(biāo)板。棄掉洗液之后拍干，立即根據(jù)試劑盒說明書加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和檢測抗體。封板膜封板，振蕩，室溫孵育，棄液洗滌。每孔添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，再次封板，室溫震蕩孵育，再次洗滌。添加顯色底物，室溫避光孵育20 min后，添加終止液。酶標(biāo)儀測定OD值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對應(yīng)TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平。

1.12 HepG2 細(xì)胞中蛋白表達(dá)的檢測 在細(xì)胞中添加RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑對細(xì)胞進(jìn)行裂解。離心后，提取上清液以制備蛋白質(zhì)樣品。樣品加入凝膠進(jìn)行電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用 5%脫脂奶粉封閉后，將 PVDF膜與以下抗體孵育，4 ℃過夜：p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin-1、P62和GAPDH。清洗一抗后，將膜與相應(yīng)的二抗孵育，曝光。使用Vision Capt軟件對獲得的條帶進(jìn)行分析。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法 所得計量數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 10和Vision Capt等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖像處理，結(jié)果以x ˉ ±s表示。計量資料組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey’s檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PF和PA對HepG2細(xì)胞活性的影響 如圖1所示，濃度范圍0～25 μmol/L的PF不會顯著抑制細(xì)胞活力；濃度在250 μmol/L的PA明顯抑制了50%的細(xì)胞活力（Plt;0.05）。因此，在后續(xù)實(shí)驗中，使用PF濃度為25 μmol/L、PA濃度為250 μmol/L作用于細(xì)胞。

2.2 PF對PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中TC、TG的影響 如圖2所示，與CON組相比，MOD組TC、TG水平明顯升高（P 值均lt;0.05）。PF 治療后，MOD+PF 組 TC、TG 水平明顯低于 MOD 組（P 值均lt;0.05）。給予 Compound C 后，MOD+COM組和MOD+COM+PF組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明PF的改善脂代謝作用被抑制。

2.3 PF對 PA誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中肝功能指標(biāo)的影響 如圖3所示，與CON組相比，MOD組ALT、AST水平均顯著升高（P值均lt;0.05）。PF治療后，MOD+PF組ALT、AST水平明顯低于 MOD 組（P值均lt;0.05）。MOD+COM組和MOD+COM+PF組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明PF的肝保護(hù)作用被抑制（P值均gt;0.05）。

2.4 PF對PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性細(xì)胞因子的影響 如圖4所示，與CON組相比，MOD組TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平顯著升高（P值均lt;0.05）。PF治療后，MOD+PF 組 TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平顯著低于MOD 組（P 值均lt;0.05）。給予 Compound C 后，MOD+COM組和MOD+COM+PF組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明PF的抗炎作用被抑制。

2.5 PF對 PA誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 如圖5所示，與CON組相比，MOD組中SOD、CAT活性及 GSH 水平明顯降低，MDA 水平顯著增加（P值均lt;0.05）。PF治療后，MOD+PF組SOD、CAT活性及GSH水平增加，MDA水平降低（P值均lt;0.05）。給予Compound C后，MOD+COM組和MOD+COM+PF組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明PF的抗氧化作用被抑制。

2.6 PF 對 PA 誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的影響如圖6所示，與CON組相比，MOD組細(xì)胞中脂滴被大面積紅染。PF治療后，MOD+PF組的紅染面積明顯減少，表明PF改善了脂質(zhì)沉積。給予Compound C后，PF的減輕脂質(zhì)沉積作用被抑制。

2.7 PF對PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中AMPK/SIRT1/PGC-1α通路的影響 如圖7所示，與CON組相比，MOD組中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α表達(dá)量顯著降低（P值均lt;0.05）。PF治療后，MOD+PF組p-AMPK、SIRT1、PGC-1α表達(dá)量顯著高于MOD組（P值均lt;0.05）。給予Compound C后，MOD+COM組和MOD+COM+PF組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明PF激活A(yù)MPK改善脂質(zhì)沉積的作用被抑制。

2.8 PF 對 PA 誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞中 AMPK/mTOR/LC3/P62/Beclin-1 通路的影響 如圖 8 所示，與 CON 組相比，MOD組p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達(dá)降低，p-mTOR、P62表達(dá)顯著升高（P值均lt;0.05）。PF治療后，MOD+PF組p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達(dá)顯著升高，p-mTOR、P62表達(dá)顯著降低（P值均lt;0.05）。給予Compound C后，MOD+COM 組和 MOD+COM+PF 組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明PF激活A(yù)MPK，改善自噬的作用被抑制。

