林召豐　王子龍　王志耕

摘要 以實(shí)驗(yàn)室保存的3株保加利亞乳桿菌和3株嗜熱鏈球菌制作酸奶，研究蛋白酶、β-半乳糖苷酶和酸度在酸奶冷藏過程中的變化規(guī)律和相關(guān)性。結(jié)果表明，在酸奶冷藏過程中，酸度值與蛋白酶活力總體呈上升趨勢，但蛋白酶活力變化不呈規(guī)律性，β-半乳糖苷酶活力總體呈下降趨勢。酸度與蛋白酶呈正相關(guān)，酸度與β-半乳糖苷酶呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 酸奶；酸度；β-半乳糖苷酶；蛋白酶

中圖分類號 TU252.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0212-02

酸奶是牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而制得的乳制品。保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）是酸奶生產(chǎn)中常用的發(fā)酵劑菌種[1-3]。不同的菌株之間產(chǎn)酸能力有所不同，產(chǎn)酸能力是酸奶生產(chǎn)用菌種篩選的重要考量指標(biāo)，一般以產(chǎn)酸能力中等，同時前產(chǎn)酸力較強(qiáng)，后產(chǎn)酸較弱為優(yōu)良菌種篩選標(biāo)準(zhǔn)。目前關(guān)于發(fā)酵菌的產(chǎn)酸特性、β-半乳糖苷酶的酶學(xué)特性的研究已有不少報(bào)道，但關(guān)于乳酸菌蛋白酶的研究工作開展不多，而酸乳冷藏過程中的產(chǎn)酸特性與β-半乳糖苷酶和蛋白酶關(guān)系的研究很少。筆者以實(shí)驗(yàn)室保存的6株乳酸菌制得的酸奶為基礎(chǔ)，研究酸度、β-半乳糖苷酶和蛋白酶在酸乳冷藏過程中的變化規(guī)律及相互關(guān)系，探討乳酸菌活動過程中的產(chǎn)酸機(jī)理，以期為酸乳生產(chǎn)試驗(yàn)和產(chǎn)品研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。供試菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏的保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus0602，S.thermophilus0606，S.thermophil us0607）。

1.1.2 培養(yǎng)基。牛奶培養(yǎng)基：10%脫脂奶粉于121℃加熱15min。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑。三氯乙酸（TCA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、鄰苯二甲醛（OPA）、β-巰基乙醇、硼酸鈉、甲醇、0.5%酚酞酒精指示劑、0.1moL/L NaOH、溶菌酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、ONP、ONPG。

1.2.2 主要儀器設(shè)備。Tu-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、HH-S型電熱恒溫水浴鍋（江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、BECKMAN型高速冷凍離心機(jī)（美國）、SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、恒溫培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）和KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸奶制備。以滅過菌的10%的脫脂牛奶為培養(yǎng)基，按3%接種量分別接入保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus0601，L.bulgaricus0602，L.bulgaricus0606）和嗜熱鏈球菌（S.thermophilus 0602，S.thermophilus0606，S.thermophilus0607）。按此方法制成的酸奶分別定為“酸乳L.b01”、“酸乳L.b02”、“酸乳L.b06”、“酸乳S.t02”、“酸乳S.t06”、“酸乳S.t07”。

1.3.2 酸度測定。采用酸堿滴定法。用標(biāo)定過的濃度為0.1 moL/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，求出酸度。同一樣品，至少連測3 次，取平均值[5]。

1.3.3 β-半乳糖苷酶的測定。將酸奶制品溶于冷的1% EDTA（pH值為12，4℃）溶液中（每1g酸奶溶于20mg EDTA），4℃、15 000rpm離心10min得菌體沉淀，將菌體細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0，0.1moL/L KH2PO4、5moL/L Mg SO4，0.1moL/L MnCl2）中，用0.2%的溶菌酶和凍融法進(jìn)行細(xì)胞破壁[6]。破壁之后將樣品離心，去除細(xì)胞殘骸和未破壁細(xì)胞，得到β-半乳糖苷酶液。采用ONPG為酶作用底物，生成有色產(chǎn)物ONP，通過比色法測定[7]。

1.3.4 蛋白酶的測定。用蛋白水解力（總游離氨基酸量）反映蛋白酶活力，蛋白水解力測定采用OPA試劑法[8]。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)方法。利用Excel軟件和SAS8.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的酸度變化

