賴新生 王 黎等

賴新生 王 黎 江雪華 陳振虎 曾 強

(廣州中醫(yī)藥大學,廣東510407)

摘 要 采用4-血管阻斷模型,用Morri水迷宮測定大鼠學習記憶能力,并檢測大鼠腦組織內(nèi)SOD酶活性及MDA含量。結果電針及尼莫同治療組能顯著縮短定位航行試驗的潛伏期;在空間探索試驗中,在原平臺象限跨越平臺次數(shù)顯著多于其余象限,與正常組無顯著差異;大鼠腦組織內(nèi)SOD酶活性上升,MDA含量明顯降低。提示電針能改善VD模型大鼠的學習記憶能力,并能增強機體清除自由基的能力,對阻止自由基對腦組織的進一步損害有積極意義。

主題詞 電針 癡呆,血管性/針灸療法 學習障礙/針灸療法 記憶障礙/針灸療法 超氧化物歧化酶/代謝 丙二醛/分析血管性癡呆(VascularDementia,VD)是我國最常見的老年期癡呆類型,系由腦血管因素引起的腦循環(huán)障礙、腦組織受損導致的一種認知功能缺損的綜合征。由于癡呆造成病人記憶、認知等方面的障礙,不僅影響病人的生活質(zhì)量,而且造成巨大的社會和家庭負擔,本病成為當今醫(yī)學緊迫攻關的課題之一。在對血管性癡呆的發(fā)病機制尚未完全搞清、臨床缺乏理想藥物的情況下,針灸對VD的智能及社會活動功能康復有積極作用,其療效肯定,但有關機理方面的實驗研究尚缺乏[1],我們采用4-血管阻斷(4-Vesselocclusion,4-VO)全腦缺血模型,模擬臨床上VD的發(fā)病特點,建立近似人類學習記憶障礙的大鼠VD模型,觀察電針對模型大鼠學習記憶能力、腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的影響,旨在探討針刺治療血管性癡呆學習記憶功能障礙的機理。

1 材料1.1 動物及分組成年健康雄性SD大鼠40只,體重200～250g,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心提供。按體重隨機分為正常組、電針組、西藥組和模型組,每組各10只。

1.2 儀器Morris水迷宮,722分光光度計(上海第二分析儀器廠產(chǎn)品),G8605電針儀(上海)。

1.3 藥品及試劑尼莫同(由德國拜耳公司提供,批號:CAGFT3)、SOD、MDA、總蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)。

2 方法2.1 模型制作方法模型組、電針組、西藥組動物按4-血管阻斷(4-Vesselocclusion,4-VO)方法制作模型。用10%水合氯醛(0.6ml/100g體重)腹腔麻醉大鼠,背側頸正中切口,暴露雙側第一頸椎橫突翼小孔,用直徑0.5mm電凝針插入雙側翼小孔燒灼雙側椎動脈,造成永久性閉塞,24小時后腹側頸正中切口,分離雙側椎動脈,用微動脈夾可逆性夾閉頸總動脈5min,共夾閉3次,每次間隔1小時,常規(guī)飼養(yǎng)、觀察。正常組常規(guī)飼養(yǎng),未經(jīng)任何處理。

2.2 治療方法術后7天,刀口完全愈合,飲食正常,無肢體殘疾,開始給予治療。

(1)電針組 用28號1寸毫針,于模型大鼠頭部"百會"、"大椎"穴(取穴參照林文注等編著的《實驗針灸學》)捻入0.5寸,連接電針儀,該項目為廣東省自然科學基金資助項目(960548)

施以連續(xù)波,頻率150Hz,強度以大鼠安靜耐受為度(約2.0A),于每天電針1次,留針20min,連續(xù)治療10天。

(2)西藥組 大鼠給予尼莫同12mg/kg,按20ml/kg體重灌胃,每日1次,連續(xù)10天。

(3)正常組和模型組未予任何治療。

2.3 檢測方法(1)Morris水迷宮行為學檢測[2]水迷宮由直徑130cm、高50cm水池組成,水深30cm,水溫26±1℃。在水池壁標明4個入水點,由此將水池等分為4個象限,任一象限正中放置一個直徑12cm、高29cm無色透明的平臺,沒于水下1cm,水面覆蓋塑料泡沫,于術后第18天開始水迷宮試驗。程序包括(1)定位航行試驗(placetest),歷時6天,每天4次,將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中,記錄2min內(nèi)尋找平臺的時間(逃避潛伏期,es-capelatency);(2)空間探索試驗(spatialprobetest):定位航行試驗結束后撤除平臺,然后將鼠任選一入水點放入水中,測其2min內(nèi)跨原平臺及其余3個象限相應平臺位置的次數(shù)和大鼠在水迷宮外環(huán)停留時間。