3 討論

NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能由多種因素引起，包括肝臟中攝取過多的游離脂肪酸、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬受損和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［12］。有研究顯示，肝內(nèi)脂質(zhì)沉積可誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，線粒體功能障礙，從而加劇肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥，導(dǎo)致NAFLD發(fā)生發(fā)展［13］。PA是一種飽和脂肪酸，通常用于建立細(xì)胞脂肪變性模型，HepG2細(xì)胞經(jīng)PA處理后，表現(xiàn)出過度的脂質(zhì)積聚，這是肝細(xì)胞脂肪變性的特征［14］。本研究結(jié)果表明，250 μmol/L的PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞后出現(xiàn)TC、TG水平的增加，油紅O染色顯示大量紅染脂滴，肝細(xì)胞炎性因子指標(biāo)TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP上調(diào)，以及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA上調(diào)，SOD、CAT、GSH下調(diào)，成功建立了NAFLD細(xì)胞脂肪變性模型。

白芍具有柔肝止痛、平抑肝陽等作用，臨床常用來治療NAFLD，PF作為其主要化學(xué)成分，具有保肝、抗炎、抗氧化、改善糖脂代謝等多種藥理作用［9］。本研究結(jié)果顯示，在給予PF治療后，PF下調(diào)了細(xì)胞ALT和AST活性，降低了TC、TG、TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平，下調(diào)了MDA水平，上調(diào)了SOD、CAT活性及GSH水平，這表明PF可以改善PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積，減輕炎癥，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞。

AMPK是一種結(jié)構(gòu)為異源三聚體的蛋白激酶，是機(jī)體維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡、調(diào)控全身能量代謝的一種關(guān)鍵分子，并在體內(nèi)AMP/ATP比例升高時被激活。研究表明，AMPK通過磷酸化Thr172位點(diǎn)被激活，從而減輕NAFLD肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等［15-16］。SIRT1是一種依賴于NAD + 的去乙酰化酶，可促使多種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?，促進(jìn)體內(nèi)脂類物質(zhì)的動員［17］。PGC-1α廣泛存在于富含線粒體的組織，通過激活脂肪酸β氧化、線粒體呼吸關(guān)鍵酶等參與脂代謝，改善NAFLD［18］。研究顯示，AMPK可增強(qiáng)SIRT1和PGC-1α活性，從而調(diào)控線粒體的生物合成和能量代謝，促進(jìn)脂肪酸的氧化，減少肝脂質(zhì)沉積，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到改善NAFLD的作用［19］。本研究結(jié)果顯示，PF通過激活A(yù)MPK通路與SIRT1，上調(diào)PGC-1α，改善了細(xì)胞脂質(zhì)沉積，減輕了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞自噬參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，同時也是代謝性疾病作用的靶點(diǎn)之一［20-21］。AMPK/mTOR 通路是與細(xì)胞自噬有關(guān)的重要信號通路［22］。AMPK是激活自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，可抑制 mTOR 活性，增強(qiáng)自噬［23］。LC3Ⅱ作為一個銜接蛋白，與P62自噬蛋白相互作用，允許自噬小體吞噬底物；Beclin-1是自噬蛋白磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物的組成部分，參與調(diào)控自噬體的形成［24］。經(jīng) PF 治療后，p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 表達(dá)升高，p-mTOR、P62表達(dá)顯著降低，表明PF可以改善PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬。

Compound C是與ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭的選擇性小分子AMPK抑制劑，在細(xì)胞實(shí)驗中被廣泛用作阻斷與AMPK有關(guān)通路的抑制劑［11］。研究表明，AMPK通路被阻斷可影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá)［25］。在本實(shí)驗中，HepG2細(xì)胞經(jīng)Compound C與PA聯(lián)合處理后，AMPK相關(guān)通路并未被激活，自噬、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和脂代謝未被改善。HepG2細(xì)胞經(jīng)PA和PF聯(lián)合處理后，AMPK相關(guān)信號通路被激活，上述指標(biāo)明顯改善，進(jìn)一步表明PF通過AMPK通路來發(fā)揮相關(guān)作用。

綜上，PF可以改善 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)沉積和自噬等，具體機(jī)制可能與調(diào)控 AMPK/SIRT1/PGC-1α/mTOR信號通路有關(guān)。本研究從體外實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)PF改善NAFLD療效及機(jī)制，為NAFLD的新藥開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗依據(jù)。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉彤負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；李善政、周鋮參與收集數(shù)據(jù)，修改論文，統(tǒng)計分析；劉素彤、張麗慧負(fù)責(zé)論文修改，統(tǒng)計分析；趙文霞負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-07-08；錄用日期：2024-07-29

本文編輯：王亞南

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