由表1可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶酸度值間存在差異，酸度值隨冷藏天數(shù)的增加呈上升趨勢。通過SAS的ANOVA過程對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，冷藏15d時，L.b06酸乳的酸度值高于S.t02、S.t06、S.t07、L.b01、L.b02酸乳的酸度值。但在冷藏至11d時發(fā)生了后酸化現(xiàn)象，S.t02、S.t06的產(chǎn)酸能力處于中等水平，后期產(chǎn)酸比較緩慢，未發(fā)生后酸化現(xiàn)象，適宜做優(yōu)良的產(chǎn)酸發(fā)酵劑。

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中β-半乳糖苷酶活力變化

由表2可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值間存在差異，β-半乳糖苷酶值隨冷藏天數(shù)的增加總體呈下降趨勢，并且β-半乳糖苷酶在冷藏過程中的活力比較小，除酸乳S.t02、S.t06、L.b01在開始有所上升隨后呈下降趨勢外，其他酸乳均呈下降趨勢。通過SAS的ANOVA過程對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，冷藏到15d時，酸乳S.t02、S.t06產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值明顯高于酸乳S.t07、L.b06、L.b01、L.b02產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶值。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的蛋白酶活力變化

由表3可見，不同乳酸菌種發(fā)酵的酸奶產(chǎn)生的蛋白酶值間存在差異，蛋白酶值隨冷藏天數(shù)的增加總體呈上升趨勢，但變化并不呈一定的規(guī)律性。通過SAS的ANOVA過程對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，冷藏到15d時，酸乳S.t02產(chǎn)生的蛋白酶值明顯高于酸乳S.t06、S.t07、L.b06、L.b01、L.b02產(chǎn)生的蛋白酶值，S.t06產(chǎn)生的蛋白酶值高于酸乳S.t07、L.b01產(chǎn)生的蛋白酶值。

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的酸度與β-半乳糖苷酶和蛋白酶活力的相關(guān)性

從表4可見，冷藏到15d時，酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈負(fù)相關(guān)，酸度值與蛋白酶活力呈正相關(guān)。其中S.t02的酸度值與蛋白酶活力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），S.t07的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），S.t07的酸度值與蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），L.b06的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），L.b02的酸度值與β-半乳糖苷酶活力呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。綜合分析可見，由保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸乳在冷藏過程中的酸度值與β-半乳糖苷酶活力的相關(guān)性大，由嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸乳在冷藏過程中的酸度值與蛋白酶活力的相關(guān)性大。

3 結(jié)論與討論

（1）酸奶的風(fēng)味很大程度上取決于酸度，因此研究酸奶中乳酸菌在冷藏過程中的產(chǎn)酸能力對酸奶發(fā)酵劑菌種的選擇具有重要意義。適度的蛋白水解可改善制品風(fēng)味和品質(zhì)，特別是乳酸菌蛋白水解和菌體破裂釋放的酶對酸奶成熟發(fā)揮著重要作用。β-半乳糖苷酶活性高低，對外表現(xiàn)為能不能有效地利用乳糖，它可以將乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，之后單糖被分解代謝，在乳糖代謝中起著重要作用。

（2）乳酸菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等，其中乳酸是乳酸菌將乳中的乳糖分解而得到的，是酸乳酸度的主要來源。而乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶分解所產(chǎn)生的乳酸，反過來又抑制β-半乳糖苷酶的活性，使其活性下降，并且乳酸對不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的β-半乳糖苷酶活力抑制程度不同，這使不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶在冷藏過程中的β-半乳糖苷酶活性大小不同，并且下降幅度存在差異。但在冷藏到15d時，β-半乳糖苷酶活力還有進(jìn)一步下降的可能，此時的乳酸度還不足以抑制β-半乳糖苷酶的活性。由上述分析可知，β-半乳糖苷酶可作為酸奶冷藏過程中的關(guān)鍵酶。

（3）S.t02的蛋白酶活力從一開始就居高不下，變化卻不呈一定規(guī)律性，這一點(diǎn)可以反映出S.t02具有較高的蛋白酶活力，開始的變化幅度比較小，可能原因是乳酸菌的生長攝取了自身酶分解蛋白質(zhì)釋放的游離氨基酸。

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