(2)生化指標檢測水迷宮試驗結束后,大鼠脫椎法處死,迅速斷頭取腦用預冷的生理鹽水沖凈表面血液,以濾紙吸干,去除軟腦膜血管,取右腦稱重,以重量/體積(W/V)比1∶9加入冰生理鹽水,制成10%的勻漿,3000r/min離心15min,取上清液?；青堰恃趸阜ySOD活性,硫代巴比妥酸法測MDA含量,Lowry法測組織蛋白含量,嚴格按照試劑盒說明進行操作。

3 結果3.1 行為學檢測結果測試時大鼠飲食正常,體重恢復到原有水平,無肢體殘疾。

(1)定位航行試驗4組大鼠在歷時6天訓練中,尋找平臺的平均潛伏期變化(見圖1)。

如圖1所示,正常組、電針組和西藥組大鼠均隨著訓練次數(shù)增加,潛伏期越來越短。每組組內(nèi)潛伏期經(jīng)單因素方差分析,有非常顯著性意義(P<0.01)。這3組潛伏期一開始呈急速下降趨勢,隨后呈持續(xù)穩(wěn)定下降,正常組平均潛伏期為30.46s,電針組30.56s,西藥組32.46s。而模型組潛伏期雖有緩慢下降趨勢,但經(jīng)單因素方差分析相互無顯著差異(P>0.05),平均潛伏期69.67s。這表明模型組大鼠學習獲取能力較差。將4組大鼠平均潛伏期進行組間單因素方差分析,有非常顯著性差異(P<0.01),并做組間兩兩比較,結果顯示電針組大鼠平均潛伏期明顯短于模型組(P<0.01),而正常組和西藥組與電針組之間的差異無顯著性意義(P>0.05),這表明電針能夠改善模型大鼠的學習鞏固和再現(xiàn)能力。

(2)空間探索試驗撤除平臺,4組大鼠2min內(nèi)跨越原平臺及其余3個象限相應平臺位置次數(shù)(見圖2)。

如圖2所示,正常組大鼠在原平臺象限跨相應平臺次數(shù)為6.2次,其余R、O、L3個象限跨相應平臺次數(shù)分別為1.4,0.8,1.0;電針組大鼠在原平臺象限跨相應平臺次數(shù)為6次,其余R、O、L3個象限跨相應平臺次數(shù)分別為1.8,0,0.3;西藥組大鼠在原平臺象限跨相應平臺次數(shù)為5.5次,其余R、O、L3個象限跨相應平臺次數(shù)分別為1.3,0.8,0.5,3組在原平臺象限跨相應平臺次數(shù)明顯多于其余3個象限(P<0.01)。模型組在原平臺象限跨越相應平臺次數(shù)為1.5次,另外3個象限分別為1.2,0.7,0.3,4個象限無顯著差異(P>0.05)。將4組大鼠在原平臺象限跨越相應平臺次數(shù)做兩兩比較,電針組明顯多于模型組(P<0.01),與西藥組和正常組無顯著差異(P>0.05)。在水迷宮外環(huán)逗留時間正常組平均為40.3s,電針組為40.4s,西藥組為47.5s,模型組為75.8s,模型組逗留時間比其它3組明顯延長(P<0.05)。3.2 生化指標檢測 見表1表1 電針對腦組織內(nèi)SOD活性、MDA含量的影響(珔x±s)組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)正常組107.12±0.441.53±0.07車繒胱107.34±0.36△2.10±0.62△澄饕┳107.01±0.26△2.36±0.68△襯Ｐ妥105.71±0.603.69±0.79△與正常組比較,P>0.05;秤肽Ｐ妥楸冉,P<0.01如表1所示,與正常組相比,模型組SOD活性顯著降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01)。而電針組與正常組和西藥組比較無顯著差異(P>0.05),電針組與模型組比較,其SOD活性和MDA含量有非常顯著性差異(P<0.01)。

4 討論隨著社會的老齡化,血管性癡呆已成為日益嚴重的社會問題,目前尚未找到改變疾病進程的方法,但是國內(nèi)外學者一直在研究。在基礎研究中認為反復性腦缺血是VD的主要病因之一[3,4],而自由基是腦缺氧后神經(jīng)細胞損害的重要發(fā)病因素。自由基生成系統(tǒng)對學習記憶亦有明顯的損害作用,自由基對腦缺血的損傷是多方面的,無論是對急性期腦血管或腦實質(zhì)損傷,還是腦血管損傷后的繼發(fā)性損傷均起重要作用。它對智力的損害主要由于自由基對細胞及細胞膜上不飽和脂肪酸的破壞和過氧化及MDA產(chǎn)生。MDA是自由基對生物細胞膜損傷和主要代謝產(chǎn)物,它能交鏈蛋白質(zhì)、脂類、核酸及糖類,致使生物膜變性和破壞,由于DNA發(fā)生突變、交鏈等影響了信息傳遞、轉(zhuǎn)錄和復制,導致蛋白質(zhì)合成能力或合成蛋白質(zhì)功能紊亂,從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降。SOD是重要的金屬酶,為機體直接清除自由基的重要酶類,是機體防御新陳代謝及其他生命活動中氧自由基損傷和破壞的抗氧化酶[5]。其主要功能是將氧的單價還原產(chǎn)物O-2·歧化成H2O,以免它們分解形成強氧化活性的自由基重新對其它不飽和脂肪酸分子發(fā)生氧化作用,從而阻斷自由基損傷[6,7]。臨床報道表明[1],針灸治療VD的療效是肯定的,但是基礎理論和實驗方面的報道很少見。本實驗采取被廣泛應用的4-血管阻斷法(4-VO),引起全腦缺血,其中有再灌注損傷,和人類血管性癡呆的發(fā)病機理有很大的相似性。實驗結果亦表明,缺血再灌注損傷后,實驗動物出現(xiàn)明顯記憶障礙,大鼠腦組織的SOD活性明顯下降,MDA含量明顯增加。我們采取電針大鼠"百會"、"大椎"穴,檢測其學習記憶行為,結果表明,能縮短模型大鼠水迷宮潛伏期,能改善其記憶成績。通過對SOD活性和MDA含量的檢測,結果表明電針能增強癡呆大鼠腦內(nèi)SOD活性和降低MDA含量。"百會"和"大椎"均為督脈穴位,百會為"三陽五會",大椎為"諸陽之會",督脈與腦密切相關,督脈通于腦。病變在腦,首取督脈。電針2穴能疏通經(jīng)氣、通調(diào)督脈、醒腦開竅、益智復聰。實驗結果表明電針能明顯改善癡呆大鼠的學習記憶能力,對阻止自由基對腦組織的進一步損害有積極意義。

尼莫同是鈣通道阻滯劑,進入腦組織后能高度特異性地和海馬、皮質(zhì)的神經(jīng)元以及大腦內(nèi)參與學習和記憶區(qū)域的鈣通道受體結合。相互調(diào)節(jié)鈣離子流入神經(jīng)細胞,從而影響神經(jīng)元電學性質(zhì)及神經(jīng)介質(zhì)的平衡,同時也能通過鈣離子流向平滑肌細胞,調(diào)節(jié)血管張力,是近年來常用于治療VD的西藥。本動物實驗表明,電針和尼莫同對癡呆大鼠記憶障礙均有顯著改善作用,顯示出針刺治療VD的潛力,也向我們提示針刺治療VD可能與調(diào)節(jié)鈣離子有關,因此,可以設想針刺對VD的治療可能是多途徑、多環(huán)節(jié)、多效應的結果,其有關機理需待進一步深入研究。

5 參考文獻1 莫非智,賴新生.針灸治療血管性癡呆臨床研究概況.中國針灸,1998:18(6):5792 MorrisRGM.DevelopmentsofaWaterMazeProce-duceforStudying,SpatialLearningintheRat.JNeruosciMeth,1984;11:473 KawanoH,VedeK,HasuoY,PrevalenceofDementiaandEvaluationofItsClinicalDiagnosisDuring3-yeatFollow-upStudyinJapaneseCommunity.Stroke,1990;21:14 Corey-BloomJ,ThalLJ,Calaskod,etal.DiagnosisandEvaluationofDementiaNeurology,1995;45:2115 丁克祥.SOD臨床研究集.北京:原子能出版社,1992:16 霍淑芬,孫桂蓮,嚴超英.自由基與新生兒缺氧性腦病.中風與神經(jīng)疾病雜志,1995;12(2):797 梁勇.氧自由基與腦損傷和腦水腫.國外醫(yī)學.神經(jīng)病學神經(jīng)外科分冊,1995;22(20):81(收稿日期:1999-08-11,齊淑蘭發(fā)稿)